董小艷，劉達越，徐靈博，顧鈴毓，馬勝超，楊安寧，楊勇，劉云，姜怡鄧*

1寧夏醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，銀川 750004；2國家衛(wèi)生健康委員會代謝性心血管疾病研究重點實驗室，銀川750004；3寧夏血管損傷與修復研究重點實驗室，銀川 750004；4寧夏醫(yī)科大學臨床醫(yī)學院，銀川 750004；5寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院核醫(yī)學科，銀川 750004；6寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院放射科，銀川 750004

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是一種含硫氨基酸，在多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用[1]。脂肪酸結(jié)合蛋白4(fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4)為脂肪酸結(jié)合蛋白家族的成員，是一種將脂質(zhì)代謝與炎癥緊密聯(lián)系起來的中間遞質(zhì)[2]，其作用體現(xiàn)在各種脂質(zhì)代謝[3]和心血管疾病如動脈粥樣硬化[4]中。研究發(fā)現(xiàn)，在毛細血管內(nèi)皮細胞和心外膜脂肪組織中FABP4的表達升高可抑制心肌細胞收縮，使心臟收縮和舒張功能下降，影響心室重構(gòu)，與心力衰竭和肥厚性心肌病等心臟疾病的產(chǎn)生和進展密切相關(guān)，是評估心臟疾病的一項潛在的獨立危險因素[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4過表達可引起心肌細胞損傷、肥大，而沉默F(xiàn)ABP4后可激活PI3K/AKT信號通路，改善心肌細胞損傷情況[6]。焦亡是由炎性小體觸發(fā)的炎癥顆粒NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)釋放到細胞外的細胞死亡。細胞焦亡為細胞炎性壞死，是一種程序性死亡，表現(xiàn)為細胞不斷脹大直至細胞膜破裂，其過程主要依靠炎性小體激活caspase家族的部分蛋白。有研究顯示，F(xiàn)ABP4可激活炎性小體NLRP3，而NLRP3與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)[7]。目前關(guān)于細胞焦亡對心血管疾病影響的研究主要集中于動脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷方面，而對其他疾病如心律失常、心力衰竭、心肌炎等的研究較少，其發(fā)病機制尚不完全明確。此外，抑制FABP4可預防心血管疾病的發(fā)展[8]，但FABP4調(diào)節(jié)心血管疾病的病理生理機制仍不明確。因此，本研究觀察了FABP4在Hcy誘導的大鼠心肌細胞焦亡中的作用，旨在為探討Hcy引起心肌細胞損傷的機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 恒溫CO2培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司，Hcy(優(yōu)級純，貨號：STBJ0903)購自德國Sigma公司，微量臺式離心機(5415D型)購自德國Eppendorf公司，細胞全蛋白提取試劑盒(貨號：P0013F)購自上海貝博生物技術(shù)有限公司，F(xiàn)ABP4引物購自廣州銳博生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：AJ90851A)、熒光定量PCR試劑盒(貨號：AJE1566A)購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，F(xiàn)ABP4(12802-1-AP)購自美國Proteintech公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，NLRP3(#10151)購自美國Cell Signaling Technology公司，caspase-1(AF5418)、IL-1β(AF5103)購自美國Affinity公司，BMS-309403(HY-101903)抑制劑購自美國MCE公司，內(nèi)參抗體β-actin(AC028)購自武漢ABclonal公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 復蘇心肌細胞(H9C2)，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基換液，當細胞密度增長到70%～80%時按實驗目的將細胞進行分組，繼續(xù)置于37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.2 Western blotting檢測FABP4和焦亡相關(guān)蛋白的表達 將細胞分為對照組(0 mmol/L Hcy)和Hcy組(3 mmol/L Hcy)[9]，分別處理24 h。采用總蛋白提取試劑盒提取心肌細胞總蛋白，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度，上樣30 μg，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳，100V 1.5 h后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃孵育兔抗鼠FABP4(1:1000)、兔抗鼠NLRP3抗體(1:500)、兔抗鼠caspase-1抗體(1:500)、兔抗鼠IL-1β抗體(1:500)過夜，第2天洗膜，加入HRP標記的山羊抗兔IgG(1:5000)，室溫孵育2 h，洗膜3次，加ECL混合溶液，曝光、顯影，以β-actin作為內(nèi)參，保存FABP4、NLRP3、caspase-1與IL-1β實驗結(jié)果用于后續(xù)統(tǒng)計。

1.2.3 qRT-PCR檢測心肌細胞中FABP4 mRNA的表達 細胞分組同1.2.2，根據(jù)RNA提取試劑盒提取心肌細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，條件為：37 ℃ 15 min、37 ℃ 5 s，4 ℃保存。通過熒光定量PCR儀進行擴增，擴增反應條件為：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。正向引物序列：3＇-TGTGCAGAAGTGGGATGGAAAGTC-5＇；反向引物序列：3＇-GCAGCATAACTCACCACCACCAG-5＇。反應結(jié)束后根據(jù)擴增曲線按照公式2-ΔΔCt計算FABP4的含量[ΔΔCt=(Ct待測樣品-CtGAPDH待測樣品)-(Ct校正樣品-CtGAPDH校正樣品)]。

1.2.4 激光共聚焦觀察焦亡相關(guān)蛋白的表達 為進一步證實Hcy使心肌細胞中焦亡相關(guān)蛋白表達升高，對心肌細胞中NLRP3、caspase-1進行雙染，對IL-1β進行單染，觀察心肌細胞中NLRP3、caspase-1的蛋白表達和共定位及IL-1β的表達情況，其中雙染時綠色代表NLRP3，紅色代表caspase-1，藍色代表細胞核，單染時紅色代表IL-1β，藍色代表細胞核。將心肌細胞接種于激光共聚焦小皿，待細胞密度達80%后，用3 mmol/L Hcy處理心肌細胞，將細胞分為對照組(0 mmol/L Hcy)和Hcy組(3 mmol/L Hcy)，24 h后棄去培養(yǎng)基，冷PBS清洗心肌細胞5 min；4%多聚甲醛固定30 min，10% H2O2作用10 min，PBS洗3次，每次5 min；山羊血清封閉1 h，4 ℃搖床過夜孵育一抗，第2天回收一抗，PBS 洗3次，每次5 min；室溫孵育二抗2 h，DAPI染色5 min，PBS洗3次；抗熒光淬滅劑封片，采集圖像并保存。

1.2.5 加入FABP4抑制劑(BMS-309403)后焦亡相關(guān)蛋白的表達情況 將細胞分為三組：對照組(0 mmol/L Hcy)、Hcy組(3 mmol/L Hcy)及Hcy+BMS-309403組(3 mmol/L Hcy和50 μmol/L BMS-309403)。培養(yǎng)心肌細胞至對數(shù)生長期，待細胞融合達60%～80%時，用2.1 ml DMSO溶解BMS-309403制備成5 mmol/L儲備液，分裝保存。在50 ml離心管中將0.25 ml儲備液加入25 ml配好的Hcy培養(yǎng)基，混勻，加入4 ml含抑制劑的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，24 h后取出用于實驗。Western blotting檢測FABP4和焦亡相關(guān)蛋白的表達，步驟同1.2.2。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用Prism 7.0軟件進行統(tǒng)計分析。測量結(jié)果均為計量資料，以表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細胞中NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白的表達情況 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，Hcy組NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05，圖1)。

圖1 Western blotting法檢測大鼠心肌細胞中NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白的表達(n=3)Fig.1 Protein expression of NLRP3 (A), caspase-1 (B) and IL-1β (C) in cardiomyocytes of rats (Western blotting, n=3)

2.2 心肌細胞中FABP4 mRNA和蛋白的表達情況分別采用qRT-PCR及Western blotting檢測心肌細胞中FABP4 mRNA和蛋白的表達，結(jié)果顯示，與對照組相比，Hcy組FABP4 mRNA和蛋白的表達水平均明顯升高(P＜0.05，圖2)。

圖2 兩組大鼠心肌細胞中FABP4蛋白(A)及mRNA(B)的表達情況(n=3)Fig.2 Expression of FABP4 protein (A) and mRNA (B) in cardiomyocytes of rats detected with Western blotting and qRT-PCR respectively (n=3)

2.3 大鼠心肌細胞中焦亡相關(guān)蛋白的表達 免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組比較，Hcy組心肌細胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達水平均明顯升高(圖3)。

圖3 免疫熒光檢測大鼠心肌細胞中NLRP3、caspase-1及IL-1β的表達情況(激光共聚焦顯微鏡，n=3)Fig.3 Immunofluorescence detection of the expression of NLRP3, caspase-1 and IL-1β in myocardial cells of rats (Laser scanning confocal microscope, n=3)

2.4 抑制FABP4后心肌細胞焦亡相關(guān)蛋白的表達情況 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，Hcy組及Hcy+BMS-309403組FABP4、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達明顯增加(P＜0.01或P＜0.05)；與Hc y組比較，Hc y+BMS-309403組FABP4、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)(圖4)。

圖4 BMS-309403對大鼠心肌細胞FABP4(A)、NLRP3(B)、caspase-1(C)和IL-1β(D)蛋白表達的影響(Western blotting, n=3)Fig.4 Effect of inhibitor (BMS-309403) on the protein expression of FABP4 (A), NLRP 3(B), caspase-1 (C) and IL-1β (D) in cardiomyocytes of rats (Western blotting, n=3)

3 討 論

Hcy是維持生命活動所必需的生物硫醇，在細胞內(nèi)具有氧化應激和維持細胞穩(wěn)態(tài)的作用[10]。Hcy為半胱氨酸的同系物，是一種非蛋白質(zhì)氨基酸，可作為多種疾病如心血管疾病、骨質(zhì)疏松癥、血栓形成和神經(jīng)精神疾病等的標志物[1]。既往研究表明，Hcy可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)途徑對內(nèi)皮細胞造成不可逆的損傷。也有研究表明，與無心力衰竭患者相比，慢性心力衰竭患者血中Hcy水平明顯升高，且隨患者病情加重而劇烈增加，可作為慢性心力衰竭診斷及心功能評價的依據(jù)[11]。Hcy水平升高不僅可誘導血管內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞損傷，也可直接損傷心肌細胞，但其具體機制仍不明確，因此，本研究探討了Hcy對心肌細胞焦亡的影響。

焦亡是一種通過caspase-1介導、以細胞質(zhì)膜破壞及細胞成分和促炎性介質(zhì)釋放至胞外為特征的細胞程序性死亡[12]。細胞焦亡由細胞損傷反應誘導，是依賴caspase-1活性的炎性程序性死亡。當caspase-1蛋白酶活化時，切割并激活特定的細胞靶點，包括消皮素D、促炎細胞因子白細胞介素(IL)-1β和IL-18。消皮素D的N端片段形成質(zhì)膜小孔，引起細胞質(zhì)的滲漏和細胞的破裂，釋放IL-1β和IL-18，使炎癥加劇。焦亡引起的過度炎癥反應可加重細胞損傷，除細胞凋亡、壞死和自噬之外，其在心肌缺血再灌注損傷中也起著至關(guān)重要的作用[13-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，在心肌梗死模型中心臟組織中caspase-1酶活性增加、梗死區(qū)域心肌細胞內(nèi)炎性小體組成成分含量升高，提示利用體外模型的炎性小體經(jīng)典激活方法可使心肌細胞caspase-1活化，從而誘導細胞焦亡的發(fā)生[15]。本研究發(fā)現(xiàn)Hcy處理后心肌細胞焦亡相關(guān)蛋白(NLRP3、caspase-1、IL-1β)表達明顯升高，提示Hcy可明顯促進心肌細胞焦亡的發(fā)生。

目前已在不同組織中發(fā)現(xiàn)了12種FABP，分別為脂肪細胞型(adipocyte-FABP，A-FABP)、心肌型(heart-FABP，H-FABP)、肝型(liver-FABP，L-FABP)等[16]。FABP4是冠心病穩(wěn)定患者冠狀動脈介入治療后復合心血管事件的獨立預測因子之一[17]。FABP4是脂質(zhì)代謝的中樞調(diào)節(jié)劑，它作為一種將脂質(zhì)代謝與炎癥聯(lián)系起來的遞質(zhì)而發(fā)揮作用。據(jù)報道，心包脂肪組織、脂肪細胞中的FABPs水平明顯升高，且與肥胖人群的心臟功能障礙相關(guān)[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4可通過調(diào)節(jié)環(huán)氧合酶2(COX2)和白三烯A4(LTA4)的活性來調(diào)節(jié)二十烷類化合物的平衡，最終影響巨噬細胞的功能[18]。也有研究發(fā)現(xiàn)，抑制FABP4可減少脂多糖誘導的NLRP3炎性小體激活及IL-17A產(chǎn)生[19]。沉默F(xiàn)ABP4可使脂多糖誘導的caspase-3和caspase-9活性明顯降低，并減少促炎細胞因子的釋放[20]。本研究結(jié)果顯示，Hcy干預后，心肌細胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3、caspase-1及IL-1β表達水平明顯升高，F(xiàn)ABP4表達水平也明顯升高。NLRP3是一種新的蛋白復合體，能適應大量的內(nèi)源性和外源性危險信號，誘導瞬時產(chǎn)生IL-18和IL-1β。NLRP3作為代謝紊亂的傳感器，可被FABP4激活，從而促進caspase-1、IL-1β的分泌[7]。本研究還發(fā)現(xiàn)，使用FABP4抑制劑BMS-309403后，心肌細胞中NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達水平明顯降低，提示FABP4表達降低可能會減少心肌細胞的焦亡，從而發(fā)揮心肌保護作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，抑制FABP4對心肌細胞具有保護作用。心肌細胞焦亡參與了多種心血管疾病的進程，為干預心血管疾病尋找可能的靶點提供了新思路。未來應進一步探討抑制FABP4減輕心肌細胞焦亡的具體機制。