田小麗，李春生，陳勝軍,*，薛 勇，鄧建朝，潘 創(chuàng)，王悅齊

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003；2.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，國家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300；3.大連工業(yè)大學 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

在當今社會，隨著環(huán)境污染對食品安全造成越來越大的影響，食品安全的概念越來越深入人心。我國每年有關(guān)水產(chǎn)品“三魚兩藥”的質(zhì)量安全問題時有發(fā)生，其中孔雀石綠超標已成為影響水產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要因素之一，對人類健康造成嚴重威脅[1]?！?017年中國水產(chǎn)品質(zhì)量安全狀況研究報告》顯示，孔雀石綠是水產(chǎn)品經(jīng)營環(huán)節(jié)中不合格的主要原因之一，所占比例為77.3%，這與2016年經(jīng)營環(huán)節(jié)重點水產(chǎn)品專項檢查的結(jié)果基本一致，顯示出鮮活水產(chǎn)品中違法使用孔雀石綠的問題仍比較突出[2]。而且國外也有相關(guān)事件的發(fā)生，在售出的魚中有43%含有孔雀石綠或隱性孔雀石綠，近60%的魚樣品被孔雀石綠污染[3]?？傊褂每兹甘G后不僅會污染水體環(huán)境，造成水產(chǎn)品中孔雀石綠的超標，更會因為食物鏈的富集危害人體健康。因此，有效控制水產(chǎn)品中的孔雀石綠對于提高水產(chǎn)品安全性具有非常重要的意義。

傳統(tǒng)的物理化學方法，如吸附、化學氧化、沉淀、凝結(jié)、過濾、電解、光降解等，具有成本高昂、效率低下、通用性有限以及產(chǎn)生的中間產(chǎn)物需要二次處理等缺點[4-6]。因此，通常認為生物法是一種經(jīng)濟有效、環(huán)境友好的替代方法。近年來，許多研究集中在尋找一些能夠生物降解或生物吸附孔雀石綠的微生物上。這些微生物包括一些細菌[7-9]，如銅綠假單胞菌、大腸桿菌、黃體假單胞菌、嗜水氣單胞菌、微球菌等；真菌[10-14]，如黑曲霉菌、黃孢原毛平革菌、地曲霉菌、青霉菌等；酵母菌[15-17]，如釀酒酵母菌、熱帶假絲酵母菌、溶脂酵母菌等。這些微生物可通過合成漆酶、孔雀石綠還原酶、錳過氧化物酶、木質(zhì)素過氧化物酶等脫除孔雀石綠[18-21]。然而，目前針對Klebsiella pneumoniae通過何種酶和途徑對孔雀石綠進行脫色和降解還鮮有相關(guān)報道。

迄今為止，各種檢測方法已用于水產(chǎn)食品的安全性分析，主要包括分光光度法、薄層色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、傅里葉變換紅外光譜法和核磁共振波譜法等[22-23]。以前大部分選用分光光度法研究孔雀石綠的脫色效果，然而脫色可能只是孔雀石綠代謝成了隱性孔雀石綠，與降解不同，脫色后產(chǎn)生的隱性孔雀石綠危害更大，分光光度法只能檢測到孔雀石綠的含量，卻無法檢測到隱性孔雀石綠的含量，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖然快速靈敏，但是價格昂貴[24]。綜合考慮，本研究采用操作簡單、準確高效的硼氫化鉀還原高效液相色譜法測定微生物對孔雀石綠的降解情況。

有研究報道稱，孔雀石綠可以作為唯一的碳源被微生物利用，然而在葡萄糖、半乳糖、蔗糖的條件下對孔雀石綠降解的影響目前還缺乏相關(guān)的研究報道[25]。基于此，本研究以篩選出的高孔雀石綠降解能力菌株為研究對象，系統(tǒng)研究葡萄糖、半乳糖、蔗糖等碳源對孔雀石綠脫色和降解特性的影響，并對孔雀石綠降解過程進行分析，旨在為后期該菌株降解孔雀石綠的應用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

菌株WA-1，分離自廣東省佛山市順德某被孔雀石綠污染的水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘底泥中。

1.1.2 培養(yǎng)基

鹽培養(yǎng)基：NaCl 0.5 g/L，(NH4)2SO41.0 g/L，K2HPO41.5 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，pH 7.0。

LB液體培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，pH 7.0。

1.1.3 試劑

孔雀石綠標準品 上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司；孔雀石綠儲備液（1 g/L）用無菌超純水制備，所用其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SQ510C立式壓力蒸汽滅菌鍋 日本Yamato公司；ZQWY-200S振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；APX-320生化培養(yǎng)箱 寧波東南儀器廠；SW-CJ-IED超凈工作臺 江蘇蘇凈安泰公司；1110液相色譜儀 美國Agilent公司；UV3000PC紫外-可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 孔雀石綠降解菌的分離純化[26]

將1 g底泥加入到含有40 mg/L孔雀石綠的鹽培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至培養(yǎng)基中孔雀石綠顏色消失后，將孔雀石綠質(zhì)量濃度增加至80 mg/L，以體積分數(shù)2%的接種比例進行新一輪培養(yǎng)。然后通過不斷增加鹽培養(yǎng)基中孔雀石綠質(zhì)量濃度至100、200、300 mg/L，重復富集過程。在含有孔雀石綠質(zhì)量濃度為300 mg/L的鹽培養(yǎng)基平板上稀釋涂布篩選，挑取最大的變色圈菌落，多次劃線后篩選得到高效孔雀石綠降解菌株WA-1，保存到LB斜面。

1.3.2 菌株鑒定

通過16S rRNA基因序列分析對菌株WA-1進行分子生物學鑒定[27]。使用通用引物27 F（5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’）和1492 R（5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）擴增16S rRNA基因。分別對16S rRNA基因進行正向、反向和中間測序，然后將序列進行拼接，就可獲得16S rRNA基因的完整序列。將獲得的16S rRNA基因序列與從EzBio Cloud Database上篩選到的同屬、同種的16S rRNA基因序列進行整合。利用Align by Clustal W對序列進行對齊后，基于最大似然法，通過MEGA進行系統(tǒng)分析并通過使用具有1 000 次重復的自展值分析評估生成進化樹的可靠性，重復操作直至目標菌株位于合適位置。

利用VITEK 2 GN卡對菌株WA-1進行生理生化鑒定[28]。首先清潔塑料管中加入3 mL 0.85%無菌生理鹽水，挑取平板上已傳代培養(yǎng)的形態(tài)相同單菌落至鹽水塑料管，用已校正VITEK 2比濁儀配置相當于0.50～0.63麥氏單位的菌懸液，然后加入到VITEK 2 GN卡上進行檢測。生理生化反應結(jié)果采用法國梅里埃公司的全自動微生物鑒定系統(tǒng)（VITEK 2）進行分析。

1.3.3 菌株活化

取菌株及121 ℃、15 min滅菌后的培養(yǎng)基，勾取菌株完成劃線后于37 ℃培養(yǎng)24 h。將菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3.4 菌株對孔雀石綠的脫色和降解特性

分別取0、0.25、1、2 mL的儲備液于培養(yǎng)基中，配成孔雀石綠終質(zhì)量濃度分別為0、5、20、40 mg/L的鹽培養(yǎng)基。從LB培養(yǎng)基中取2 mL培養(yǎng)液于4 ℃、10 000 r/min離心15 min，菌體用無菌超純水洗一次，接種到分別添加0.5%葡萄糖、半乳糖或蔗糖的鹽培養(yǎng)基中，對照組不加菌，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h后取樣分析，測定添加不同碳源鹽培養(yǎng)基條件下菌株的生物量、孔雀石綠脫色率和降解率。

1.3.5 孔雀石綠生物量測定

為了確定菌株的生長，采用干質(zhì)量法測定菌株的生物量，將在不同實驗條件下取樣后的培養(yǎng)液10 000 r/min離心15 min，菌體用無菌超純水洗滌1 次，110 ℃烘至質(zhì)量恒定后稱質(zhì)量，計算生物量。

1.3.6 孔雀石綠脫色率測定

采用分光光度法[29]對孔雀石綠進行檢測。用無菌超純水將準確稱取的孔雀石綠標準品配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的標準儲備液，稀釋至0.1、1、5、10、20、30、40 mg/L等質(zhì)量濃度的溶液，設(shè)置最大吸收波長為620 nm，測定吸光度。依據(jù)孔雀石綠質(zhì)量濃度和吸光度對應數(shù)值繪制孔雀石綠標準曲線。

分別取8 mL不同實驗條件下的培養(yǎng)液，4 ℃、10 000 r/min離心15 min，取上清液在620 nm波長處測定吸光度，每種條件重復3 次，根據(jù)孔雀石綠標準曲線計算不同處理條件下培養(yǎng)液的孔雀石綠質(zhì)量濃度?？兹甘G脫色率的計算如式（1）所示：

式中：W為菌株孔雀石綠脫色率/%；S0為不接菌液的鹽培養(yǎng)基中孔雀石綠質(zhì)量濃度/（mg/L）；St為接入菌液的鹽培養(yǎng)基中孔雀石綠質(zhì)量濃度/（mg/L）。

1.3.7 孔雀石綠降解率測定

液相色譜條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫38 ℃；流動相采用乙腈和0.125 mol/L、pH 4.5的乙酸-乙酸銨緩沖溶液，兩者體積比為4∶1；流速1.5 mL/min；激發(fā)波長265 nm，發(fā)射波長360 nm；進樣量50 μL。

采用硼氫化鉀還原-高效液相色譜法[30]對孔雀石綠進行檢測。準確稱取孔雀石綠標準品，用乙腈配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的標準儲備液，加入0.2 mol/L的硼氫化鉀充分還原后，稀釋至0.002 5、0.05、0.25、0.5、1、2、4 mg/L等質(zhì)量濃度的工作溶液，0.22 μm膜過濾后進行高效液相色譜檢測。根據(jù)孔雀石綠質(zhì)量濃度和峰面積繪制孔雀石綠標準曲線。

分別取8 mL不同實驗條件下的培養(yǎng)液，4 ℃、10 000 r/min 離心15 min，取0.8 mL上清液，加入0.2 mol/L硼氫化鉀溶液40 μL，渦旋振蕩充分還原后，加入7.16 mL乙腈，0.22 μm濾膜后上高效液相色譜進行檢測，根據(jù)孔雀石綠標準曲線計算不同處理后培養(yǎng)液的孔雀石綠質(zhì)量濃度?？兹甘G降解率的計算如式（2）所示：

式中：R為菌株孔雀石綠降解率/%；C0為不接菌液的鹽培養(yǎng)基中孔雀石綠質(zhì)量濃度/（mg/L）；Ct為接入菌液的鹽培養(yǎng)基中孔雀石綠質(zhì)量濃度/（mg/L）。

1.3.8 孔雀石綠還原酶活力測定

WA-1在添加20 mg/L孔雀石綠的不同碳源鹽培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，10 000 r/min 離心15 min。取上清液作為粗酶液，加入20 mg/L的孔雀石綠進行反應，用分光光度法分析孔雀石綠的降解情況，孔雀石綠還原酶活力定義為37 ℃、pH 7條件下，10 min內(nèi)孔雀石綠減少的量[31]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

將菌株WA-1的16S rRNA基因序列在NCBI中進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株與多種克雷伯菌屬（Klebsiella）的菌株相似度較高。選擇到目前為止發(fā)表在EzBio Cloud Database中Klebsiella內(nèi)共18 種標準菌株的16S rRNA基因序列與WA-1的16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果如圖1所示，菌株WA-1的16S rRNA基因序列與K. pneumoniaesubsp.rhinoscleromatisATCC 13884T的距離最近，兩者同源性為99.51%。VITEK 2 GN卡鑒定結(jié)果如表1所示，WA-1菌株符合K. pneumoniae的典型性反應，相似度為99%。綜合分子生物學鑒定和生理生化鑒定結(jié)果，最終確定所分離的孔雀石綠降解菌株WA-1為K. pneumoniae，重新命名為K. pneumoniaeWA-1。

圖1 基于16S rRNA基因序列利用最大似然法構(gòu)建的菌株WA-1的系統(tǒng)進化樹Fig. 1 Phylogenetic tree for strain WA-1 constructed by maximum likelihood method based on 16S rRNA gene sequence

表1VITEK 2系統(tǒng)鑒定菌株WA-1的生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of WA-1 tested by VITEK 2 system

2.2 不同碳源對菌株在含孔雀石綠鹽培養(yǎng)基中生長的影響

圖2 不同碳源對菌株K. pneumoniaeWA-1在含孔雀石綠鹽培養(yǎng)基中生長的影響Fig. 2 Effects of different carbon sources on the growth of K. pneumoniae WA-1 in malachite green-containing salt medium

如圖2所示，加入葡萄糖、半乳糖、蔗糖等不同碳源時，菌株生物量均大于初始接種量，說明菌株能利用碳源進行生長。而在純鹽培養(yǎng)基條件下，菌株以孔雀石綠為唯一碳源時的生物量無顯著差異，均接近0.1 g/L，可能是因為培養(yǎng)基中碳源質(zhì)量濃度過低。在0～20 mg/L孔雀石綠質(zhì)量濃度條件下，蔗糖對菌體生物量的提高最大。隨著孔雀石綠質(zhì)量濃度逐漸上升至40 mg/L，葡萄糖對菌體的生物量逐漸增加，這表明高質(zhì)量濃度的孔雀石綠可能促進菌體對葡萄糖的利用，從而轉(zhuǎn)化成生物量；而以蔗糖為碳源時，生物量卻顯著下降，這表明高質(zhì)量濃度孔雀石綠可能抑制菌體對蔗糖的利用。以半乳糖為碳源時，不同質(zhì)量濃度孔雀石綠對菌株生物量無顯著影響。與本研究結(jié)果相似，添加葡萄糖等碳源能夠提高Pseudomonas aeruginosaNCIM在含有孔雀石綠鹽培養(yǎng)基中的生物量[32]。

2.3 不同碳源對菌株孔雀石綠生物脫色的影響

加菌前后培養(yǎng)基直觀的顏色變化可以看出，加菌前，培養(yǎng)基顏色隨著孔雀石綠質(zhì)量濃度的增加而逐漸加深；加菌后，4 種培養(yǎng)基均變?yōu)闊o色，說明菌株對孔雀石綠具有很強的生物脫色作用（圖3A）。在1～40 mg/L范圍內(nèi)，孔雀石綠質(zhì)量濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 7，表明分光光度法能夠準確評價菌株的孔雀石綠生物脫色作用。

圖3 不同碳源對K. pneumoniaeWA-1孔雀石綠脫色率和單位菌體孔雀石綠脫色量的影響Fig. 3 Effects of different carbon sources on decolorization rate and decolorization capacity of malachite green by K. pneumoniae WA-1

圖3 B～E結(jié)果發(fā)現(xiàn)，K. pneumoniaeWA-1對孔雀石綠具有很強的生物脫色作用。在不加碳源時，隨著孔雀石綠質(zhì)量濃度不斷增加，孔雀石綠脫色率有所下降，但是脫色率仍能達到99%。這樣的孔雀石綠脫色效果在其他已報道菌株中很難達到：在鹽培養(yǎng)基中，菌株P(guān)andoraea pulmonicolaYC32在30 min內(nèi)對10 mg/L孔雀石綠的脫色率只有25%[33]；Pseudomonas aeruginosaNCIM 2074在孔雀石綠質(zhì)量濃度為50 mg/L的鹽培養(yǎng)基中脫色率僅有5%[32]。在添加葡萄糖、蔗糖、半乳糖后，孔雀石綠脫色率有所提高，均接近100%。有研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加碳源能顯著提高釀酒酵母菌對孔雀石綠的生物脫色作用：在蒸餾水中7 h內(nèi)孔雀石綠的脫色率為85%，而在添加5%葡萄糖的LB培養(yǎng)基中4 h內(nèi)孔雀石綠的脫色率超過95%[34]。

添加碳源后菌株孔雀石綠脫色能力的提高可能與生物量的提高有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中加入20 g/L的Coriolopsissp.在9 d內(nèi)對50 mg/L孔雀石綠的脫色率只有52%，而當增加到80 g/L時菌株在18 h內(nèi)的孔雀石綠脫色率達到70%[35]。在未添加碳源的鹽培養(yǎng)基中，隨著孔雀石綠質(zhì)量濃度的增加，單位菌體孔雀石綠脫色量逐漸增加，并且在40 mg/L時達到最高，為883.80 mg/g。添加碳源顯著降低單位菌體孔雀石綠脫色量，生物量提高是造成其下降的主要原因。

2.4 不同碳源對菌株孔雀石綠生物降解的影響

圖4 不同碳源對K. pneumoniae WA-1孔雀石綠降解率和單位菌體孔雀石綠降解量的影響Fig. 4 Effects of different carbon sources on the degradation rate and degradation capacity of malachite green by K. pneumoniae WA-1

從圖4A可以看到，其還原產(chǎn)物隱性孔雀石綠在8.509 min左右處具有最高峰，峰形對稱、尖銳，說明隱性孔雀石綠在此條件下具有較好的分離度。根據(jù)孔雀石綠質(zhì)量濃度與峰面積的標準曲線可知，在0.002 5～4 mg/L范圍內(nèi)，孔雀石綠質(zhì)量濃度與峰面積具有線性關(guān)系，標準曲線方程為y=417.47x＋12.172，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 6。

前期研究發(fā)現(xiàn)，K.pneumoniaeWA-1可以有效降解水溶液中的孔雀石綠，在0.5 h內(nèi)對1～20 mg/L孔雀石綠降解率為94%，在12 h內(nèi)對1～10 mg/L孔雀石綠降解率為100%[36]。如圖4B～E所示，菌株在鹽培養(yǎng)基中依然表現(xiàn)出很強的孔雀石綠降解能力，在24 h內(nèi)對5～40 mg/L孔雀石綠的降解率超過94.43%。與鹽培養(yǎng)基相比，葡萄糖、半乳糖、蔗糖等碳源的添加顯著抑制了菌株的孔雀石綠降解，特別是在低孔雀石綠質(zhì)量濃度（5 mg/L）時，其孔雀石綠降解基本完全抑制。

2.5 不同碳源對菌株孔雀石綠還原酶活力的影響

圖5 不同碳源的鹽培養(yǎng)基中孔雀石綠還原酶活力Fig. 5 Malachite green reductase in salt medium with different carbon sources

目前，針對孔雀石綠的生物降解機制研究，主要集中在與孔雀石綠脫色和降解相關(guān)的氧化酶和還原酶上[37-39]。本研究分析了添加不同碳源對K. pneumoniaeWA-1孔雀石綠還原酶活力的影響。如圖5所示，鹽培養(yǎng)基中孔雀石綠還原酶活力較高，達到54.93 U/mL。與孔雀石綠脫色效果變化相似，添加葡萄糖、半乳糖、蔗糖等碳源后孔雀石綠還原酶活力顯著增加，其中，添加蔗糖的酶活力最大，達到159.64 U/mL。研究表明，Ochrobactrumsp.主要通過細胞外分泌的孔雀石綠還原酶使孔雀石綠發(fā)生生物脫色作用[40]，這與本研究的結(jié)果一致。

2.6 不同碳源對菌株孔雀石綠脫色和降解的影響機制

綜合上述實驗結(jié)果，探究了不同碳源對菌株K. pneumoniaeWA-1孔雀石綠脫色和降解的影響機制（圖6）?？兹甘G還原為隱性孔雀石綠一般被認為是孔雀石綠降解的第1步反應[41-43]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，孔雀石綠首先在菌株分泌到細胞外的孔雀石綠還原酶作用下還原成隱性孔雀石綠。在純鹽培養(yǎng)基中，大量隱性孔雀石綠利用ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporter）通過主動運輸進入細胞，為了維持細胞正常生理代謝，隱性孔雀石綠作為唯一碳源被進一步降解和利用，從而表現(xiàn)出較高的脫色和降解效果。在添加葡萄糖、半乳糖、蔗糖等碳源后，菌株生物量和孔雀石綠還原酶活力的增加顯著增加了孔雀石綠脫色能力，然而由于競爭性轉(zhuǎn)運抑制的作用，隱性孔雀石綠轉(zhuǎn)運能力下降，菌株選擇更容易被分解的糖類，而對結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的隱性孔雀石綠需求下降，最終表現(xiàn)出菌株孔雀石綠降解率的顯著下降。

圖6 菌株K. pneumoniaeWA-1的孔雀石綠脫色和降解過程Fig. 6 Schematic illustration of decolorization and degradation of malachite green by K. pneumoniae WA-1

3 結(jié) 論

利用變色圈法篩選到1 株對孔雀石綠具有較強脫色和降解能力的細菌，經(jīng)過分子生物學和生理生化鑒定，確定該菌為K. pneumoniaeWA-1。與鹽培養(yǎng)基相比，添加葡萄糖、半乳糖、蔗糖等碳源時孔雀石綠（5～40 mg/L）的脫色率有所提高，均接近100%，這可能與菌株生物量和細胞外孔雀石綠還原酶活力提高有重要關(guān)系。菌株在鹽培養(yǎng)基中表現(xiàn)出很強的孔雀石綠降解能力，在24 h內(nèi)對5～40 mg/L孔雀石綠的降解率超過94.43%。添加葡萄糖、半乳糖、蔗糖等不同碳源顯著抑制了菌株的孔雀石綠降解，特別是在低孔雀石綠質(zhì)量濃度（5 mg/L）時，其孔雀石綠降解基本完全抑制。探究菌株的孔雀石綠脫色和降解過程，孔雀石綠首先在細胞外在孔雀石綠還原酶作用下還原成隱性孔雀石綠，然后通過ABC轉(zhuǎn)運蛋白進入細胞，被進一步降解和利用。本實驗為K. pneumoniaeWA-1的孔雀石綠降解機制研究提供重要思路，也為后期該菌株降解孔雀石綠的應用提供重要理論基礎(chǔ)。