張 凡，張宇帆，蘇心悅，徐文雅，安煥炯，馬倩云，孫劍鋒，王 頡，王文秀

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

馬鈴薯是世界第四大農(nóng)作物，既可以作為食物，又可以作為高質(zhì)量淀粉的重要來源[1]。其適應(yīng)能力強(qiáng)，產(chǎn)量高，種植面積廣，是飲食中碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)的良好來源[2]。在貯藏過程中，馬鈴薯極易受到鐮刀菌的侵染而發(fā)生干腐病，導(dǎo)致其塊莖不斷脫水干縮，內(nèi)部出現(xiàn)空腔、凹陷和腐爛，廣泛分布在世界馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)并造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，目前已成為馬鈴薯貯藏期間的重要病害之一[3]。隨著鐮刀菌侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，不僅表面和內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，還會(huì)散發(fā)出與正常馬鈴薯不同的氣味。這些揮發(fā)性氣體物質(zhì)的產(chǎn)生，與鐮刀菌在馬鈴薯上生長(zhǎng)代謝，引起其自身化合物的降解密切相關(guān)。近年來，隨著智能傳感器系統(tǒng)的不斷發(fā)展，氣味信號(hào)作為樣品的“氣味指紋標(biāo)記”，已在果蔬的病害監(jiān)控方面發(fā)揮了重要的作用[4-5]。辨識(shí)干腐病馬鈴薯的特異性氣味，對(duì)于實(shí)現(xiàn)其早期診斷識(shí)別具有重要意義。

馬鈴薯在貯藏和腐敗過程中揮發(fā)性氣體成分多樣，不穩(wěn)定性強(qiáng)，反應(yīng)復(fù)雜，難以跟蹤其變化[6]。目前，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和氣相離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）技術(shù)是分析揮發(fā)性化合物中常用的技術(shù)手段。其中，頂空GC-IMS（headspace-GC-IMS，HS-GC-IMS）是近幾十年發(fā)展起來的一種用于檢測(cè)、識(shí)別和監(jiān)測(cè)不同基質(zhì)中痕量有機(jī)化合物的技術(shù)[7]，具有靈敏度高、定性分析準(zhǔn)確、樣品制備簡(jiǎn)單的特點(diǎn)[8-9]。目前已在酒類[10-11]、果蔬[12-14]、肉類[15-16]等物質(zhì)的風(fēng)味成分分析方面有所應(yīng)用，此外在羊肉摻假[17]、山茶油摻假[18]、化妝品品質(zhì)鑒定[19]、中藥材品種區(qū)分及成分鑒定[20-21]等方面也有所研究。然而將HSGC-IMS技術(shù)用于干腐病馬鈴薯特異性揮發(fā)性成分分析的研究鮮有報(bào)道。

針對(duì)上述問題，本研究以健康和不同病害程度的干腐病馬鈴薯為實(shí)驗(yàn)原料，采用HS-GC-IMS技術(shù)對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）和指紋圖譜技術(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，全面比較不同腐敗程度馬鈴薯樣品中揮發(fā)性成分之間的差異，辯識(shí)干腐病馬鈴薯特異性揮發(fā)性成分，為基于氣味指紋圖譜信息的干腐病馬鈴薯的診斷識(shí)別提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大西洋馬鈴薯，由河北省張家口市弘基農(nóng)業(yè)科技開發(fā)責(zé)任有限公司提供。

95%乙醇、85%磷酸、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；淀粉試劑盒、丙二醛試劑盒 上海優(yōu)選生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR423CN電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；HH-4水浴鍋 上海比朗儀器有限公司；20 mL頂空進(jìn)樣瓶 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；FlavourSpec?風(fēng)味分析儀 山東海能科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備與處理

以張家口地區(qū)干腐病馬鈴薯為對(duì)象，經(jīng)組織分離及單孢純化后獲得接骨木鐮刀菌菌種，并將其在無菌環(huán)境下配制成濃度為106CFU/mL孢子菌懸液備用。

挑選表皮無任何明顯病害、外觀整齊、大小一致、表面光滑的馬鈴薯進(jìn)行菌懸液的接種。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，將馬鈴薯清洗干凈，再用75%的乙醇溶液擦拭表面，最后用蒸餾水沖洗，置于室溫下自然晾干備用。在健康馬鈴薯表皮上制作3 個(gè)小孔，隨之將10 μL鐮刀菌的孢子菌懸液注射入孔內(nèi)進(jìn)行真菌侵染，從而產(chǎn)生馬鈴薯干腐病。為保證馬鈴薯干腐病發(fā)生，將制作的樣品放置到人工氣候箱中貯藏，其環(huán)境始終保持為24～25 ℃，相對(duì)濕度為90%。為獲取不同腐敗程度馬鈴薯樣品，每隔7 d對(duì)3 個(gè)樣品進(jìn)行接種，并置于人工氣候箱中培養(yǎng)，至第21天時(shí)不接種，此時(shí)可獲得健康、輕度腐敗、中度腐敗和重度腐敗的馬鈴薯樣品用于HS-GC-IMS分析，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。健康、輕度腐敗、中度腐敗、重度腐敗的樣品分別表示為Jian-n、Qing-n、Medium-n、Zhong-n，n為樣品標(biāo)號(hào)。

1.3.2 頂空進(jìn)樣條件

稱取待測(cè)樣品5 g置于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，封口。90 ℃孵育30 min后進(jìn)樣，進(jìn)樣針溫度為85 ℃，進(jìn)樣體積為100 μL。

1.3.3 GC-IMS條件

MXT-5色譜柱（15 m×0.53 mm，4 μm）；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min，柱溫60 ℃，所用載氣為N2，IMS溫度45 ℃，運(yùn)行分析時(shí)間20 min。載氣流量梯度設(shè)置：初始流速2 mL/min，保持2 min；2～10 min內(nèi)線性升至10 mL/min；10～20 min內(nèi)線性升至100 mL/min后停止。

1.3.4 理化指標(biāo)的測(cè)定

可溶性蛋白質(zhì)：采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法[22]進(jìn)行測(cè)定。

丙二醛含量測(cè)定：參照丙二醛含量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，其中丙二醛含量按式（1）計(jì)算：

式中：V1為反應(yīng)體系總體積（8×10－4L）；V2為加入樣品體積（0.2 mL）；V3為加入提取液體積（1 mL）；ε為丙二醛摩爾吸光系數(shù)（155×103L/（mol?cm））；d為比色皿光徑（1 cm）；W為樣品質(zhì)量/g，ΔA為A532－A600（吸光度）。

淀粉含量測(cè)定：參照淀粉含量檢測(cè)試劑盒法測(cè)定，按式（2）計(jì)算淀粉含量：

式中：C為稀釋倍數(shù)（25）；x為標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的淀粉質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為提取后體積（1.7 mL）；W為樣品鮮質(zhì)量/g。

對(duì)于以上指標(biāo)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次，最后求其平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用FlavourSpec?風(fēng)味分析儀內(nèi)置的NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對(duì)揮發(fā)性氣體物質(zhì)進(jìn)行定性分析；利用軟件的配置Reporter插件對(duì)比樣品之間的譜圖差異（二維俯視圖和差異譜圖）；利用Gallery Plot插件進(jìn)行指紋圖譜對(duì)比，用于比較不同樣品之間的揮發(fā)性氣體物質(zhì)差異；采用Dynamic PCA插件進(jìn)行樣品聚類分析；利用Origin2019b對(duì)不同腐敗程度樣品的化學(xué)成分變化進(jìn)行分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同腐敗程度樣品化學(xué)成分變化分析

在接骨木鐮刀菌侵染馬鈴薯的過程中，其含有的丙二醛、可溶性蛋白及淀粉含量會(huì)發(fā)生顯著變化。在植物處于衰老、干旱或腐敗等逆境時(shí)，組織或器官膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)產(chǎn)生丙二醛[23]，其含量與氧化程度呈正比。由圖1a可知，隨著腐敗程度的加深，丙二醛含量逐漸增大，表明接骨木鐮刀菌的侵入造成了細(xì)胞膜系統(tǒng)的破壞，從而導(dǎo)致膜氧化，最終產(chǎn)生了較多的丙二醛?？扇苄缘鞍踪|(zhì)是食用馬鈴薯營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的重要組成成分[24]，對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用。由圖1b可知，接骨木鐮刀菌的侵染誘導(dǎo)了馬鈴薯塊莖中可溶性蛋白含量的增加。在侵染初期（健康～輕度），可溶性蛋白質(zhì)含量升高的幅度較大，這個(gè)時(shí)期馬鈴薯塊莖中的可溶性蛋白快速積累可能與馬鈴薯對(duì)接骨木鐮刀菌產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，使塊莖內(nèi)各種防御酶被激活有關(guān)[25]。如圖1c所示，隨著腐敗程度的增大，淀粉含量急劇下降，可能是由于接骨木鐮刀菌侵染馬鈴薯過程中，為了自身生長(zhǎng)繁殖，對(duì)馬鈴薯內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行分解和消耗，從而導(dǎo)致淀粉含量的減少。

圖1 不同腐敗程度馬鈴薯樣品中化學(xué)成分含量變化Fig. 1 Changes in chemical components of potato samples with different degrees of dry rot

2.2 不同腐敗程度馬鈴薯GC-IMS分析

采用HS-GC-IMS對(duì)不同腐敗程度干腐病馬鈴薯樣品中的揮發(fā)性氣體物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。將三維GC-IMS譜圖投影到二維平面，得到GC-IMS二維俯視圖，直接對(duì)不同腐敗程度馬鈴薯樣品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行對(duì)比分析。如圖2a所示，背景顏色為藍(lán)色，方框最左側(cè)紅色豎線代表反應(yīng)離子峰，在其右側(cè)存在一些點(diǎn)，每一點(diǎn)都代表一種揮發(fā)性成分，顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越大。將某類樣品中某物質(zhì)最大的信號(hào)峰定義為100，據(jù)此比較其他樣品中該物質(zhì)信號(hào)峰的強(qiáng)度，分析每種揮發(fā)性成分信號(hào)峰的相對(duì)強(qiáng)度，從而推斷該揮發(fā)性成分在不同樣品中的相對(duì)濃度。由圖2可知，大多數(shù)信號(hào)出現(xiàn)在100～500 s的保持時(shí)間和1.0～1.7 ms的漂移時(shí)間，4 種不同腐敗程度馬鈴薯樣品揮發(fā)性成分存在較大差異。

為更加明顯比較不同樣品間的差異，采用差異對(duì)比模式選取其中一個(gè)樣品的譜圖作為參比，其他樣品的譜圖扣減參比。在參比物和分析物中濃度相同的揮發(fā)性成分，背景會(huì)呈現(xiàn)白色，藍(lán)色表示化合物的濃度小于參考值，紅色表示化合物的濃度大于參考值。本研究以健康樣品的譜圖為參考，與其他樣品的譜圖作扣減。如圖2b所示，隨著腐敗程度的加大，紅色區(qū)域越多，代表與健康樣品揮發(fā)性成分的濃度差異較大。

圖2 不同腐敗程度馬鈴薯GC-IMS二維譜圖Fig. 2 Two-dimensional GC-IMS spectra of potato samples with different degrees of dry rot

2.3 不同病害程度馬鈴薯揮發(fā)性成分定性分析

根據(jù)離子遷移時(shí)間及保留指數(shù)對(duì)樣品揮發(fā)性化合物進(jìn)行定性分析。采用和樣品相同的氣相條件測(cè)試正構(gòu)酮類（C4～C9）校準(zhǔn)液，建立保留指數(shù)（已知）和保留時(shí)間的校準(zhǔn)曲線，對(duì)于未知物質(zhì)，可通過其保留時(shí)間計(jì)算相應(yīng)的保留指數(shù)。通過GC-IMS庫（NIST 2014數(shù)據(jù)庫、IMS遷移時(shí)間數(shù)據(jù)庫）進(jìn)行匹配從而確定揮發(fā)性組分的種類。

圖3 4種腐敗程度樣品揮發(fā)性成分特征峰位置點(diǎn)Fig. 3 Position points of characteristic peaks of volatile components in potato samples with different degrees of dry rot

表1GC-IMS鑒定不同腐敗程度馬鈴薯的揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components in potato samples with different degrees of dry rot identified by GC-IMS

續(xù)表1

如圖3所示，圖中數(shù)字標(biāo)明樣品揮發(fā)性成分特征峰位置點(diǎn)，每個(gè)標(biāo)記點(diǎn)代表定性分析的一種具體揮發(fā)性成分。如表1所示，從不同腐敗程度馬鈴薯樣品中共檢測(cè)出43 種揮發(fā)性成分，包括醛類18 種、醇類9 種、酮類5 種、烯烴類5 種、酯類2 種、胺類2 種、呋喃類1 種、醚類1 種，其中某些物質(zhì)包括單體和二聚體。4 類樣品中共有的揮發(fā)性成分包括以下23 種：丙酮、異丁醛（單聚體）、異丁醛（二聚體）、2-甲基丁醛（單聚體）、2-甲基丁醛（二聚體）、3-甲基丁醛（單聚體）、3-甲基丁醛（二聚體）、2-庚酮、檸檬烯（單聚體）、檸檬烯（二聚體）、戊基呋喃、(E)-2-戊烯醛、正戊醛（單聚體）、正戊醛（二聚體）、2,3-丁二酮、2-丁酮、乙醛（單聚體）、乙醛（二聚體）、庚醛（單聚體）、庚醛（二聚體）、乙酸乙酯、α-水芹烯、(E)-辛烯；其中，健康樣品成分還包括：正戊醇（單聚體）、正戊醇（二聚體）、甲硫基丙醛（單聚體）、甲硫基丙醛（二聚體）、3-辛醇、苯甲醛、2-甲基丁醇（單聚體）、2-甲基丁醇（二聚體）、3-甲基丁醇（單聚體）、3-甲基丁醇（二聚體）；輕度腐敗樣品成分還包括：乙醇、庚醛（二聚體）、環(huán)己酮、正戊醇（單聚體）、正戊醇（二聚體）、甲硫基丙醛（單聚體）、甲硫基丙醛（二聚體）、3-辛醇、苯甲醛；中度腐敗樣品成分還包括：乙醇、庚醛（二聚體）、環(huán)己酮、丙胺、正戊醇（單聚體）、正戊醇（二聚體）、甲硫基丙醛（單聚體）、甲硫基丙醛（二聚體）；重度腐敗樣品成分還包括：二丙基二硫醚、苯乙烯、異丁醇、壬烯醛、乙醇、庚醛（二聚體）、環(huán)己酮、丙胺。結(jié)果表明馬鈴薯在腐敗過程中辛烯、α-水芹烯、環(huán)己酮、庚醛、乙醛含量不斷增加，且重度腐敗樣品中產(chǎn)生了二丙基二硫醚、苯乙烯、異丁醇、壬烯醛成分。

2.4 揮發(fā)性成分指紋圖譜對(duì)比

圖4 馬鈴薯樣品的揮發(fā)性成分指紋圖譜Fig. 4 Fingerprint of volatile components in potato samples

為更好地凸顯不同病害程度馬鈴薯樣品揮發(fā)性成分的差異，利用LAV軟件的GalleryPlot插件選取所有峰進(jìn)行指紋圖譜對(duì)比，結(jié)果如圖4所示。根據(jù)指紋圖譜可以看出每種樣品的完整揮發(fā)性成分信息以及樣品之間揮發(fā)性成分的差異。

由圖4可觀察到，馬鈴薯樣品腐敗程度增大過程中揮發(fā)性成分的變化：圖中2號(hào)區(qū)域物質(zhì)（戊醇、庚酮、3-辛醇、2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、苯甲醛、3-甲硫基丙醛和檸檬烯等）顯示揮發(fā)性成分在馬鈴薯健康時(shí)濃度最高，其可作為健康馬鈴薯的特征揮發(fā)性物質(zhì)；隨著馬鈴薯干腐病病害程度的增加，圖中1號(hào)區(qū)域物質(zhì)（丙酮、異丁醛、2-甲基丁醛和3-甲基丁醛等）的含量逐漸減?。涣硗?，圖中3號(hào)區(qū)域物質(zhì)在馬鈴薯輕度腐敗時(shí)濃度最高，包括(E)-2-戊醛、2-戊基呋喃、戊醛、2,3-丁二酮和丁酮等；其中4號(hào)區(qū)域物質(zhì)（己醛和乙醇等）為中度腐敗馬鈴薯樣品的特征揮發(fā)性物質(zhì)。圖中5號(hào)區(qū)域物質(zhì)（正丙醇、庚醛、環(huán)己酮、乙酸乙酯、二丙基二硫、2-甲基-1-丙醇、苯乙烯、α-水芹烯、(E)-2-辛醛和(E)-2-壬醛等）顯示揮發(fā)性物在馬鈴薯腐敗嚴(yán)重時(shí)濃度最高。以上研究結(jié)果表明，馬鈴薯干腐病的腐敗程度將直接影響揮發(fā)性成分的含量變化，其中辛烯、α-水芹烯、環(huán)己酮、庚醛、乙醛含量的增大代表了樣品干腐病的腐敗程度加深。

2.5 動(dòng)態(tài)PCA

PCA是一種基于多元統(tǒng)計(jì)的檢測(cè)方法，能將高維數(shù)組進(jìn)行維度壓縮，從而保留數(shù)據(jù)大量信息[26]。本研究以特征峰對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度值為參數(shù)變量，利用Dynamic PCA插件對(duì)不同腐敗程度馬鈴薯進(jìn)行PCA，實(shí)現(xiàn)不同樣品特征差異的可視化，結(jié)果如圖5所示。前2 個(gè)PC的貢獻(xiàn)率分別為55%和18%，且樣品在分布圖上占據(jù)了相對(duì)獨(dú)立的空間，可以看出健康樣品和中度、重度腐敗樣品的差異較大，與輕度腐敗樣品的風(fēng)味特征相對(duì)相似，但大部分也能明顯分離。

圖5 不同腐敗程度樣品的PCAFig. 5 PCA plot of potato samples with different degrees of dry rot

3 討 論

本研究利用HS-GC-IMS技術(shù)對(duì)健康和不同病害程度（輕度干腐病、中度干腐病、重度干腐病）馬鈴薯樣品中揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同類別樣品中含有的物質(zhì)種類及含量有所差異，不同腐敗程度樣品中檢測(cè)出的揮發(fā)性成分主要包括醛類、醇類、酮類、烯烴類、酯類、胺類、呋喃類、醚類等。其中醛類物質(zhì)占有較大比例，其主要由脂類成分降解產(chǎn)生[27]，其次是由美拉德反應(yīng)過程中氨基酸和糖類反應(yīng)生成的呋喃及吡嗪類物質(zhì)組成[28-30]。在接骨木鐮刀菌侵染新鮮馬鈴薯的過程中，隨著腐敗程度的加深，氣體物質(zhì)的成分發(fā)生改變，氣體物質(zhì)的種類增加，主要源于鐮刀菌的侵染造成了細(xì)胞膜系統(tǒng)的破壞，從而引起膜氧化，導(dǎo)致脂類物質(zhì)降解產(chǎn)生更多醛類成分，尤其丙二醛的含量急劇增加。另外，淀粉作為馬鈴薯主要營(yíng)養(yǎng)成分被消耗、分解成葡萄糖，而葡萄糖作為還原糖與氨基化合物（氨基酸和蛋白質(zhì)）發(fā)生美拉德反應(yīng)，從而導(dǎo)致更多氣體物質(zhì)的產(chǎn)生。馬鈴薯中含有的蛋白質(zhì)對(duì)氣體物質(zhì)的吸附作用一定程度上決定著馬鈴薯風(fēng)味品質(zhì)[31-32]。在接骨木鐮刀菌侵染馬鈴薯塊莖的過程中，可溶性蛋白質(zhì)為抵御接骨木鐮刀菌的侵染起到了抑制作用，隨著干腐病腐敗程度的增大，可溶性蛋白含量增加，所含有的辛烯、α-水芹烯、環(huán)己酮、庚醛、乙醛含量也增大，此現(xiàn)象主要源于蛋白質(zhì)對(duì)一些揮發(fā)性氣體物質(zhì)（酮類和醛類）具有一定促進(jìn)作用[33]。

4 結(jié) 論

本研究以健康和不同腐敗程度（輕度干腐病、中度干腐病、重度干腐?。R鈴薯樣品為研究對(duì)象，利用HSGC-IMS技術(shù)對(duì)樣品中揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定分析，通過測(cè)定離子漂移時(shí)間和離子峰值強(qiáng)度，對(duì)各組分進(jìn)行定性。結(jié)果表明，共檢測(cè)出43 種揮發(fā)性成分，主要包括醛類18 種、醇類9 種、酮類5 種、烯烴類5 種、酯類2 種、胺類2 種、呋喃類1 種、醚類1 種。采用指紋圖譜對(duì)不同腐敗程度樣品中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，得到每類樣品的完整揮發(fā)性成分信息以及樣品之間揮發(fā)性成分的差異。隨著干腐病病害程度的加劇，辛烯、α-水芹烯、環(huán)己酮、庚醛、乙醛含量逐漸增大，且重度腐敗樣品中產(chǎn)生二丙基二硫醚、苯乙烯、異丁醇、壬烯醛成分，以上可作為與鐮刀菌代謝產(chǎn)物有關(guān)的特異性氣味成分。本研究利用HS-GC-IMS技術(shù)對(duì)不同病害程度馬鈴薯進(jìn)行鑒別，辯識(shí)了干腐病馬鈴薯特異性揮發(fā)性成分，為基于氣味傳感信息實(shí)現(xiàn)馬鈴薯干腐病的診斷識(shí)別提供理論依據(jù)。