王海利，韓曉群，付南燕，楊婧，周智興，鄧琴，趙曉杰，劉冬梅

1宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春 336000；2宜春學(xué)院醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)免疫與微生物學(xué)教研室，江西宜春336000

結(jié)核病是全球性的公共衛(wèi)生問題，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是引起該病的主要病原體。MTB感染后，宿主免疫系統(tǒng)具有清除及殺滅MTB的能力，但MTB亦能通過一系列機(jī)制逃避宿主的免疫反應(yīng)，成為重要的胞內(nèi)感染細(xì)菌。MTB逃避宿主免疫防御的能力以及機(jī)體所表現(xiàn)的活動(dòng)與潛伏交替的疾病狀態(tài)，對(duì)抗結(jié)核藥物的研發(fā)提出了挑戰(zhàn)[1]。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)是一種可由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，在胞內(nèi)感染的免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是MTB逃避宿主免疫防御、建立慢性感染的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[2]。有研究報(bào)道，在MTB感染巨噬細(xì)胞過程中，PPARγ活化能抑制核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號(hào)通路及炎性因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)的表達(dá)[3]。本課題組前期研究證實(shí)，結(jié)核病患者外周血單核細(xì)胞中PPARγ的表達(dá)與TNF-α、IL-6呈正相關(guān)[4]，提示PPARγ在結(jié)核病的發(fā)病過程中具有炎性調(diào)控作用，但PPARγ是否影響小鼠肺組織激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)的表達(dá)進(jìn)而影響MTB感染后的炎癥反應(yīng)目前尚未見報(bào)道。轉(zhuǎn)錄因子AP-1是由Jun蛋白與Fos蛋白家族組成的異二聚體，如c-Jun/c-Fos，而c-Jun被公認(rèn)為AP-1復(fù)合物的中心亞基，是炎癥狀態(tài)下最重要的轉(zhuǎn)錄激活因子。本研究探討激活PPARγ對(duì)MTB感染小鼠肺組織c-Jun/AP-1表達(dá)及炎癥反應(yīng)的影響，以期為結(jié)核病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，2×SYBR Green RT-qPCR Master Mix購(gòu)自中國(guó)上海欣百諾公司，T R Izo l 試劑購(gòu)自美國(guó)Sig ma 公司，099C A4224氣溶膠感染裝置購(gòu)自美國(guó)Glas-Co l 公司，m R N A-c D N A 提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司。PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮(rosiglitazone，ROZ)及拮抗劑GW9662購(gòu)自北京白奧萊博科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及菌株 6～8周齡SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠50只，體重18～20 g，購(gòu)自三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(鄂)2017-0012]。將小鼠飼養(yǎng)在恒溫恒濕、12 h明暗交替的環(huán)境中，給予無菌食物及無菌水。MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(菌號(hào)：93009)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。動(dòng)物在感染前1周進(jìn)入武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(ABSL-Ⅲ實(shí)驗(yàn)室)。本實(shí)驗(yàn)獲得武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2017077)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌培養(yǎng) 將H37Rv菌株接種于改良羅氏斜面培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的優(yōu)良菌落，用勻漿器研磨使其呈均勻細(xì)顆粒狀，加入培養(yǎng)液，置于-80 ℃低溫冰箱內(nèi)備用。該實(shí)驗(yàn)在生物安全Ⅲ級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) 將50只小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，每組10只。(1)對(duì)照組：將小鼠放于霧化裝置中，每天用5 ml含0.05% Tween 80的生理鹽水霧化吸入90 min；(2)MTB組：每天用5 ml含有MTB量為1×106CFU的0.05% Tween 80生理鹽水霧化吸入90 min[5]；(3)MTB+羅格列酮組：實(shí)驗(yàn)前3d，每天給予4 mg/kg羅格列酮灌胃，以后每天按照MTB組的方法霧化吸入聯(lián)合4 mg/kg羅格列酮灌胃；(4)MTB+GW9662組：霧化吸入MTB后1 h，給予腹腔內(nèi)注射GW9662，劑量為4 mg/kg，以后每天按4 mg/kg劑量給予GW9662腹腔注射；(5)MTB+羅格列酮+GW9662組：按上述MTB+羅格列酮組的方法處理小鼠，每天給予腹腔內(nèi)注射4 mg/kg GW9662。

各組小鼠飼養(yǎng)6周，禁食12 h后處死。沿前正中線剪開胸膜，收集小鼠肺組織，一部分勻漿處理后取上清液用于ELISA檢測(cè)，一部分用于荷菌量檢測(cè)及肺組織病理學(xué)觀察，剩余部分迅速放入-80 ℃冰箱保存，備Western blotting檢測(cè)。

1.3.3 肺組織荷菌量檢測(cè) 嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，取每只小鼠的0.04 g肺組織，充分漂洗后加入1 ml生理鹽水，使用組織勻漿器研磨制備組織懸液。按照文獻(xiàn)[6-7]中的方法檢測(cè)肺組織荷菌量。

1.3.4 RT-qPCR檢測(cè)PPARγ及AP-1基因表達(dá)水平

取新鮮冰凍肺組織，勻漿處理，用TRIzol試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照說明書進(jìn)行檢測(cè)，引物序列見表1。以β-actin為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計(jì)算PPARγ及AP-1的基因表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences of real-time qPCR

1.3.5 Western blotting檢測(cè)PPARγ及AP-1蛋白表達(dá)水平 取凍存的肺組織，勻漿處理，采用RIPA裂解緩沖液提取蛋白，BCA法蛋白定量。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入含一抗(1:100稀釋)的孵育液，過夜后洗滌，再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1:1000稀釋)，孵育后再次洗滌。蛋白條帶在化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)下顯影，以β-actin為內(nèi)參照，結(jié)果采用凝膠圖像分析軟件BandScan進(jìn)行分析。

1.3.6 ELISA法檢測(cè)肺組織炎性細(xì)胞因子含量 將肺組織勻漿處理后取上清液，使用IL-6、TNF-α及IL-10 ELISA檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量其光密度(OD)值。根據(jù)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算TNF-α、IL-10及IL-6的含量。

1.3.7 肺組織病理學(xué)觀察 將小鼠肺組織用甲醛固定后，石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肺組織荷菌量比較 各組小鼠肺組織荷菌量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。與MTB組比較，MTB+羅格列酮組及MTB+羅格列酮+GW9662組荷菌量升高，MTB+GW9662組荷菌量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與MTB+羅格列酮組比較，MTB+羅格列酮+GW9662組荷菌量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖1)。

圖1 各組小鼠肺組織結(jié)核分枝桿菌荷菌量比較Fig.1 Comparison of MTB bacterial load in lung tissue of mice in each group

2.2 各組小鼠肺組織PPARγ表達(dá)水平比較 各組小鼠肺組織PPARγ表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。MTB組、MTB+羅格列酮組、MTB+GW9662組及MTB+羅格列酮+GW9662組肺組織PPARγ表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；MTB+羅格列酮組PPARγ表達(dá)水平高于MTB組，MTB+GW9662組則低于MTB組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；MTB+羅格列酮+GW9662組PPARγ表達(dá)水平低于MTB+羅格列酮組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

圖2 各組小鼠肺組織PPARγ表達(dá)水平比較Fig.2 Comparison of PPARγ expression levels in lung tissue of mice in each group

2.3 各組小鼠肺組織A P-1 表達(dá)水平比較 各組小鼠肺組織AP-1表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。與對(duì)照組比較，MTB組、MTB+羅格列酮組、MTB+GW9662組及MTB+羅格列酮+GW9662組肺組織AP-1表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；MTB+羅格列酮組AP-1 mRNA表達(dá)水平低于MTB組，MTB+GW9662組則高于MTB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

圖3 各組小鼠肺組織AP-1表達(dá)水平比較Fig.3 Comparison of AP-1 expression levels in lung tissue of mice in each group

2.4 各組小鼠肺組織炎性細(xì)胞因子含量比較各組小鼠肺組織細(xì)胞因子含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。與對(duì)照組比較，MTB組、MTB+羅格列酮組、MTB+GW9662組、MTB+羅格列酮組+GW9662組肺組織IL-6、IL-10、TNF-α水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；其中MTB+羅格列酮組IL-6、TNF-α含量分別為(160.71±20.36) pg/ml、(343.55±58.48) pg/ml，低于MTB組[分別為(232.59±21.73) pg/ml和(511.99±69.83) pg/ml]，但M T B+羅格列酮組的I L-1 0 含量高于M T B 組[(105.97±10.38) pg/mlvs. (83.25±9.00) pg/ml]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

圖4 各組小鼠肺組織炎性細(xì)胞因子含量比較Fig.4 Comparison the content of inflammatory cytokines in lung tissue of mice in each group

2.5 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化 與對(duì)照組比較，MTB組小鼠肺組織鏡下可見肺泡壁增厚、肺泡腔狹窄及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與MTB組比較，MTB+羅格列酮組肺泡塌陷，且部分肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)粉紅色滲出液，提示肺組織損傷更為嚴(yán)重。與MTB+羅格列酮組比較，MTB+GW9662組及MTB+羅格列酮+GW9662組肺組織病變明顯減輕(圖5)。

圖5 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化Fig.5 Pathological changes of lung tissue of mice in each group

3 討 論

肺泡巨噬細(xì)胞是抵御MTB感染的第一道防線[8]。研究表明，MTB感染能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞PPARγ表達(dá)，影響巨噬細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)感染MTB的殺傷活性[9-10]。本研究結(jié)果顯示，MTB感染小鼠肺組織PPARγ表達(dá)增加，證實(shí)了PPARγ與MTB感染存在一定的關(guān)系。

PPARγ在肺部炎癥、急性感染性疾病及感染后組織穩(wěn)態(tài)恢復(fù)等過程中起重要作用，是肺部炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[11]。PPARγ可通過調(diào)控多條信號(hào)傳導(dǎo)通路影響下游效應(yīng)分子及炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，從而保護(hù)宿主細(xì)胞免受MTB感染[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，PPARγ缺失型小鼠感染MTB后，其肺泡巨噬細(xì)胞中TNF-α及IL-6分泌明顯增加，而IL-10分泌減少[9]。PPARγ配體亦可抑制鼠單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α及IL-6[14]。羅格列酮是人工合成的PPARγ高選擇性強(qiáng)效激動(dòng)劑，其與PPARγ特異性結(jié)合后，通過調(diào)節(jié)下游靶基因而在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用[15]。GW9662作為一種高效且不可逆的選擇性PPARγ拮抗劑，可抑制羅格列酮介導(dǎo)的PPARγ活性[16]。本研究結(jié)果顯示，在MTB感染的同時(shí)給予PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮，小鼠肺組織IL-6、TNF-α含量較單純MTB感染組明顯下降，而IL-10含量明顯增加。GW9662部分逆轉(zhuǎn)了羅格列酮所致炎性細(xì)胞因子的變化，表明激活PPARγ能夠抑制MTB感染小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)，而拮抗PPARγ活性則作用相反，提示PPARγ可通過調(diào)控促炎/抗炎平衡而參與宿主的免疫調(diào)節(jié)。

轉(zhuǎn)錄因子AP-1是由Jun蛋白家族成員如c-Jun、JunB、JunD與Fos蛋白家族成員如c-Fos、FosB、Fos相關(guān)抗原1(Fra1)、Fra-2組成的二聚體。Zhang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，抗結(jié)核藥物異煙肼能通過激活PPARγ而抑制AP-1的轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮其抗炎作用。c-Jun被公認(rèn)為AP-1復(fù)合物的中心亞基，是炎癥狀態(tài)下最重要的轉(zhuǎn)錄激活因子[18]。

為探討AP-1是否參與了MTB感染的炎癥反應(yīng)及PPARγ活化對(duì)AP-1表達(dá)的影響，本研究對(duì)MTB感染小鼠肺組織c-Jun/AP-1的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，MTB感染明顯降低了小鼠肺組織c-Jun/AP-1的表達(dá)，PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮增強(qiáng)了MTB感染所致AP-1表達(dá)的下降，而拮抗劑GW9662作用相反，表明MTB感染小鼠肺組織c-Jun/AP-1表達(dá)受PPARγ的負(fù)向調(diào)控。已有研究證實(shí)，c-Jun蛋白可通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞中促炎基因的轉(zhuǎn)錄從而增加促炎細(xì)胞因子的表達(dá)[19-20]?？梢娫贛TB的感染過程中，PPARγ活化可通過下調(diào)c-Jun/AP-1的表達(dá)而影響肺組織的炎癥反應(yīng)，但并不排除PPARγ介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)還與NF-κB、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白-1等途徑有關(guān)。

有研究報(bào)道，促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6在巨噬細(xì)胞活化及胞內(nèi)病原體清除等方面發(fā)揮重要作用，是宿主對(duì)MTB感染發(fā)生免疫應(yīng)答的重要調(diào)節(jié)因子[21-22]，而抗炎細(xì)胞因子IL-10則通過抑制吞噬體成熟及減少活性氧的產(chǎn)生而降低宿主對(duì)MTB的控制[23]。一項(xiàng)對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物的研究表明，在MTB急性感染期間，機(jī)體炎癥水平下降可導(dǎo)致細(xì)菌負(fù)荷增加[24]。本研究結(jié)果顯示，隨著IL-6、TNF-α含量降低和IL-10含量升高，肺組織荷菌量增加，反之亦然，表明MTB感染后，激活PPARγ可調(diào)控促炎及抑炎細(xì)胞因子表達(dá)，誘導(dǎo)較低水平的炎癥反應(yīng)，降低機(jī)體對(duì)MTB的清除及殺傷能力，在宿主體內(nèi)為MTB營(yíng)造了一個(gè)良好的生存環(huán)境。

MTB的持續(xù)復(fù)制以及機(jī)體炎癥反應(yīng)與免疫環(huán)境的重建是導(dǎo)致小鼠肺組織損傷的主要原因[25]。從本研究結(jié)果可以看出，在MTB感染過程中，激活PPARγ可導(dǎo)致小鼠肺組織出現(xiàn)更嚴(yán)重的病理?yè)p傷，而這種損傷伴隨著促炎細(xì)胞因子水平下降、抗炎細(xì)胞因子水平升高及肺組織荷菌量的增加，提示PPARγ可能通過調(diào)控MTB感染中復(fù)雜的炎癥網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)功能紊亂，從而加劇肺組織的病理?yè)p傷。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，激活PPARγ能下調(diào)MTB感染小鼠肺組織AP-1的表達(dá)，進(jìn)而抑制肺組織炎癥反應(yīng)，影響機(jī)體對(duì)MTB的清除，提示PPARγ作為肺部炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，有望成為結(jié)核病防治的新靶標(biāo)。但是，機(jī)體的炎癥反應(yīng)是一把雙刃劍：一方面，炎癥反應(yīng)是機(jī)體免疫系統(tǒng)清除及殺滅MTB的重要機(jī)制；另一方面，炎癥反應(yīng)也對(duì)機(jī)體造成了一定的炎性損傷。如何合理干預(yù)PPARγ活性從而有利于輔助結(jié)核病的防治尚需進(jìn)一步研究。