龍利娜，鐘文蔚，周 丹，郭立瑋，聶 紅*

基于藥效權(quán)重評(píng)價(jià)的杜仲葉-刺五加復(fù)方“濕法超微提取-膜澄清耦合”工藝篩選研究

龍利娜1, 2，鐘文蔚3*，周 丹1, 2，郭立瑋3, 4, 5，聶 紅1, 2*

1. 暨南大學(xué)藥學(xué)院 中藥藥效成分及新藥研究廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632 2. 中國教育部中藥現(xiàn)代化與創(chuàng)新藥物開發(fā)國際合作實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632 3. 廣州百奧格林生物科技有限公司，廣東 廣州 511455 4. 中藥制藥過程技術(shù)與新藥創(chuàng)制國家工程研究中心，廣東 廣州 510240 5. 廣州達(dá)原中藥膜科研技術(shù)工作室，廣東 廣州 510091

基于對(duì)濕法超微粉碎提取與膜澄清耦合工藝的研究，用細(xì)胞存活率及細(xì)胞上清液中炎癥因子水平篩選提取工藝，并以杜仲葉-刺五加提取液的免疫、抗炎效應(yīng)對(duì)所篩選的工藝進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)杜仲葉-刺五加提取液的體外抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選杜仲葉與刺五加的比例、提取方法（傳統(tǒng)熱回流提取工藝和濕法超微粉碎提?。穹ǔ⒎鬯樘崛r(shí)間和膜澄清耦合的影響等提取條件，用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，并分析杜仲葉與刺五加提取物對(duì)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖和抗炎活性的影響。以免疫調(diào)節(jié)和抗炎藥理效應(yīng)篩選的杜仲葉-刺五加提取的2種工藝產(chǎn)物表明，濕法超微粉碎提取工藝優(yōu)于傳統(tǒng)熱回流方法提取，該工藝下的杜仲葉-刺五加提取液對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥具有良好的抑制作用，可降低炎癥細(xì)胞上清液中一氧化氮（nitric oxide，NO）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6水平，能降低M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達(dá)，增加M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Arginase表達(dá)，增加M1型和M2型巨噬細(xì)胞的吞噬作用。通過濕法超微粉碎提取與膜澄清耦合制備的杜仲葉-刺五加提取液可以調(diào)節(jié)炎癥過程中的相關(guān)細(xì)胞因子，從而產(chǎn)生積極的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。在體外抗炎實(shí)驗(yàn)的藥效權(quán)重評(píng)價(jià)基礎(chǔ)上，驗(yàn)證了濕法超微粉碎提取與膜澄清耦合可以對(duì)杜仲葉-刺五加進(jìn)行有效提取，為中藥新藥研發(fā)中綠色提取技術(shù)應(yīng)用方面提供了新思路。

杜仲葉；刺五加；濕法超微粉碎提??；微濾膜澄清；抗炎；藥效權(quán)重評(píng)價(jià)

杜仲葉為杜仲科植物杜仲Oliv.的干燥葉，于夏、秋季采摘、干燥，可藥食兩用。杜仲葉是辛溫之品，歸屬肝經(jīng)和腎經(jīng)，可溫補(bǔ)肝腎、強(qiáng)健筋骨[1]。其原植物杜仲珍稀瀕危，是唯一沒有同科同屬同種植物的第三紀(jì)孑遺植，被劃為我國二級(jí)保護(hù)樹種名錄[2]。刺五加為五加科植物刺五加(Rupr. et Maxim.) Harms的干燥根和根莖或莖，屬于辛溫之品，歸心、脾、腎3經(jīng)，集補(bǔ)脾腎、安神為一體，臨床治脾氣不足、體虛者，或肺腎兩虛、腎虛者，心脾不足、難入眠者[3]。刺五加應(yīng)用廣泛，歷史悠久，是一種具有抗疲勞作用的功能性食品[4-5]和免疫調(diào)節(jié)劑[6]。

濕法超微粉碎提取是將溶劑（水或其他液體）與藥物一同投入，溶劑在粉碎破壞藥物結(jié)構(gòu)的同時(shí)快速進(jìn)入內(nèi)部，以致在超微粉碎破壞結(jié)構(gòu)作用下，更有利于藥物成分的溶出，提高其提取率。該技術(shù)具有提取時(shí)間短且效率高的優(yōu)勢(shì)，可以更好地保護(hù)藥物的藥效[7-9]。中藥材的提取工藝與藥效作用密切相關(guān)，不同提取方法會(huì)導(dǎo)致提取物中藥效成分存在差異，而不同成分作用于不同的疾病靶點(diǎn)，往往表現(xiàn)出不同的藥理作用[10]。研究者采用濕法超微粉碎提取對(duì)懷菊花中總黃酮的提取進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不僅提取時(shí)間短，而且得率高和有效成分破壞少[11]。張小利等[12]研究了超微粉碎對(duì)香菇多酚組成及抗氧化活性的影響，結(jié)果表明超微粉碎能夠提高香菇多酚的溶出率和抗氧化活性；超微粉碎可以提高鐵皮石斛粉末的生物可接受率和抗氧化活性[13]。

藥效權(quán)重評(píng)價(jià)一般指基于不同藥理學(xué)指標(biāo)的權(quán)重，結(jié)合多因素、多指標(biāo)對(duì)綜合藥效進(jìn)行效果評(píng)價(jià)[14]。中藥化學(xué)成分具有多靶點(diǎn)特性，不同成分作用不同靶點(diǎn)，單一評(píng)價(jià)某一成分高低對(duì)中藥制藥工藝篩選反而會(huì)適得其反。因此利用藥效結(jié)果評(píng)價(jià)產(chǎn)物質(zhì)量，可以為中藥制藥工藝優(yōu)化提供新方法。從生理角度出發(fā)，重要的機(jī)體調(diào)節(jié)離不開巨噬細(xì)胞的參與[15]。且在指導(dǎo)調(diào)節(jié)固有免疫中，大多數(shù)免疫調(diào)節(jié)均有巨噬細(xì)胞的參與，并參與炎癥的應(yīng)答反應(yīng)[16]。巨噬細(xì)胞因內(nèi)在或外在的各種刺激而過度活化，會(huì)產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，如一氧化氮（nitric oxide，NO）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等[17]，從而使炎癥細(xì)胞被激活并維持免疫反應(yīng)。激活的巨噬細(xì)胞也可引發(fā)感染性休克和炎癥性疾病等嚴(yán)重的危害[18]。因此，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化可能會(huì)有利于許多炎癥性疾病的治療。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）能夠激活巨噬細(xì)胞，可誘導(dǎo)小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7的炎癥反應(yīng)[19]。核因子被激活后，釋放炎癥因子，活性氧含量升高，使得機(jī)體氧化與抗氧化之間存在差異[20]，從而導(dǎo)致機(jī)體損傷。細(xì)菌性損傷類疾病是由機(jī)會(huì)致病菌（條件致病菌）所引起的傳染病或感染性疾病，嬰幼兒、老人免疫低下，易于感染[21]，炎癥、免疫與微生物群3者存在著相對(duì)密切的調(diào)控通路網(wǎng)絡(luò)[22]。

本研究對(duì)不同條件下制備的杜仲葉-刺五加提取液進(jìn)行藥理研究，通過對(duì)RAW264.7細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)前后的炎癥免疫因子進(jìn)行評(píng)價(jià)，確認(rèn)基于濕法超微粉碎提取與膜澄清耦合工藝的條件。此外，在選擇的提取工藝下制備杜仲葉-刺五加中藥復(fù)方提取液，并探究其抗炎和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究提出了基于藥效權(quán)重的提取方法和膜過程耦合的目標(biāo)產(chǎn)物質(zhì)量評(píng)價(jià)新方法，為中藥研發(fā)中新工藝的選擇和膜澄清的應(yīng)用提供新思路。

1 材料

1.1 細(xì)胞

RAW264.7細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科學(xué)有限公司。

1.2 藥材

杜仲葉于2019年7月采自江西井岡山，刺五加根于2020年秋季采自吉林長白山，經(jīng)中藥制藥過程技術(shù)與新藥創(chuàng)制國家工程中心郭立瑋教授鑒定分別為杜仲科植物杜仲Oliv.的干燥葉、五加科植物刺五加(Rupr. et Maxim.) Harms的干燥根。

1.3 藥品與試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)8121524）、胎牛血清（批號(hào)1932594C）、PBS溶液（批號(hào)8120118）和P/S（批號(hào)C12703955）購自美國Gibco公司；MTT（批號(hào)20190401）購自美國Amresco公司；左旋硝基精氨酸[-NAME，能抑制一氧化氮合酶活性，半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值為70 μmol/L，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.07%]購自美國BCM公司；LPS、綠原酸對(duì)照品（批號(hào)C12826066，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、紫丁香苷對(duì)照品（批號(hào)C11489870，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自上海麥克林生化科技有限公司；IL-10（novoprotein，美國）；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible netric oxide synthase，iNOS）抗體、Arginase抗體、FITC二抗購自美國Affinity公司；Hoechst 33342染色試劑購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Triton X-100、牛血清白蛋白組分購自德國BioFROXX公司；NO、TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；磷酸、乙腈均為色譜級(jí)，水為超純水。

1.4 儀器

電子分析天平（美國奧豪斯公司）；低速離心機(jī)（美國貝克曼公司）；數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋（上海力辰邦西儀器科技公司）；HF90型培養(yǎng)箱（上海力辰科學(xué)儀器公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）；生物顯微鏡（日本Olympus公司）；FD-1-50型真空冷凍干燥設(shè)備（北京博醫(yī)康儀器公司）；干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器公司）；XFH-30CA型高壓滅菌設(shè)備（浙江新豐醫(yī)療器械公司）；混合分散系統(tǒng)Pilot Plant MC50型超微粉碎儀（Coruma公司）；0.2 μm微濾膜（天津科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）；WATERS e2695型高效液相色譜儀（HPLC，美國Waters公司）。

2 方法

2.1 杜仲葉-刺五加提取液的制備

2.1.1 加熱提取 依據(jù)老中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)方中杜仲葉-刺五加的比例（3∶4），設(shè)計(jì)了低、中、高比例的杜仲葉-刺五加提取液。稱取不同比例的杜仲葉、刺五加藥材粉末（杜仲葉∶刺五加＝3∶2、3∶4、3∶8，總質(zhì)量為200 g），加入粉末的10倍量純水，加熱提取1 h；濾過，濾渣加入粉末的8倍量純水，加熱0.5 h，濾過，合并濾液，于?80 ℃冷凍后，冷凍真空干燥成凍干粉。

2.1.2 濕法超微粉碎提取 采用杜仲葉-刺五加的最佳比例（3∶2）稱取藥材，總質(zhì)量為200 g，加入10倍量純水，置于超微粉碎儀，10 000 r/min提取5或10 min，將離心后所得上清液經(jīng)200 nm陶瓷膜微濾澄清[9]，對(duì)澄清前和澄清后的液體分別進(jìn)行凍干。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和MTT檢測(cè)

于液氮中小心取出RAW264.7細(xì)胞，于37 ℃水浴中快速溶化，吸至滅菌離心管，1000 r/min離心5 min，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，于25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。

取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以2×105/mL接種于96孔板，100 μL/孔，加入LPS（0.5、1.0、2.0 μg/mL）孵育24 h；取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以2×105/mL接種于96孔板，100 μL/孔，加入含不同比例或不同工藝提取的杜仲葉-刺五加提取液的培養(yǎng)基，杜仲葉-刺五加提取液組及-NAME組（100 μmol/L）均預(yù)先給藥1 h，然后加入1 μg/mL LPS共孵育，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，觀察各組細(xì)胞生長狀況。每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），孵育4 h，棄上清，每孔加入150 mL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），避光振搖10 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)/對(duì)照

2.3 杜仲葉-刺五加提取液對(duì)M1型、M2型巨噬細(xì)胞表型的影響

通過免疫熒光法檢測(cè)M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物（分別為iNOS和Arginase）的表達(dá)。以LPS（10 ng/ml）刺激RAW264.7細(xì)胞48 h，極化為M1型巨噬細(xì)胞；以IL-10（10 ng/ml）刺激RAW264.7細(xì)胞48 h，使其極化為M2型巨噬細(xì)胞。將M1型和M2型細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，以1×106/mL接種于24孔板中，細(xì)胞貼壁后，加入含杜仲葉-刺五加提取液（10.0、1.0、0.1 μg/mL）的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，PBS溶液清洗2次；以4%多聚甲醛固定細(xì)胞，30 min后清洗3次；加入Triton X-100常溫孵育10 min，PBS清洗4次；加入5%牛血清蛋白常溫封閉30 min，M1型細(xì)胞加入iNOS抗體（1∶400），M2型細(xì)胞加入Arginase抗體（1∶400），4 ℃低溫過夜；清洗4次，加入PBS稀釋后的二抗（1∶100），37℃避光孵育1 h，清洗3次，每次3 min，加入Hoechst試劑染色細(xì)胞核，室溫避光孵育5 min；清洗3次，加入封片劑覆蓋，于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 杜仲葉-刺五加提取液對(duì)M1型、M2型巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

取處于對(duì)數(shù)生長期的極化M1型、M2型巨噬細(xì)胞，以2×105/mL接種至96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入含杜仲葉-刺五加提取液的培養(yǎng)基，每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌1次，加入中性紅染液，染液充分覆蓋細(xì)胞，靜置10 min，PBS清洗2次，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.5 上清液NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平檢測(cè)

取處于對(duì)數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以1×106/mL接種于24孔板中，500 μL/孔，加入含杜仲葉-刺五加提取液的培養(yǎng)基，每組4個(gè)復(fù)孔。收集各孔培養(yǎng)液，2000 r/min離心20 min，吸取上清液，按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定NO、IL-1β、IL-6和TNF-α水平。

2.6 HPLC分析[23-24]

2.6.1 色譜條件 Zorbax SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～12 min，4%～12% B；12～50 min，12%～14% B；體積流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長為277 nm；溫度為25 ℃。

2.6.2 對(duì)照品溶液的制備 綠原酸和丁香苷對(duì)照品以50%甲醇分別配制成質(zhì)量濃度為0.199 4、0.623 1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.6.3 供試品溶液的制備 將杜仲葉-刺五加提取液在50 ℃的烤箱中干燥24 h，然后分別取加熱提取樣品和濕法超微粉碎提取樣品10 mg，溶于2 mL 50%甲醇溶液中，進(jìn)樣分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié)果

3.1 RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的建立

如圖1所示，與對(duì)照組比較，3個(gè)質(zhì)量濃度（0.5、1.0、2.0 μg/mL）的LPS均能顯著降低RAW264.7細(xì)胞的存活率（＜0.05、0.001），其中LPS（1.0 μg/mL）組細(xì)胞存活率接近50%，因此選擇1.0 μg/mL的LPS進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ###P＜0.001

3.2 濕法超微粉碎提取與膜工藝中的參數(shù)對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率及上清液NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響

3.2.1 不同比例的杜仲葉-刺五加提取液對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率及上清液NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響 如圖2所示，與對(duì)照組比較，100 μg/mL杜仲葉-刺五加提取液（3∶2、3∶4、3∶8）及-NAME（100 μmol/L）均可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖（＜0.05、0.01、0.001）。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.001），上清液NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，杜仲葉-刺五加提取液（3∶2、3∶4、3∶8）組及-NAME組細(xì)胞存活率顯著升高（＜0.01、0.001），上清液NO和IL-6水平均顯著降低（＜0.001）；杜仲葉-刺五加提取液（3∶2）組細(xì)胞上清液TNF-α水平顯著降低（＜0.05）；杜仲葉-刺五加提取液（3∶2、3∶8）組和-NAME組細(xì)胞上清液IL-1β水平均顯著降低（＜0.05、0.001）。因此，以杜仲葉-刺五加（3∶2）為最佳比例進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

與對(duì)照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

3.2.2 不同提取方法的杜仲葉-刺五加提取液對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率及上清液NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響 如圖3所示，與對(duì)照組比較，加熱提取和濕法超微提取的杜仲葉-刺五加提取液均可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖（＜0.01、0.001）。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.001），上清液NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001）；與模型組比較，加熱提取和濕法超微提取的杜仲葉-刺五加提取液組及- NAME組細(xì)胞存活率顯著升高（＜0.01、0.001），上清液NO和IL-6水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）；濕法超微提取的杜仲葉-刺五加提取液組和-NAME組細(xì)胞上清液TNF-α和IL-1β水平顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖3 不同提取方法的杜仲葉-刺五加提取液對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率及上清液NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響(, n = 3)

盡管2種提取方法的杜仲葉-刺五加提取液對(duì)RAW264.7細(xì)胞的促增殖作用相當(dāng)，但是濕法超細(xì)微粉碎提取為中藥制劑提供了一個(gè)更綠色的選擇，它的操作時(shí)間更短，不需要加熱。此外，HPLC分析結(jié)果（圖4）顯示，用濕法超細(xì)微粉碎提取方法制備的杜仲葉-刺五加提取液中綠原酸和丁香苷的質(zhì)量濃度分別為1.330 0、0.0780 0 mg/mL，明顯高于傳統(tǒng)加熱回流提?。ňG原酸和丁香苷的質(zhì)量濃度分別為0.450 0、0.002 6 mg/mL）。

3.2.3 不同提取時(shí)間的杜仲葉-刺五加提取液對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率及上清液NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響 如圖5所示，與對(duì)照組比較，濕法超微提取5 min或10 min的杜仲葉-刺五加提取液均對(duì)RAW264.7細(xì)胞有促進(jìn)生長趨勢(shì)，但無明顯差異。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.001），上清液NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高（＜0.05、0.001）；與模型組比較，濕法超微提取5 min或10 min的杜仲葉-刺五加提取液組及-NAME組細(xì)胞存活率顯著升高（＜0.05、0.001），上清液NO和IL-6水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）；濕法超微提取10 min的杜仲葉-刺五加提取液組和-NAME組細(xì)胞上清液TNF-α和IL-1β水平顯著降低（＜0.05、0.01）。因此，以濕法超微提取10 min為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

1-紫丁香苷 2-綠原酸

圖5 不同提取時(shí)間的刺五加-杜仲葉提取液對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率及上清液NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響(, n = 3)

3.2.4 采用0.2 μm微濾膜澄清工藝的杜仲葉-刺五加提取液對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率及上清液NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響 如圖6所示，與對(duì)照組比較，經(jīng)過0.2 μm微濾膜澄清前后，細(xì)胞存活率均顯著升高（＜0.05、0.001）。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.001），上清液NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001）；與模型組比較，膜澄清前后的杜仲葉-刺五加提取液組及-NAME組細(xì)胞存活率顯著升高（＜0.001），上清液NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），但膜澄清處理后的杜仲葉-刺五加提取液抑制作用優(yōu)于澄清前。

圖6 采用0.2 μm微濾膜澄清工藝的杜仲葉-刺五加提取液對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率及上清液NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響(, n = 3)

3.3 杜仲葉-刺五加提取液的劑量篩選

如圖7所示，與對(duì)照組比較，杜仲葉-刺五加提取液（100、10、1、0.1 μg/mL）組細(xì)胞存活率均顯著升高（＜0.01）。與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著降低（＜0.001），上清液NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高（＜0.01、0.001）；與模型組比較，杜仲葉-刺五加提取液（10、1 μg/mL）組細(xì)胞存活率顯著升高（＜0.01、0.001），上清液IL-1β水平顯著降低（＜0.05、0.01）；杜仲葉-刺五加提取液（100、10、1、0.1 μg/mL）組和-NAME組細(xì)胞上清液NO和TNF-α水平顯著降低（＜0.01、0.001）；杜仲葉-刺五加提取液（1 μg/mL）組細(xì)胞上清液IL-6水平顯著降低（＜0.01）。

3.4 杜仲葉-刺五加提取液對(duì)促炎和抗炎型細(xì)胞的影響

3.4.1 杜仲葉-刺五加提取液對(duì)M1型、M2型巨噬細(xì)胞表型的影響 如圖8所示，在LPS極化的M1型巨噬細(xì)胞中，加入杜仲葉-刺五加提取液后綠色熒光物減少，表明杜仲葉-刺五加可降低其標(biāo)志物iNOS的表達(dá)。在IL-10極化的M2型細(xì)胞中，加入1 μg/mL杜仲葉-刺五加提取液后綠色熒光增多，表明杜仲葉-刺五加可顯著增加其標(biāo)志物Arginase的表達(dá)。

3.4.2 杜仲葉-刺五加提取液增加M1型、M2型巨噬細(xì)胞的吞噬能力 在普通倒置顯微鏡（圖9-A）和熒光顯微鏡（圖9-B）下可觀察到杜仲葉-刺五加組染色數(shù)量增加，說明杜仲葉-刺五加可顯著增加M1型和M2型巨噬細(xì)胞的吞噬作用。

圖7 不同質(zhì)量濃度的杜仲葉-刺五加提取液對(duì)RAW264.7細(xì)胞對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率及上清液NO、TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影響(, n = 3)

圖8 杜仲葉-刺五加提取液對(duì)M1型、M2型巨噬細(xì)胞表型的影響

4 討論

中藥的工藝研究是中藥現(xiàn)代化發(fā)展的根本條件，將我國瑰寶中藥傳承是每一個(gè)藥物研究者的責(zé)任。本研究結(jié)果顯示，采用濕法超微粉碎提取與膜澄清耦合能在提高效率的同時(shí)，提高杜仲葉-刺五加復(fù)方提取物的活性。采用濕法超微粉碎提取及膜澄清后，杜仲葉-刺五加提取液的免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌能力增強(qiáng)，說明濕法超微粉碎提取和膜澄清用于中藥的提取分離效果較好，且操作簡單、省時(shí)。以往的研究證明，從傳統(tǒng)技術(shù)到新興技術(shù)，工藝研究的發(fā)展發(fā)生了很大的改變[25]。在很多工藝優(yōu)化研究中，通過改變條件可以提高中藥中有效成分的提取率[26]，發(fā)現(xiàn)中藥新的有效成分[27]或藥理作用[28]，也給中藥制劑的研究提供了基礎(chǔ)[29]。

LPS是一種炎癥誘導(dǎo)體，過度刺激會(huì)造成機(jī)體受損，可與巨噬細(xì)胞表面抗原識(shí)別受體相結(jié)合而刺激細(xì)胞，繼而激活多條炎癥通路，產(chǎn)生一系列促炎因子，引起機(jī)體嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[30-31]。LPS能誘導(dǎo)NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等因子的產(chǎn)生[32]。NO是炎癥介質(zhì)的一員[33]，能引起DNA損傷，在免疫和炎癥中都有介導(dǎo)作用[34]。機(jī)體損傷可由TNF刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等機(jī)體細(xì)胞引起[35]。炎癥因子IL-6作用于中性粒細(xì)胞，其含量升高引發(fā)病理反應(yīng)，為炎癥檢測(cè)的重要指標(biāo)[36]。IL-1β也被稱成炎性痛覺過敏因子[37]，其含量升高會(huì)造成炎癥反應(yīng)[38]。本研究結(jié)果顯示，杜仲葉-刺五加提取液能夠抑制炎癥細(xì)胞上清液中的炎癥分泌物水平，從而減緩炎癥。

A-普通倒置顯微鏡下圖 B-熒光顯微鏡下圖

在一定條件下，巨噬細(xì)胞經(jīng)過適度增殖，可提高機(jī)體防御能力以及對(duì)受損機(jī)體組織的修復(fù)能力，但細(xì)胞增殖應(yīng)適當(dāng)，無節(jié)制的刺激會(huì)造成細(xì)胞發(fā)生負(fù)向的免疫反應(yīng)，最終細(xì)胞過度凋亡，以致?lián)p傷機(jī)體[39]。吞噬能力是能將外入病原體、正常衰老以及其他無關(guān)細(xì)胞進(jìn)行吞噬，從而使機(jī)體對(duì)外界的抵抗力增強(qiáng)，是巨噬細(xì)胞被用來衡量活性的一個(gè)重要指標(biāo)[40]。巨噬細(xì)胞是機(jī)體關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，機(jī)體組織修復(fù)及再生離不開巨噬細(xì)胞[41]。與有輔助功能的T細(xì)胞類似，在特定的條件下巨噬細(xì)胞可發(fā)生一定的轉(zhuǎn)變，2000年Mills等[42]將其劃分為M1型和M2型。M1型巨噬細(xì)胞是巨噬細(xì)胞經(jīng)γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、LPS誘導(dǎo)分化，而M2型巨噬細(xì)胞是巨噬細(xì)胞經(jīng)IL-4、IL-10等誘導(dǎo)分化[43]。M1型巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子是驅(qū)動(dòng)炎癥的主要因素，也是對(duì)外反應(yīng)和發(fā)生適應(yīng)性免疫的條件；M2型巨噬細(xì)胞的分泌物能夠幫助機(jī)體修復(fù)[44]。Mills等[45]發(fā)現(xiàn)M1型和M2型巨噬細(xì)胞與人類許多疾病相關(guān)。因此，維持2者之間的穩(wěn)態(tài)非常重要。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)杜仲葉-刺五加提取液對(duì)M1型和M2型巨噬細(xì)胞具有調(diào)節(jié)作用，為后續(xù)研究提供一定參考。

免疫調(diào)節(jié)復(fù)雜多樣，杜仲葉-刺五加提取液的活性成分可能發(fā)揮了協(xié)同作用，從而抗炎和調(diào)節(jié)免疫。中藥的工藝優(yōu)化研究對(duì)于實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化和標(biāo)準(zhǔn)化的最終目標(biāo)至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，與加熱提取法相比，濕法超細(xì)微粉碎提取與膜澄清耦合可以在較短的時(shí)間內(nèi)制備出具有更強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)和抗炎活性的杜仲葉-刺五加復(fù)方提取物，對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7炎癥細(xì)胞模型中炎癥因子的抑制作用更強(qiáng)。本研究確認(rèn)了濕法超細(xì)微粉碎提取和膜澄清耦合在中藥綠色制造中的前景，基于藥效權(quán)重的理念可為中藥新藥開發(fā)中工藝設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供一個(gè)可靠的評(píng)價(jià)手段。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on process screening for-etseuvia evaluation of medicinal efficacy weighting using wet ultra-micro pulverization extraction and membrane clarification

LONG Li-na1, 2, ZHONG Wen-wei3, ZHOU Dan1, 2, GUO Li-wei3,4, 5, NIE Hong1, 2

1. Guangdong Province Key Laboratory of Pharmacodynamic Constituents of TCM and New Drugs Research, College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China 2. International Cooperative Laboratory of Traditional Chinese Medicine Modernization and Innovative Drug Development of Chinese Ministry of Education (MOE), College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China 3. Guangzhou Bio-Green Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou 511455, China 4. National Engineering Research Center of Pharmaceutical Processing Technology of Traditional Chinese Medicine and Drug Innovation, Guangzhou 510240, China 5. Guangzhou Dayuan Studio of Membrane Science and Technology for Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510091, China

To screen the extraction process by cell viability and expression of inflammatory substances in cell culture fluid based on the research of wet ultra-micro pulverization extraction (WUPE) coupled with membrane clarification, and the extracts of Duzhongye (, EF) and Ciwujia (etseu, AS) under the best process were investigated for immune and anti-inflammatory effects.Based on the results of cellular pharmacological experiments of extracts, the extraction conditions concerning the drug ratio of EF and AS, the choice of extraction method (comparing the extracts obtained by traditional hot reflux extraction process with those obtained by wet ultra-fine micronization extraction process), the effect of extraction time of wet ultra-fine micronization and clarification coupling by microfiltration were screened; Cell viability was determined by MTT method; Effects of EF and AS extracts on proliferation and anti-inflammatory activity of RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide (LPS) were investigated.The products of two processes of EF-AS extract screened for immunomodulatory and anti-inflammatory pharmacological effects showed that wet ultra-micronized extraction process was superior to the traditional hot reflux method of extraction, EF-AS extract had a good inhibitory effect on inflammation of RAW264.7 cells induced by LPS, decreased the levels of nitric oxide (NO), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and IL-6 in the supernatant of inflammatory cells, decreased M1-like cells marker inducible nitric oxide synthase (iNOS) expression, increased M2-like cells marker Arginase expression, increased the phagocytosis of M1- and M2-like cells.EF-AS extract prepared by wet ultra-fine pulverization extraction and membrane clarification could modulate cytokines in the inflammatory process, resulting in positive immunomodulatory and anti-inflammatory effects. Based on the evaluation of the pharmacological efficacy weights of thepharmacological experimental results, the effective extraction of EF-AS based on coupling of wet ultra-fine pulverization extraction and membrane clarification was verified, which can provide a green manufacturing extraction technology and new ideas for the future development of new Chinese medicines.

;etseu; wet ultra-fine comminution extraction; microfiltration membrane clarification; anti-inflammation; evaluation of medicinal efficacy weighting

R285.5

A

0253 - 2670(2022)07 - 2053 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.07.014

2022-02-08

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81861138042）

龍利娜，碩士研究生，從事中藥藥理學(xué)研究。E-mail: 2595740610@qq.com

鐘文蔚，博士后，主要研究方向?yàn)榉礉B透與膜蒸餾濃縮、中藥制藥工程。E-mail: wenwei.rachel.zhong@hotmail.com

聶 紅，教授，從事中藥藥理學(xué)研究。E-mail: hongnie1970@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]