黃子珊，符馨予，周希瑗

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院眼科/眼科學(xué)重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400010

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，R B)是嬰幼兒最常見(jiàn)的眼內(nèi)惡性腫瘤[1]，年發(fā)病率為1/18 000～1/16 000，可分為遺傳型(約45%)和非遺傳型(約55%)[2]，如果不及時(shí)治療可能導(dǎo)致失明或死亡。為實(shí)現(xiàn)RB的早診斷、早治療及降低病死率，尋找RB的關(guān)鍵基因尤為重要。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)分析目前已廣泛應(yīng)用于與腫瘤相關(guān)的高通量數(shù)據(jù)挖掘中[3-4]，該分析方法可尋找協(xié)同表達(dá)的基因模塊，探索基因模塊與關(guān)注的表型(如臨床數(shù)據(jù))之間的關(guān)系，構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)并尋找網(wǎng)絡(luò)中的核心基因，主要通過(guò)基因之間相關(guān)系數(shù)計(jì)算、基因模塊的確定、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)、模塊與性狀關(guān)聯(lián)4個(gè)步驟來(lái)尋找影響疾病的關(guān)鍵基因。本研究運(yùn)用多種生物信息學(xué)分析方法尋找與RB發(fā)生發(fā)展相關(guān)的關(guān)鍵基因，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)及免疫組化等多種方法對(duì)篩選出來(lái)的關(guān)鍵基因進(jìn)行驗(yàn)證，以進(jìn)一步尋找能夠用于早期診斷RB的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載及處理 從GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集GSE110811、GSE24673、GSE97508，3個(gè)芯片數(shù)據(jù)集共包含43例RB樣本和7例正常對(duì)照組織樣本。其中，GSE110811基于GPL16686平臺(tái)，包含28例RB和3例正常視網(wǎng)膜組織樣本(本研究排除了1例正常對(duì)照樣本GSM3017153，原因?yàn)樵摂?shù)據(jù)集樣本可能混有腫瘤組織[5])；GSE24673基于GPL6244平臺(tái)，包含9例RB和2例健康成人視網(wǎng)膜組織樣本；GSE97508基于GPL15207平臺(tái)，包含6例RB和3例正常視網(wǎng)膜組織樣本。

根據(jù)平臺(tái)注釋信息將陣列探針名轉(zhuǎn)換為匹配的基因名。采用perl軟件將這3個(gè)數(shù)據(jù)集合并，用R軟件的sva包消除3個(gè)數(shù)據(jù)集之間的批次效應(yīng)(樣品在不同時(shí)間、不同分組或由不同的人處理造成的差異)[6]。將3個(gè)數(shù)據(jù)集的矩陣數(shù)據(jù)合并為1個(gè)數(shù)據(jù)集，共包含43例RB和7例正常對(duì)照組織樣本。

1.2 篩選差異表達(dá)基因(differentially expressed gene，DEGs) 使用R語(yǔ)言的limma包分析合并數(shù)據(jù)集中RB與正常對(duì)照樣本之間的DEGs矩陣，篩選條件設(shè)置為|logFC|＞1，P＜0.05[7]。

1.3 GO(gene ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析 對(duì)DEGs進(jìn)一步分析，利用R語(yǔ)言clusterProfiler[8]包進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。校正后的P值(FDR)＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò) 將DEGs輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，以交互得分=0.9(最高置信度)作為閾值構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，然后導(dǎo)入Cytoscape(3.7.2版本)軟件中進(jìn)行可視化分析和整理，運(yùn)用cytoHubba插件以最大集團(tuán)拓?fù)浞治龇?maximal clique centrality，MCC)[9]選取關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的基因[10]。

1.5 WGCNA分析 提取GSE110811腫瘤組28個(gè)樣本對(duì)應(yīng)的DEGs矩陣進(jìn)行WGCNA分析，獲取該腫瘤樣本對(duì)應(yīng)的臨床信息。

1.5.1 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與模塊劃分 利用R軟件的WGCNA包[11]，計(jì)算各基因間的Pearson相關(guān)系數(shù)，選擇適當(dāng)?shù)能涢撝郸聵?gòu)建無(wú)尺度網(wǎng)絡(luò)；建立鄰接矩陣，轉(zhuǎn)換為TOM重疊矩陣；表達(dá)模式相似的基因分為一類，并構(gòu)成模塊；基于TOM矩陣，使用平均連鎖層次聚類方法來(lái)聚類基因，根據(jù)混合動(dòng)態(tài)切割樹(shù)的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置最小模塊，構(gòu)建加權(quán)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)以篩選hub基因[12]，以0.5作為加權(quán)共表達(dá)相關(guān)系數(shù)的閾值，導(dǎo)入Cytoscape(3.7.2版本)中進(jìn)行可視化分析，找到位于網(wǎng)絡(luò)中心的核心基因。

1.5.2 關(guān)鍵模塊篩選 將樣本的臨床信息與模塊基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，尋找顯著相關(guān)的模塊。本研究患者臨床信息包括：有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、有無(wú)繼發(fā)性腫瘤、RB1基因突變、單雙側(cè)眼患病、診斷年齡和隨訪時(shí)間等。采用Pearson相關(guān)系數(shù)評(píng)估模塊與臨床信息之間的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)越大表示該模塊與臨床數(shù)據(jù)相關(guān)程度越高，該模塊即為關(guān)鍵模塊，并計(jì)算各個(gè)基因與臨床信息的相關(guān)系數(shù)。

1.5.3 關(guān)鍵模塊基因GO和KEGG分析 使用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵模塊的基因行GO富集分析和KEGG通路分析(P＜0.05為顯著性基因富集的篩選條件)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)關(guān)鍵基因的表達(dá)量

1.6.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人RB細(xì)胞株(Y79、WERIRB-1)分別購(gòu)自上海佰曄生物科技中心和上海富衡生物科技公司；人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株(ARPE-19)購(gòu)自上海富衡公司。Y79及WERI-RB-1細(xì)胞培養(yǎng)基均利用RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)加20%胎牛血清(上海依科賽生物)及1.0%青鏈霉素溶液(上海碧云天公司)配制，ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清(上海依科賽生物)及1.0%青鏈霉素溶液的DMEM-F12(美國(guó)Hyclone公司)培養(yǎng)基；所有細(xì)胞均在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Y79、WERI-RB-1細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，ARPE-19細(xì)胞作為對(duì)照組。

1.6.2 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)步驟 收集細(xì)胞，PBS洗2或3次，加入Trizol裂解液(cat：15596026，美國(guó)Invitrogen公司)，依次使用氯仿、異丙醇和75%乙醇提取總RNA；利用超微量分光光度計(jì)對(duì)RNA樣品進(jìn)行濃度和純度測(cè)定，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)并按照操作說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)液，分兩步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；使用SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒(MCE公司)配制反應(yīng)體系，依次加入無(wú)酶水、SYBR Green染料、上下游引物、cDNA模板后混勻，用ABI 7500熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。設(shè)置熱循環(huán)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、60 ℃1 min、95 ℃ 30 s、60 ℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)[13]。以β-actin作為內(nèi)參照，5個(gè)關(guān)鍵基因引物序列見(jiàn)表1(由上海生工有限公司合成)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for qRT-PCR

1.7 免疫組化檢測(cè)關(guān)鍵蛋白表達(dá)量

1.7.1 臨床標(biāo)本收集及分組 納入2016年1月－2019年1月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的RB患者石蠟組織標(biāo)本20例，所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療，獲取10例因車禍傷等原因進(jìn)行眼球摘除患者的正常視網(wǎng)膜作為對(duì)照組。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)審批[(2019)270]。

1.7.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟 石蠟切片常規(guī)脫蠟后，將組織切片置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)緩沖液(pH9.0)中進(jìn)行抗原修復(fù)，放入3% H2O2溶液避光孵育25 min；滴加3%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30 min；分別加入著絲粒蛋白K(CENPK)抗體(北京博奧森公司)、兔抗人胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)控因子-1(PRC1)抗體(Abcam公司)4 ℃孵育過(guò)夜[14]，加入辣根過(guò)氧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗；用3,3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色、蘇木精復(fù)染，脫水后中性樹(shù)脂封片，組織切片在顯微鏡下進(jìn)行檢查。免疫組化的結(jié)果分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(0～12分)：0～4分為低表達(dá)組(陰性)，5～12分為高表達(dá)組(陽(yáng)性)[15]。上述試劑除一抗外均購(gòu)買自武漢賽維爾生物公司。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 8.3.0軟件進(jìn)行qRT-PCR結(jié)果作圖及統(tǒng)計(jì)分析，多組間關(guān)鍵基因表達(dá)量的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)；采用SPSS 25.0軟件對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析，RB組織與對(duì)照組中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)差異采用單側(cè)Fisher確切概率法進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs的篩選 共得到1254個(gè)DEGs，其中表達(dá)上調(diào)基因422個(gè)，表達(dá)下調(diào)基因832個(gè)，具體分布情況見(jiàn)圖1。

圖1 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織與正常組織差異表達(dá)基因的火山圖及熱圖Fig.1 Volcano and heat maps of differentially expressed genes in RB tissues and normal tissues

2.2 DEGs的功能注釋和通路富集 GO富集分析結(jié)果顯示，DEGs主要與蛋白質(zhì)異二聚體活性、陽(yáng)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、染色質(zhì)結(jié)合、無(wú)機(jī)陽(yáng)離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性和細(xì)胞黏附分子結(jié)合等生物學(xué)功能密切相關(guān)(圖2A)。KEGG通路分析結(jié)果顯示，DEGs主要富集在細(xì)胞周期、光傳導(dǎo)、DNA復(fù)制和卵母細(xì)胞減數(shù)分裂等通路上(圖2B)。

圖2 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤差異表達(dá)基因的GO富集分析(A)和KEGG通路分析(B)Fig.2 GO enrichment (A) and KEGG pathway analysis (B) of differentially expressed genes in RB

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選 PPI網(wǎng)絡(luò)由3567條邊、611個(gè)節(jié)點(diǎn)構(gòu)成，以MCC＞2.09×1013為標(biāo)準(zhǔn)得到79個(gè)基因[9]，即為網(wǎng)絡(luò)核心基因(圖3)。

圖3 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心基因篩選Fig.3 PPI networks of DEGs and screening core genes in RB

2.4 WGCNA分析結(jié)果

2.4.1 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與樞紐基因篩選 利用pickSoftThreshold函數(shù)篩選合適的軟閾值β，使無(wú)尺度拓?fù)鋽M合指數(shù)R2＞0.8以構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(圖4A)，β=6時(shí)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中基因之間的連接性滿足無(wú)標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)分布(圖4B)，利用MCC算法以得分＞4作為標(biāo)準(zhǔn)[9]，得到位于網(wǎng)絡(luò)中心的前13個(gè)基因，即為樞紐基因(圖4C)。

圖4 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WGCNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及其樞紐基因的篩選Fig.4 Screening of WGCNA network and key genes in RB

2.4.2 基因模塊的劃分與關(guān)鍵模塊篩選 利用動(dòng)態(tài)混合剪切法獲得11個(gè)共表達(dá)基因模塊，其中灰色模塊是無(wú)法聚集到其他模塊的基因，基于模塊基因構(gòu)建模塊聚類樹(shù)(圖5A)，模塊的拓?fù)渲丿B熱圖反映模塊與模塊間基因的相關(guān)程度(圖5B)，基因的聚類樹(shù)狀圖展示模塊劃分過(guò)程(圖5C)。分別計(jì)算各個(gè)模塊與臨床性狀之間的Pearson相關(guān)系數(shù)及P值(圖6A)，以Pearson相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值＞0.55且P＜0.05作為篩選條件，篩選出5個(gè)重要模塊，分別是blue、pink、turquoise、red和brown模塊。Blue、pink和turquoise模塊與診斷年齡呈明顯正相關(guān)(r=0.65，P=2×10-4；r=0.58，P=0.001；r=0.59，P=0.001)，其中pink模塊還與單雙側(cè)眼患病和隨訪時(shí)間呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.57，P=0.002；r=-0.63，P=4×10-4)；而red和brown模塊與繼發(fā)性腫瘤呈明顯正相關(guān)(r=0.57，P=0.001；r=0.55，P=0.002)。其中blue模塊與診斷年齡的相關(guān)系數(shù)最高，將blue模塊包含的基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖6B)。各個(gè)重要模塊包含的基因見(jiàn)表2。本研究還將基因與臨床性狀關(guān)聯(lián)，分別計(jì)算出每個(gè)基因與臨床性狀的相關(guān)性，選取與每項(xiàng)臨床性狀相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值最高的基因，得到hmgb3、pcdhb3、ids、polh、birc5、guca1b共6個(gè)基因(表3)，其中pcdhb3與診斷年齡的相關(guān)系數(shù)最高(r=0.8411)。

圖5 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤WGCNA分析模塊劃分過(guò)程Fig.5 WGCNA analysis module partition process in RB

表2 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤研究中各個(gè)重要模塊包含的基因Tab.2 Genes contained in each important module of research on RB

表3 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤與臨床性狀相關(guān)程度較高的基因列表Tab.3 The genes with the higher degree of correlation for each clinical trait in RB

2.4.3 GO富集分析和KEGG通路分析 Pink和red模塊包含基因數(shù)目較少，無(wú)法進(jìn)一步進(jìn)行富集分析，因此將blue、turquoise和brown模塊中的基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(kù)中，以校正后的P值(FDR)＜0.05作為篩選條件。Blue模塊GO分析結(jié)果顯示，對(duì)于生物過(guò)程主要富集在細(xì)胞分裂、有絲核分裂等過(guò)程，對(duì)于細(xì)胞組分主要富集在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、微管等結(jié)構(gòu)，對(duì)于分子功能主要富集在ATP結(jié)合、微管結(jié)合等功能方面；KEGG分析結(jié)果顯示主要富集在細(xì)胞周期、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂等通路。Turquoise模塊基因主要與細(xì)胞核、核質(zhì)、ATP結(jié)合等相關(guān)，brown模塊基因主要富集在細(xì)胞核、核質(zhì)等細(xì)胞成分上。

2.5 關(guān)鍵基因篩選 將DEGs PPI的核心基因、WGCNA網(wǎng)絡(luò)的樞紐基因及重要模塊包含基因取交集(圖6C)，得到染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白4(structural maintenance of chromosome 4，smc4)、微小染色體維持蛋白6(minichromosome maintenance complex component 6，mcm6)、著絲粒蛋白K(centromere protein K，cenpk)、驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員15(kinesin family member 15，kif15)、胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)控因子-1(protein regulator of cytokinesis 1，prc1)等5個(gè)關(guān)鍵基因。上述5個(gè)關(guān)鍵基因在RB中均為高表達(dá)基因，其logFC均＞1，關(guān)鍵基因所屬模塊及差異表達(dá)信息見(jiàn)表4。

圖6 模塊與臨床性狀相關(guān)性熱圖及blue模塊PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Heat map of correlation between module and clinical traits and PPI network of blue module

表4 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤關(guān)鍵基因所屬模塊及差異表達(dá)信息Tab.4 The modules and differential expression information of key genes in RB

2.6 關(guān)鍵基因在細(xì)胞株中的表達(dá)情況 采用qRTPCR檢測(cè)5個(gè)關(guān)鍵基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示，prc1和cenpk的相對(duì)表達(dá)量在Y79、WERI-RB-1細(xì)胞中明顯高于對(duì)照組(P＜0.05，圖7)。

圖7 視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤關(guān)鍵基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of key genes in RB

2.7 RB及正常視網(wǎng)膜組織中PRC1、CENPK蛋白的表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果表明，20例RB中有10例(50%)PRC1蛋白表達(dá)陽(yáng)性，而10例正常視網(wǎng)膜中僅有1例(10%)呈陽(yáng)性，故RB組織中PRC1蛋白陽(yáng)性率高于正常視網(wǎng)膜，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。CENPK蛋白在RB和正常視網(wǎng)膜中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖8)。

圖8 PRC1及CENPK蛋白在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤組織及正常視網(wǎng)膜中的表達(dá)(免疫組化染色, ×200)Fig.8 Expression of PRC1 and CENPK protein in RB tissue and normal retina (Immunohistochemical staining, ×200)

3 討 論

RB發(fā)生率居小兒惡性腫瘤的第2位[1]，嚴(yán)重威脅患兒生命。RB發(fā)病多在5歲以下，約2/3的患兒在3歲前患病，近年來(lái)其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，且如果治療不及時(shí)，可能導(dǎo)致失明或死亡。因此，為實(shí)現(xiàn)RB的早診斷、早治療，尋找其關(guān)鍵基因及生物標(biāo)志物顯得越來(lái)越重要。

目前，高通量數(shù)據(jù)資源越來(lái)越豐富，許多學(xué)者運(yùn)用多種生物信息學(xué)方法進(jìn)行大樣本數(shù)據(jù)挖掘[16]，尋找導(dǎo)致某種疾病發(fā)生的關(guān)鍵基因，以進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與疾病診斷及預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物，此方式較傳統(tǒng)研究方法更省時(shí)省力、節(jié)約經(jīng)費(fèi)且科學(xué)有效。然而，以往的生物信息學(xué)分析多使用單個(gè)數(shù)據(jù)集[17]和單一方法分析DEGs[18]，而RB發(fā)病率較低且組織樣本獲取難度大，故組織樣本較為稀缺，單個(gè)數(shù)據(jù)集樣本量較少，可能導(dǎo)致分析結(jié)果不準(zhǔn)確。因此，本研究將3個(gè)RB數(shù)據(jù)集中的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行合并以增加樣本量，運(yùn)用差異表達(dá)分析聯(lián)合加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，將DEGs劃分成不同模塊并與臨床性狀相關(guān)聯(lián)，篩選出了與RB發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的5個(gè)可能基因。其中，SMC4對(duì)哺乳動(dòng)物的DNA修復(fù)至關(guān)重要，可能參與了基因表達(dá)沉默狀態(tài)的維持和DNA修復(fù)等過(guò)程，與肺腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及結(jié)直腸腫瘤發(fā)生相關(guān)，且與乳腺癌預(yù)后相關(guān)[19-22]。MCM6是高度保守的微型染色體維持蛋白之一，是啟動(dòng)真核基因組復(fù)制所必需的，Liu等[23]發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移，且可作為肝細(xì)胞癌早期復(fù)發(fā)的一種新的血清生物標(biāo)志物[24]。CENPK與著絲粒功能和有絲分裂進(jìn)程密切相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，它可能參與了肝細(xì)胞癌的惡性化進(jìn)展[25]。Lee等[26]發(fā)現(xiàn)，CENPK在卵巢癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)且可作為卵巢癌的一種新的腫瘤標(biāo)志物。KIF15可促進(jìn)黑色素瘤生成[27]，也是促進(jìn)胰腺癌增殖的重要調(diào)控因子[28]。PRC1基因位于15q26.1，與細(xì)胞增殖、胞質(zhì)分裂、紡錘體及微管的形成密切相關(guān)。

本研究的生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，這5個(gè)基因均為RB組織中表達(dá)上調(diào)的基因。WGCNA分析結(jié)果顯示它們均為重要模塊中的基因，其中smc4屬于blue模塊，mcm6、prc1屬于brown模塊，cenpk、kif15則是turquoise模塊的組成部分。由于blue模塊與診斷年齡呈明顯正相關(guān)，brown及turquoise模塊與繼發(fā)性腫瘤呈明顯正相關(guān)，因此，smc4可能與RB的發(fā)病進(jìn)程相關(guān)，而mcm6、prc1、cenpk、kif15可能與RB繼發(fā)性腫瘤的發(fā)生存在一定相關(guān)性。但由于目前這些基因在RB中的研究較少，其在RB中的功能仍需進(jìn)一步探索。另外，通過(guò)對(duì)上述關(guān)鍵模塊基因的GO及KEGG分析發(fā)現(xiàn)，此類基因主要參與細(xì)胞核、微管等結(jié)構(gòu)形成，與細(xì)胞周期及有絲分裂過(guò)程等通路密切相關(guān)，因此，推測(cè)這些關(guān)鍵模塊中的差異表達(dá)基因可能是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路來(lái)影響RB的發(fā)病進(jìn)程的。此外，本研究還將基因與臨床性狀關(guān)聯(lián)，分別計(jì)算出每個(gè)基因與臨床性狀的相關(guān)性，選取與每項(xiàng)臨床性狀相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值最高的基因，得到了pcdhb3等共6個(gè)基因，其中pcdhb3與臨床性狀(診斷年齡)的相關(guān)系數(shù)最高。有研究發(fā)現(xiàn)，PCDHB3是一種新型的結(jié)直腸癌腫瘤抑制因子，且可能是晚期結(jié)直腸癌的預(yù)后標(biāo)志物[29]，因此，此類基因在RB中的功能也值得進(jìn)一步研究。

為驗(yàn)證上述篩選出的關(guān)鍵基因是否在RB細(xì)胞株中高表達(dá)，本研究體外培養(yǎng)了Y79、WERI-RB-1及ARPE-19細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明prc1及cenpk這兩個(gè)基因在RB細(xì)胞中高表達(dá)(P＜0.05)。此外，通過(guò)前面的生物信息學(xué)分析可以發(fā)現(xiàn)，在這5個(gè)基因中cenpk、prc1在RB中的表達(dá)明顯上調(diào)，而且它們?cè)谀[瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。結(jié)合qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們挑選cenpk、prc1這兩個(gè)基因進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，即在RB組織樣本中利用免疫組化實(shí)驗(yàn)在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明PRC1蛋白在RB組織中的表達(dá)量明顯增高(P＜0.05)。PRC1在惡性腫瘤中的作用研究尚少，Wang等[30]發(fā)現(xiàn)，PRC1高表達(dá)在肝癌細(xì)胞中增加了癌細(xì)胞的化療耐藥性。Liao等[31]對(duì)2株RB細(xì)胞(HXO-RB44和WERI-Rb-1)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染使prc1表達(dá)量降低后，發(fā)現(xiàn)RB細(xì)胞的增殖和血管生成受到了抑制，該過(guò)程是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路實(shí)現(xiàn)的，表明PRC1蛋白對(duì)RB的發(fā)生具有重要影響。

綜上所述，本研究運(yùn)用差異表達(dá)分析聯(lián)合加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析提取出了與RB相關(guān)的關(guān)鍵基因，其中RB細(xì)胞及組織中的PRC1表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，且Liao等[31]的體外實(shí)驗(yàn)表明沉默prc1基因可抑制RB細(xì)胞的增殖和血管生成，這些結(jié)果均提示PRC1可能對(duì)RB的發(fā)生發(fā)展具有一定的促進(jìn)作用。此外，本研究對(duì)探究RB的發(fā)病機(jī)制及潛在的治療靶點(diǎn)提供了新視角，但還需進(jìn)行進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證這些關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能。