尚主業(yè) 舒 麗 王 月 孟慶濤 賈宏敏 張志強(qiáng)

(遼寧科技大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 鞍山 114051)

1 引 言

Fe3＋是人體必需的微量元素[1-2]，在人的許多生理過程中扮演著重要的角色，例如氧氣運(yùn)輸、DNA 合成、髓磷脂合成、線粒體呼吸、神經(jīng)遞質(zhì)合成和代謝等[3-5]。而Fe3＋失衡會嚴(yán)重影響人們的身體健康，過量的Fe3＋會產(chǎn)生·OH 引起細(xì)胞損傷[6-8]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA 和碳水化合物的氧化和改性[9]，還會誘導(dǎo)β-地中海貧血、帕金森病、癲癇和阿爾茨海默病等疾病的發(fā)生[10-14]。對于血液、生物組織等樣品中微量鐵離子的精確測定是研究其吸收代謝的基礎(chǔ)，同時Fe3＋也是反映人體健康狀況的指標(biāo)之一[15-16]，因此，對Fe3＋的檢測和監(jiān)測具有重要意義。

目前，檢測Fe3＋離子的方法多種多樣，包括電感耦合等離子體發(fā)射光譜法[17-18]、高效液相色譜法[19]、原子吸收光譜法[20-21]、原子熒光光譜[22]和電化學(xué)方法[23-25]等，但這些技術(shù)在檢測中仍然面臨高成本、操作繁瑣、樣品制備復(fù)雜等問題；而熒光探針具有選擇性好、靈敏度高、操作簡單和原位檢測等優(yōu)點(diǎn)[26-29]。由于Fe3＋具有順磁性，所以目前報(bào)道的Fe3＋熒光探針大部分是猝滅型熒光探針，與熒光增強(qiáng)型探針相比，熒光猝滅型探針有較大的背景信號干擾且檢測限相對較高[30]，對其性能研究具有一定的局限性。因此，開發(fā)新型的Fe3＋熒光增強(qiáng)型探針是非常有必要的。

三苯胺的氮原子具有較強(qiáng)的供電子能力，所以通過特定修飾的三苯胺具有獨(dú)特的發(fā)光性能[31-33]。因此，開發(fā)出具有優(yōu)越性能的三苯胺基熒光探針引起了越來越多科研工作者的關(guān)注。本文將5-(4-(二苯胺)苯基)噻吩-2-甲醛和4-氨基安替吡啉通過縮合反應(yīng)制備出一種熒光增強(qiáng)型Fe3＋探針BL。在DMSO-HEPES 緩沖溶液中實(shí)現(xiàn)了對Fe3＋的特異性識別，同時考察了不同金屬離子及pH 對BL 識別Fe3＋離子的影響。利用高分辨率質(zhì)譜(HR-MS)、Job's plot 曲線和Benesi-Hildebrand 曲線驗(yàn)證了BL 對Fe3＋的識別機(jī)理。通過密度泛函理論(DFT)計(jì)算了識別Fe3＋前后軌道能級和電能的變化并解釋了其熒光光譜現(xiàn)象。此外，該探針也被應(yīng)用于自來水和瓶裝水中Fe3＋的定量檢測。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 主要儀器與試劑

主要儀器:AVANCE 500MHZ 型核磁共振波譜儀(瑞士BRUKER 公司)；6530 Q-TOFLC/MC型液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫科技公司)；Lambda-900 型紫外分光光度計(jì)(美國P.E.儀器公司)；FS5 型愛丁堡熒光光譜儀(英國愛丁堡公司)；Nicolet iS-50 型紅外光譜儀(美國Therom 公司)。

試劑:5-溴噻吩-2-甲醛、三苯胺-4-硼酸、四(三苯基膦)鈀、4-氨基安替吡啉(分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；二氯甲烷、二甲亞砜、金屬硝酸鹽(Ca2＋、Ni2＋、Zn2＋、Ba2＋、Co3＋、K＋、Na＋、Ag＋、Cd2＋、Li＋、Pb2＋、Mg2＋、Al3＋、Cu2＋、Hg2＋、Cr3＋)(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；KNO3(分析純，沈陽一化玻化學(xué)試劑)；FeNO3(分析純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司)。所有試劑無需進(jìn)一步純化，直接使用。

2.2 探針合成與表征

2.2.1 5-(4-(二苯胺)苯基)噻吩-2-甲醛合成

稱取5-溴噻吩-2-甲醛0.191 g(1 mmol)、四(三苯基膦)鈀0.03 g(0.026 mmol)、10 mL 5 mol·L－1的K2CO3和20 mL 四氫呋喃(THF)于100 mL 燒瓶中，加熱攪拌0.5 h。取三苯胺-4-硼酸0.347 g(1.2 mmol)溶于10 mL THF，加入上述溶液中。在N2保護(hù)下，90 ℃反應(yīng)8 h。冷卻，倒入水中，用二氯甲烷萃取，所得有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，旋干，用二氯甲烷∶石油醚(v/v＝5∶1，Rf＝0.32)柱層析分離，得淺黃色固體，收率為70.2%。1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ(10－6):9.87(s，1H)，7.99(d，J＝4.0 Hz，1H)，7.68(d，J＝8.7 Hz，2H)，7.59(d，J＝4.0 Hz，1H)，7.35(t，J＝7.9 Hz，4H)，7.14(d，J＝7.4 Hz，2H)，7.11～7.07(m，4H)，6.96(d，J＝8.7 Hz，2H)。13C NMR(DMSO-d6，101 MHz)δ(10－6):184.10，153.38，149.02，146.89，141.35，139.86，130.21，127.86，126.02，125.43，124.55，124.42，122.18。ESIMS:m/z[M ＋H＋]＋＝356.111 5，計(jì)算值:356.110 4。

2.2.2 探針BL 合成

稱取0.203 1 g(1 mmol)的4-氨基安替吡啉和0.355 1 g(1 mmol)的5-(4-(二苯胺)苯基)噻吩-2-甲醛，溶于20 mL 無水乙醇中，滴加2 mL 冰乙酸，回流10 h。反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，濾餅用10 mL 冷無水乙醇洗滌幾次后放入真空干燥箱干燥，得黃色固體BL，產(chǎn)率為65%。1H NMR (400 MHz，DMSO-d6)δ(10－6):9.65(s，1H)，7.63(d，J＝8.6 Hz，2H)，7.53(t，J＝7.8 Hz，2H)，7.46～7.41(m，2H)，7.38(t，J＝2.9 Hz，2H)，7.37～7.31(m，5H)，7.09(dd，J＝14.2，7.5 Hz，6H)，6.98(d，J＝8.7 Hz，2H)，3.16(s，3H)，2.40(s，3H)。13C NMR (101 MHz，DMSO-d6)δ(10－6):160.12，151.86，148.78，147.80，147.19，146.19，143.22，134.99，132.47，130.14，129.62，127.40，127.17，125.09，124.97，124.10，123.95，123.09，35.84，10.25。ESI-MS:m/z[M ＋H＋]＋＝541.206 6，計(jì)算值:541.206 2。探針BL 的合成路線如圖1所示。

圖1 探針BL 的合成路線Fig.1 The synthetic route of probe BL

2.2.3 測試所需溶液配制

(1)BL 儲備液配制

取0.022 4 g 的BL 于100 mL 容量瓶中，用DMSO 定容，制得濃度為5×10－4mol·L－1的濃溶液(避光保存，備用)。測試時取出2.0 mL 濃溶液于100 mL 容量瓶中，用DMSO∶HEPES ＝5∶5的溶液稀釋到1×10－5mol·L－1。

(2)金屬離子溶液配制

稱取一定量的各種金屬離子硝酸鹽于10 mL容量瓶中，用去離子水定容，配制成2×10－2mol·L－1金屬離子溶液。

2.2.4 光譜測定

紫外-可見光譜(UV-Vis)和熒光光譜測試均在DMSO/HEPES(5∶5，v/v，pH ＝7.4，20 mmol·L－1)條件下進(jìn)行。紫外光譜測量范圍為275～550 nm。熒光光譜的激發(fā)波長為415 nm，狹縫寬度均為2 nm，測試時間為2 min。

3 結(jié)果與討論

3.1 探針BL 識別Fe3+紫外光譜響應(yīng)

利用紫外光譜考查了探針BL 對金屬離子的選擇性。由圖2 可看出，當(dāng)加入Fe3＋后，探針415 nm 處的紫外吸收強(qiáng)度增強(qiáng)，形成鮮明對比的是，加入其他金屬離子如Ca2＋、Mg2＋、Ni2＋、Al3＋、Cu2＋、Hg2＋、Zn2＋、Ba2＋、Co3＋、K＋、Na＋、Ag＋、Cr3＋、Cd2＋、Li＋、Pb2＋后，探針的吸收光譜沒有變化。表明探針BL 能夠?qū)Ｒ恍宰R別Fe3＋。

圖2 向探針BL(10 μmol·L－1)溶液中加入各種陽離子(70 μmol·L－1)(Ca2＋，F(xiàn)e3＋，Mg2＋，Ni2＋，Al3＋，Cu2＋，Hg2＋，Zn2＋，Ba2＋，Co3＋，K＋，Na＋，Ag＋，Cr3＋，Cd2＋，Li＋，Pb2＋)的紫外-可見吸收選擇光譜Fig.2 UV-Vis absorption spectra of BL(10 μmol·L－1)upon addition of various cations(70 μmol·L－1)(Ca2＋，F(xiàn)e3＋，Mg2＋，Ni2＋，Al3＋，Cu2＋，Hg2＋，Zn2＋，Ba2＋，Co3＋，K＋，Na＋，Ag＋，Cr3＋，Cd2＋，Li＋，Pb2＋)

在DMSO/HEPES(5∶5，v/v，pH ＝7.4，20 mmol·L－1)緩沖溶液中，考查了不同濃度的Fe3＋對探針BL 紫外光譜的影響。如圖3 所示，隨著Fe3＋的加入，BL 在415 nm 處的紫外吸收峰逐漸增強(qiáng)，當(dāng)加入Fe3＋(65 μmol·L－1)時，探針的紫外光譜不再變化。紫外滴定光譜表明探針BL 對Fe3＋有著良好的識別性能。

圖3 向探針BL(10 μmol·L－1)溶液中逐漸加入Fe3＋(0～75 μmol·L－1)的紫外-可見光譜(插圖為探針溶液在415 nm 處的吸光度隨Fe3＋濃度變化的滴定曲線)Fig.3 UV-Vis absorption spectra of BL(10 μmol·L－1) in the presence of increasing amount of Fe3＋(0－ 75 μmol·L－1) (Inset:absorption of BL at 415 nm as a function of Fe3＋)

首先，利用熒光光譜考查了探針的光學(xué)穩(wěn)定性，如圖S10 所示，探針在20 h 內(nèi)熒光強(qiáng)度無明顯變化，說明探針具有良好的光穩(wěn)定性，這為其后續(xù)的識別應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。接下來進(jìn)一步考查了探針BL對各種金屬離子(Ca2＋，Mg2＋，Ni2＋，Al3＋，Cu2＋，Hg2＋，Zn2＋，Ba2＋，Co3＋，K＋，Na＋，Ag＋，Cr3＋，Cd2＋，Li＋，Pb2＋)的熒光識別性能。如圖4(a)所示，探針BL 本身在538 nm 處表現(xiàn)出較弱的熒光發(fā)射，加入Fe3＋后探針的熒光明顯增強(qiáng)且發(fā)射波長紅移到550 nm，溶液的熒光顏色由藍(lán)綠色變?yōu)辄S色(圖4(b))。在HEPES 緩沖液中，我們探究了BL 對Fe3＋的響應(yīng)時間。如圖S11 所示，向探針BL 中加入不同量的Fe3＋(0，25，50，75 μmol·L－1)后，熒光強(qiáng)度迅速上升并且在100 s 左右達(dá)到最高，表明探針BL 能在100 s 內(nèi)完成對Fe3＋的檢測。識別機(jī)理為Fe3＋的加入使探針的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)過程受到抑制從而使體系的熒光得以恢復(fù)。而加入其他金屬離子對BL的熒光光譜則沒有任何影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該探針對Fe3＋的識別具有專一性。

圖4 (a)向探針BL(10 μmol·L－1)溶液中加入各種陽離子(65 μmol·L－1)的熒光響應(yīng)圖；(b)向探針BL(10 μmol·L－1)溶液中加入各種陽離子的溶液熒光顯色圖(λex ＝365 nm)；(c)向探針BL(10 μmol·L－1)溶液中加入16 種其他金屬離子(65 μmol·L－1)及加入Fe3＋(65 μmol·L－1)的熒光競爭圖(λex ＝415 nm，λem ＝550 nm) (1.Blank，2.Fe3＋，3.Ca2＋，4.Cu2＋，5.Mg2＋，6.Ni2＋，7.Al3＋，8.Hg2＋，9.Zn2＋，10.Ba2＋，11.Co3＋，12.K＋，13.Na＋，14.Ag＋，15.Cr3＋，6.Cd2＋，17.Li＋，18.Pb2＋)。Fig.4 (a)Fluorescence responses of BL(10 μmol·L－1) in the presence of various cations(65 μmol·L－1).(b)Fluorescence color responses of BL(10 μmol·L－1) upon addition of various cations(λex ＝365 nm).(c)Fluorescence responses of BL(10 μmol·L－1) to 16 kinds of other metal ions (65 μmol·L－1) and Fe3＋(65 μmol·L－1)(λex ＝415 nm， λem ＝550 nm)(1.Blank，2.Fe3＋，3.Ca2＋，4.Cu2＋，5.Mg2＋，6.Ni2＋，7.Al3＋，8.Hg2＋，9.Zn2＋，10.Ba2＋，11.Co3＋，12.K＋，13.Na＋，14.Ag＋，15.Cr3＋，6.Cd2＋，17.Li＋，18.Pb2＋).

性能優(yōu)良的探針若要能夠?qū)嶋H應(yīng)用，必須具備在干擾離子共存的環(huán)境下仍具有專一識別Fe3＋的能力。因此，本文對探針BL 識別Fe3＋的抗干擾性進(jìn)行了測試。如圖4(c)所示，在探針溶液中加入各種陽離子(3～18 號綠色柱)后，與探針原溶液(1 號綠色柱)相比，強(qiáng)度沒有明顯變化。而在含有干擾離子的探針溶液中繼續(xù)加入Fe3＋后，其熒光強(qiáng)度均明顯增強(qiáng)(3～18 號紅色柱)，且與在探針溶液中僅加入Fe3＋的熒光強(qiáng)度(2 號紅色柱)基本一致。這一結(jié)果表明探針BL 對Fe3＋的檢測具有很強(qiáng)的抗干擾性。

在DMSO/HEPES(5∶5，v/v，pH ＝7.4，20 mmol·L－1)的緩沖條件下，進(jìn)行了Fe3＋的熒光滴定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖5 所示，隨著Fe3＋濃度的增大，探針BL 的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)且波長發(fā)生紅移。從右上插圖可以看出，當(dāng)加入65 μmol·L－1Fe3＋時探針的熒光強(qiáng)度幾乎不再發(fā)生變化，達(dá)到滴定終點(diǎn)。進(jìn)一步測定了2 μmol·L－1下向探針BL 的溶液中加入不同濃度Fe3＋(0～8 μmol·L－1)后的熒光強(qiáng)度變化。如圖S12 所示，探針BL 在550 nm 處的熒光強(qiáng)度與Fe3＋的濃度變化具有良好的線性關(guān)系(R2＝0.992 56)，通過計(jì)算得出探針BL 識別Fe3＋的最低檢測限為0.165 μmol·L－1。

圖5 向探針BL(10 μmol·L－1)溶液中逐漸加入Fe3＋(0～90 μmol·L－1)的熒光滴定圖(插圖為探針在550 nm 處的熒光強(qiáng)度隨Fe3＋濃度變化的滴定曲線)(λex ＝415 nm)Fig.5 Fluorescence titration of probe BL(10 μmol·L－1) solution with gradual addition of Fe3＋(0－90 μmol·L－1) (Inset:fluorescence emission of BL at 550 nm as a function of Fe3＋concentration)(λex ＝415 nm)

利用Job's plot 曲線測定了探針BL 與Fe3＋的配位比。由圖S13 可知，曲線最高點(diǎn)對應(yīng)的橫坐標(biāo)為0.5，說明探針BL 與Fe3＋按1∶1進(jìn)行配位。采用Benesi-Hildebrand 線性方程，按照1∶1配位模式進(jìn)行線性擬合。如圖6 所示，在550 nm處測得的熒光強(qiáng)度1/(F0－F)與1/[Fe3＋]呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(R2＝0.987 67)，這也證實(shí)了探針BL 和Fe3＋之間的1∶1化學(xué)計(jì)量關(guān)系。通過擬合方程可以計(jì)算出探針BL 識別Fe3＋的絡(luò)合常數(shù)為1.603×104L·mol－1。

圖6 探針BL (10 μmol·L－1)與Fe3＋按照1∶1配位模式的Benesi-Hildebrand 曲線圖(λex ＝415 nm，λem ＝550 nm)Fig.6 Benesi-Hildebrand plot of BL(10 μmol·L－1) based on 1∶1 binding stoichiometry with Fe3＋(λex ＝415 nm， λem ＝550 nm)

為了探究探針BL 是否能夠在不同pH 條件下識別Fe3＋，為此進(jìn)行了探針的pH 依賴性實(shí)驗(yàn)。在DMSO/HEPES(5∶5，v/v，20 mmol·L－1)的條件下，在pH ＝4～11 范圍內(nèi)測試了探針以及加入65 μmol·L－1Fe3＋后的熒光發(fā)射強(qiáng)度。如圖7所示，探針BL 的熒光強(qiáng)度并沒有隨著pH 值的改變而發(fā)生明顯的變化，加入Fe3＋后探針的熒光強(qiáng)度大幅增強(qiáng)，并且在酸、堿環(huán)境下均可以實(shí)現(xiàn)對Fe3＋的有效識別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明探針BL 具有在廣泛pH 環(huán)境下的應(yīng)用潛質(zhì)。

圖7 探針BL(10 μmol·L－1)溶液以及識別Fe3＋后的溶液在不同pH 值下的熒光強(qiáng)度曲線(λex ＝415 nm， λem ＝550 nm)Fig.7 Effects of pH on the fluorescence intensities of BL(10 μmol·L－1) in the absence and presence of Fe3＋(75 μmol·L－1)(λex ＝415 nm， λem ＝550 nm)

3.2 探針BL 識別Fe3+機(jī)理驗(yàn)證

探針BL 識別Fe3＋時，F(xiàn)e3＋與噻吩上的S 原子、席夫堿上的N 原子和安替吡啉羰基上的O 原子發(fā)生配位，生成含有雜原子的兩個五元環(huán)的穩(wěn)定配合物。通過Job's plot 曲線和Benesi-Hildebrand 曲線已經(jīng)測試出探針BL 與Fe3＋配位比為1∶1，為了更加直觀地體現(xiàn)出BL 與Fe3＋的配位方式，我們利用HR-MS 進(jìn)一步探究了BL 與Fe3＋所生成的產(chǎn)物。探針本身[BL ＋H＋]＋在m/z＝541.206 6 處顯示出分子離子峰(圖S5)。向探針BL 溶液中加入Fe3＋后，在m/z＝666.089 9 處觀察到有新的離子峰生成(圖S9)，推測該峰為[BL ＋Fe3＋＋2Cl－]＋的分子量。由此也驗(yàn)證了探針BL 與Fe3＋為1∶1絡(luò)合(圖8)。

圖8 探針BL 對Fe3＋的響應(yīng)機(jī)理圖Fig.8 The response mechanism of probe BL of Fe3＋

3.3 理論計(jì)算

為了更深入地理解BL 對Fe3＋識別所產(chǎn)生的光譜變化，通過密度泛函理論計(jì)算了探針BL識別Fe3＋前后最優(yōu)結(jié)構(gòu)的能隙變化。如圖9 所示，在與Fe3＋識別之前，BL 的HOMO 只有在安替吡啉的苯環(huán)上沒有分布，在其余各部分均有分布；而BL 的LUMO 分布在噻吩、與噻吩相連的苯環(huán)、席夫堿和吡唑環(huán)部分。BL 的HOMO 和LUMO 軌道能級差為0.114 15 eV。在與Fe3＋識別之后，BLFe3＋的HOMO 主要分布在噻吩、席夫堿和Fe3＋上，在三苯胺和安替吡啉上的分布較少；而BLFe3＋的LUMO 主要分布在噻吩、席夫堿、Fe3＋和安替吡啉上，在三苯胺部分沒有分布。此時HOMO 和LUMO 軌道能級差為0.084 00 eV。由于BL-Fe3＋的軌道能級差小于BL 的軌道能級差，所以發(fā)射光譜發(fā)生紅移，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

圖9 探針BL 與Fe3＋絡(luò)合前后優(yōu)化的分子幾何結(jié)構(gòu)、HOMO 和LUMO 軌道分布及相應(yīng)的電能。Fig.9 The molecular geometry，HOMO and LUMO orbital distribution and the corresponding electrical energy were optimized before and after the probe BL complexed with Fe3＋.

3.5 實(shí)際水樣中Fe3+的檢測

為了驗(yàn)證探針BL 潛在應(yīng)用前景，我們對自來水和在當(dāng)?shù)爻匈徺I的瓶裝水中不同濃度的Fe3＋(10，50，100 μmol·L－1) 進(jìn)行了測定。所有測定水樣中Fe3＋的回收率均在98.3%～103.5%之間。結(jié)果表明，探針BL 能夠應(yīng)用于實(shí)際水樣中Fe3＋的定量檢測，具有重要的應(yīng)用價值。

表1 水樣中Fe3+的檢測結(jié)果Tab.1 Determination ofFe3＋in different water samples

4 結(jié) 論

本文設(shè)計(jì)并合成了一種以三苯胺為母體的Fe3＋熒光增強(qiáng)型探針BL，該探針對Fe3＋的識別具有較高的靈敏度、較廣泛的pH 適用范圍、良好的選擇性以及較強(qiáng)的抗干擾能力，其檢測限低至0.165 μmol·L－1。同時，加入Fe3＋后溶液的熒光顏色發(fā)生顯著變化，能夠達(dá)到“裸眼”識別的效果。通過高分辨率質(zhì)譜也進(jìn)一步證明了探針與Fe3＋為1∶1配位。利用密度泛函理論(DFT)計(jì)算了識別Fe3＋前后軌道能級和電能的變化并解釋了其熒光光譜發(fā)生紅移的現(xiàn)象。此外，該探針也成功應(yīng)用于實(shí)際水樣中Fe3＋的定量檢測。

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