廖盛楠呂煒桐唐權馬玗玟劉力嘉王亮彭顯

1.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院正畸科，成都61004；

2.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院，成都610041

變異鏈球菌（Streptococcusmutans，S.mutans）是引起齲齒的主要病原菌，在人的牙齒表面生長并分泌葡萄糖基轉移酶、葡聚糖結合蛋白等，以形成牙菌斑[1-2]。長期以來，氟、氯己定和其他抗菌藥物是齲齒治療的常規(guī)方法[3-4]。然而，變異鏈球菌對這些抗菌藥物產生的耐藥性已經成為全球公共衛(wèi)生的挑戰(zhàn)[5-6]。開發(fā)一種新藥需要大量的勞動力、資金和時間成本，藥物再利用是指在臨床上已經廣泛使用的藥物基礎上開發(fā)新的治療效果，是臨床上開發(fā)新藥的的替代選擇。近年來，小分子藥物防齲研究引起廣泛關注。通過對大量小分子化合物、天然產物等化合物庫的篩選，再通過靶點分析，尋求更能結合其靶蛋白活性位點的小分子，最終找到具有選擇性、特異性抑制致齲菌及牙菌斑生物膜形成的小分子藥物，達到開發(fā)新型抗齲藥物的目的。

選擇性雌激素受體調節(jié)劑（selective estrogen receptor modulators，SERMs）是一類美國食品藥物管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準的作用于雌激素受體的藥物。與純雌激素受體激動劑和拮抗劑不同，其因在不同組織中的作用不同而具有選擇性地抑制或刺激雌激素樣作用。臨床常用的SERMs包括他莫昔芬、托瑞米芬、克羅米芬和雷洛昔芬。他莫昔芬是雌激素受體陽性轉移性乳腺癌的一線激素治療藥物；托瑞米芬是一種氯化他莫昔芬衍生物，與他莫昔芬相比，在肝臟中產生的DNA加合物更少，并且被開發(fā)用于避免肝癌；克羅米芬是一種用于治療未排卵婦女（包括多囊卵巢綜合征婦女）不育癥的藥物；雷洛昔芬用于預防和治療高危婦女中的絕經后骨質疏松和乳腺癌[7-9]。SERMs還具有抗菌、抗病毒和神經保護作用，已經有少數(shù)研究[8，10-12]顯示了SERMs對革蘭陰性細菌具有有效的抗菌性能。但目前仍然缺乏對SERMs藥物系統(tǒng)的篩選，并且較少研究它們對口腔致齲菌，如變異鏈球菌的抗菌作用，且具體的作用機制需要進一步的探索。

轉座子插入為細菌基因組的隨機突變提供了一種有效方法，已被廣泛用于細菌發(fā)病機制和生物學研究中。課題組前期基于Himar1的轉座子的自殺載體pMagellan6，開發(fā)了變異鏈球菌突變體庫。Himar1是mariner家族的轉座子，利用Himar1轉座酶的點突變體增加了該酶的轉座率，使其能被開發(fā)成為基因操作的工具。Himar1轉座子轉座的唯一序列要求是TA二核苷酸序列。通過對轉座子插入的確切位置的鑒定即可找到突變基因位點。一種對Himar1轉座子非常有效的方法是在轉座子的反向重復序列中引入限制性內切酶MmeⅠ識別位點。用它消化基因組時，MmeⅠ會從識別位點側向消化20 bp序列，產生一個包含轉座子和反向重復序列的片段。通過特定的Illumina兼容序列連接到轉座子兩側的突出端堿基上，然后進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和Illumina深度測序，即可精確定位插入位點。

本研究旨在建立基于Himar1轉座子的變異鏈球菌突變體庫，可以通過大量突變體篩選探索抗菌藥物的作用位點。

1 材料和方法

1.1 細菌復蘇和培養(yǎng)

取-80℃凍存的變異鏈球菌UA159標準菌株，室溫下解凍后接種于腦心浸出液（brain heart infusion agar，BHI）瓊脂培養(yǎng)基中，37℃恒溫厭氧箱（80%N2，10%CO2，10%H2）內復蘇24 h，挑取單克隆菌株繼續(xù)培養(yǎng)24 h后制備細菌懸液，用PBS將細菌濃度調整為1×106CFU·mL-1，4℃?zhèn)溆?。攜帶質粒的大腸桿菌菌株在含有紅霉素（12μg·mL-1）的Luria-Bertani（LB；Difco）培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)。

1.2 藥物的準備

實驗中所有使用的FDA批準的小分子化合物都購買于成都寶科生物科技有限公司。其中SERMs包括托瑞米芬、他莫昔芬、克羅米芬和雷洛昔芬。將藥物制備了一系列濃度的稀釋液：將所有藥物分別溶于DMSO中，稀釋至50、25、12.5、6.25、3.125、1.56μmol·L-1的濃度。

1.3 最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值的測定

使用微量稀釋法測定小分子化合物對變異鏈球菌UA159的MIC值。將稀釋后不同濃度的小分子藥物溶液分別加到滅菌的96孔板中，第1至第11孔加藥液，每孔10μL，第12孔加入等量無菌PBS作為陰性對照。將單克隆的UA159菌落在BHI液體培養(yǎng)基中復蘇一夜，用BHI將菌液稀釋20倍后再生長至OD470為0.6，并每孔加入2μL到96孔細胞培養(yǎng)板中。然后在5%CO2下厭氧培養(yǎng)16 h，并通過酶標儀記錄每個孔在OD600的光密度（optical density，OD）值。以在孔內完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC，當對照孔（即PBS組）內細菌明顯生長實驗才有意義。

1.4 變異鏈球菌突變體庫的構建

利用mini-Himar1轉座子構建變異鏈球菌的突變體庫[13]。從異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）誘導的大腸桿菌中分離出含有MarC9轉座酶的粗提取物，然后通過親和色譜法使用淀粉樹脂柱純化該酶。MarC9轉座酶純化后，用8%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析測定最終產物的純度。使用1μg細菌DNA和1μg Magellan6在2 mL培養(yǎng)基中進行體外轉座。在轉座酶MarC9介導下，含有壯觀霉素和紅霉素抗性的Magellan6通過剪貼機制被引入線性的細菌基因組DNA片段中。轉座后，每個轉座子和線性基因組DNA的連接處存在單鏈的間隙，用T4DNA聚合酶和大腸桿菌DNA連接酶進行修復。

隨后，包含Magellan6插入片段的線性基因組DNA被轉化入感受態(tài)細胞中。即在BHI中過夜培養(yǎng)的變異鏈球菌的菌株被1∶10/1∶20/1∶30稀釋，并在37℃中厭氧培養(yǎng)至OD600值達到0.2～0.3（約2～3 h）。培養(yǎng)物在室溫下靜置10 min。在1.5 mL離心管中，將1μg的用于轉化的DNA加入500～1 000μL細胞培養(yǎng)液中，并以30℃厭氧額外培養(yǎng)2～3 h。在培養(yǎng)之后稀釋細胞，將一部分涂板于含有抗生素的BHI選擇培養(yǎng)基上，在37℃下培養(yǎng)，直到可見菌落。

1.5 插入位點的鑒定

從選擇培養(yǎng)基上挑選出成功轉座的突變體菌株后，識別轉座子的插入位點。轉座子左右兩端的反向重復序列里設計有MmeⅠ識別序列，用ⅡS型限制酶MmeⅠ對轉座子插入的突變體的基因組DNA進行消化。MmeⅠ在其識別位點的下游切割了20個bp的序列。產生的一部分DNA片段包含了轉座子的反向重復序列和20 bp的側翼DNA。預先制備一種特定的Illumina兼容序列，并存儲在

-20℃。

用DNA連接酶在轉座子兩側的突出端堿基連接上Illumina兼容序列，并在16℃培養(yǎng)一夜，即產生120 bp的插入位點片段。應用PFU超緩沖液、dNTPs、引物P1_M6_MmeI、Gex PCR引物2和PFU超聚合酶等進行PCR以擴增序列。通過Illumina深度測序，即可精確定位插入位點。

2 結果

2.1 抑制變異鏈球菌的小分子化合物的篩選

作為FDA批準的藥物，這些藥物的生物安全性已經得到了測試和保證。用微量稀釋法測定了426個FDA批準的小分子化合物對變異鏈球菌UA159的MIC。研究發(fā)現(xiàn)，這些小分子化合物中有18種小分子抑制劑對變異鏈球菌具有抗菌效果，分別屬于以下類別（表1）。除了傳統(tǒng)抗生素外，還發(fā)現(xiàn)了以往認為與抗菌活性無關的藥物。在確定的具有抗菌特性的18種小分子化合物中，有4種屬于選擇性雌激素受體調節(jié)劑，結構存在差異（圖1），展現(xiàn)出良好的抗菌能力。

圖1 篩選出的4種SERMs的化學結構Fig 1 Chemical structuresof four selected SERMs

表1 篩選出的具有抑制變異鏈球菌活性的小分子化合物Tab 1 Selected small molecular inhibitors which have anti-S.mutans activities

2.2 變異鏈球菌突變體庫的成功構建

為了研究SERMs的抗菌機制，以克羅米芬為例進行探索。利用Himar1 Mariner轉座子系統(tǒng)構建了變異鏈球菌的突變體庫。其中包括一系列的實驗：MarC9酶的純化、Magellan6的轉化和突變株的篩選。為了在體外轉化Magellan6，成功地構建了質粒PVPT作為載體。從IPTG誘導的大腸桿菌中分離并純化MarC9轉座酶后，用于之后的轉座子系統(tǒng)中。在誘導細菌進入感受態(tài)后，含有轉座子的DNA被轉化入變異鏈球菌中。采用含有壯觀霉素的培養(yǎng)基驗證變異鏈球菌是否轉化成功。Magellan6上攜帶有壯觀霉素抗性，因此沒有成功轉化DNA的細菌將被抑制生長。對于成功轉化的細菌，在37℃的選擇性BHI平板上可以看到菌落，得到了成功轉化的突變體（圖2A）。為了確認轉座子是否成功插入菌株，在提取細菌DNA后，通過PCR擴增了120 bp的插入位點片段。10個隨機挑選的單個菌落均出現(xiàn)了120 bp序列片段對應的條帶（圖2B）。

圖2 變異鏈球菌突變體的成功轉化Fig 2 Thesuccessful transformation of S.mutans

通過對這120 bp的片段的測序可以確定轉座子插入的位置。因此，對片段進行了測序，并在變異鏈球菌的基因組進行了比對，證實了突變體庫中不同位點的隨機插入。在以上10個被測序的菌落中，9個呈陽性插入，插入位點的識別如下（表2）。

表2 變異鏈球菌突變體的插入位點的鑒定Tab 2 Identification of the insertion sites of S.mutans

通過菌落計數(shù)統(tǒng)計，從4個獨立的轉化實驗中收集了大約45 000個轉座子插入突變體。而變異鏈球菌UA159共有約2 160個基因，數(shù)目龐大的隨機突變足以覆蓋其全部非必須基因，此突變體庫可以作為研究藥物作用靶點的有效工具。

2.3 SERMs抗菌機制的探索

由于DNA片段的體外轉座和隨后質粒的轉化都是低頻事件，絕大多數(shù)的突變菌株都只有單個轉座子插入。為了篩選出具有克羅米芬抗性的突變體，將突變體庫的不同菌株添加到含克羅米芬的BHI瓊脂平板上。在37℃下培養(yǎng)48～72 h后，最終獲得了2個抗克羅米芬的突變菌株。在沒有克羅米芬的條件下培養(yǎng)至少30代后，2個突變體的菌株仍然可以表現(xiàn)出穩(wěn)定的抗克羅米芬的表型，結果表明這2種突變體的耐藥性與轉座子插入密切相關。對DNA序列的測序分析結果表明，轉座子插入位點位于smu_546、smu_874的基因中（圖3）。

圖3 不同的變異鏈球菌突變株在克羅米芬中的生長情況。其中TnSm-1（smu-546基因突變）和TnSm-2（smu-874基因突變）兩個菌株具有克羅米芬抗性Fig 3 The growth condition of different mutant strains in clomiphene.Two mutant strains，TnSm-1(Smu-546 gene mutation)and TnSm-2(Smu-874 genemutation)，werefound to beresistant to clomiphene

3 討論

齲病是一種慢性細菌感染性疾病，氟化物、氯己定和其他抗菌的藥物長期使用導致了細菌耐藥性的出現(xiàn)，促使去探尋更有效地對抗變異鏈球菌的藥物，以實現(xiàn)齲病的防治。從FDA已經批準的藥物中開發(fā)新的抑菌功能是一個很好的方向。本實驗從FDA批準的藥物中發(fā)現(xiàn)了SERMs這類藥物具有良好的抑菌效果，并系統(tǒng)地探究其抗菌作用。盡管近年來SERMs的抑菌能力受到了一定關注，但對口腔致齲菌——變異鏈球菌的抑制作用探究較少。本實驗通過建立變異鏈球菌的突變體庫，進一步探究SERMs的作用機制。將SERMs和臨床中最常見、最有效的口服抗菌劑相比，SERMs比臨床中使用的氯己定具有更低的抑菌濃度[14]。氯己定通過改變細菌生物膜的滲透性來抑制細菌的生長，且具有一定的不良反應。由于抑菌機制的不同，SERMs可能解決變異鏈球菌產生的耐藥性的問題。此外，與氯己定一樣，SERMs在其表面具有正電荷，這有助于藥物與牙菌斑結合，并穩(wěn)定地釋放藥物[15]。

在之前的研究中，克羅米芬通過抑制十一異戊烯二磷酸合酶（Undecaprenyl-diphosphate synthase，UPPS）來抑制金黃色葡萄球菌，該合成酶負責合成的十一異戊烯二磷酸是脂質載體Und-P的直接前體，從而降低了用于合成磷壁酸（wall teichoic acid，WTA）的Und-P，對細胞壁產生作用[16]。克羅米芬與β-內酰胺在抑制金黃色葡萄球菌方面具有協(xié)同作用，這可能歸因于UPPS的抑制降低了脂質Ⅱ，而脂質Ⅱ被用作PBPs的轉糖基作用和轉肽作用的底物。然而，克羅米芬對不同的細菌種類可能具有不同的抗菌機制。變異鏈球菌的突變體庫提供了2個對克羅米芬耐藥的菌株。對這兩個菌株的DNA序列分析表明，轉座子插入位點位于smu_546、smu_874的基因中。smu_546編碼一種推定的三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）結合蛋白，它是一種參與應激反應的膜GTP酶。smu_874編碼一種雙功能的同型半胱氨酸S甲基轉移酶/5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶蛋白。然而，需要進一步的實驗來驗證是否是這2個基因的突變導致了變異鏈球菌對克羅米芬的耐藥性的產生。其他SERMs藥物，例如托瑞米芬和他莫西芬，通過將細菌的細胞膜去極化和滲透作用，誘導離子流出，導致跨膜電位的喪失，嚴重破壞膜的形成和導致細菌細胞壁的膨脹，也作用于脂質和蛋白質，導致細胞裂解[17-20]。作為同一類藥物，克羅米芬與它們具有相似的化學結構和性質，可能具有相似的機制影響變異鏈球菌。

檸檬酸克羅米芬已被用于臨床治療，其安全性問題不容忽視。許多臨床試驗和Meta分析系統(tǒng)地研究和介紹了與它的安全性有關的問題。臨床上，使用大劑量的克羅米芬治療與多胎妊娠、先天性血管瘤和卵巢癌有關[21-22]。在本研究中，克羅米芬的MIC僅為3.125μmol·L-1，治療口腔感染所需的劑量遠遠小于安全范圍[23-25]。在細菌生物膜的影響下，不同藥物在體內的實際抗菌效果可能不同。大量的研究[26]表明，由于生物膜的保護作用，變異鏈球菌在生物膜中對抗菌劑的敏感度遠低于體外的浮游狀態(tài)，因此，應進行進一步的體內實驗來研究SERMs在體內的抗菌作用及其防齲效果?？谇坏纳鷳B(tài)環(huán)境是一個由多種細菌相互作用的復雜環(huán)境，SERMs藥物是否只特定地針對變異鏈球菌發(fā)揮抗菌作用，或者對其他口腔細菌也產生相應的影響，進而調控口腔微生態(tài)的平衡，也需要進一步的研究。

不同的SERMs抑菌作用明顯不同，可能是由于其化學結構的不同?？肆_米芬、他莫昔芬和托瑞米芬對變異鏈球菌有良好的抗菌活性。它們都是三苯乙烯類衍生物。雖然目前尚不能確定三苯乙烯的結構是否與其抗菌活性有關，但據(jù)報道[27]，三苯乙烯結構的變化會顯著影響其抗感染活性。也有研究[28]記錄了三苯乙烯通過干擾鈣的穩(wěn)態(tài)達到了抗真菌作用。需要進一步的實驗確定這些藥物的抗菌機制與此結構有關，也可能通過修飾三苯基乙烯類藥物上的基團來合成更適合抑制細菌生長的藥物。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。