李 萌，康佳欣，寧雪楠，魏子凱，廖敏和，巨歡歡，辛秋艷，劉 寧,*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江辰鷹乳業(yè)有限公司，黑龍江 嫩江 161499）

VE是一種脂溶性的微量營(yíng)養(yǎng)素，包括α-、β-、γ-和δ-生育酚和相應(yīng)三烯生育酚，具有抗氧化[1]、抗衰老[2]、促進(jìn)細(xì)胞代謝[3]、促進(jìn)脂肪吸收[4]、預(yù)防心血管疾病[5]、預(yù)防老年阿爾茲海默癥[6]等作用。VE攝入不足會(huì)導(dǎo)致人體免疫力下降，代謝失常[7]。牛乳作為一種富含多種微量營(yíng)養(yǎng)素和生物活性成分的營(yíng)養(yǎng)食品，是提供VE的良好來源[8-9]，將VE添加到牛乳中制備營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化乳，能夠提高牛乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，滿足人體對(duì)VE的需求。許多乳制品在生產(chǎn)過程中需要經(jīng)過超高溫滅菌（ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT）等熱處理，這導(dǎo)致乳中的VE發(fā)生熱降解[10-12]，因此，需要尋找一種載體保護(hù)乳中的VE免受熱處理的影響。

已有研究表明β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）可作為維生素的載體。Futterman等[13]在1972年首次提出β-LG可與VA結(jié)合，結(jié)合位點(diǎn)位于β-LG花萼形狀的疏水孔內(nèi)，當(dāng)VA近于疏水孔底部時(shí)，通過氫鍵和疏水相互作用形成復(fù)合物[14]。Mensi等[15]也證實(shí)了VA在β-LG疏水孔內(nèi)結(jié)合，與類胡蘿卜素的結(jié)合位點(diǎn)不同。β-LG可以與其他的脂溶性維生素結(jié)合，如VD3[16]和VK[17]；也可與一些水溶性的維生素結(jié)合，如VB12[18]、葉酸和抗壞血酸[17]，β-LG與葉酸結(jié)合后可延緩葉酸的光降解[19]。以上研究表明β-LG作為維生素的載體可靠，因此可以用β-LG作為VE的保護(hù)載體。

生物膜干涉技術(shù)是一種分析分子之間是否存在結(jié)合以及結(jié)合程度的技術(shù)，具有分辨率高、速度快、結(jié)果精準(zhǔn)等優(yōu)點(diǎn)[19-21]。它將生物分子固定在光纖生物傳感器的底端形成一層生物膜，當(dāng)一束可見光穿過生物膜時(shí)，在傳感器底端光學(xué)膜層的兩個(gè)界面會(huì)形成兩束反射光譜，疊加形成一束干涉光譜，分析物與生物分子通過相互作用結(jié)合后會(huì)導(dǎo)致傳感器底端生物膜厚度發(fā)生變化，干涉光譜發(fā)生相對(duì)位移，若兩個(gè)分子之間發(fā)生相對(duì)位移則證明兩者之間存在結(jié)合[22]。生物膜干涉技術(shù)通過傳感器的連續(xù)上機(jī)檢測(cè)聯(lián)合結(jié)合速率Ka與解離速率Kd計(jì)算得到親和力常數(shù)KD，KD值越小則說明分子之間結(jié)合程度越高，由此直接判斷分子之間的結(jié)合程度[23]。目前，生物膜干涉技術(shù)廣泛用于分析蛋白與蛋白、蛋白與核酸、蛋白與脂質(zhì)之間的相互作用[24]，但在β-LG與維生素之間相互作用的研究鮮見報(bào)道。

本研究以β-LG和VE為材料制備復(fù)合物。采用濁度、粒徑、Zeta電位、掃描電子顯微鏡、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、紅外光譜和熒光光譜分析β-LG與VE結(jié)合情況；利用生物膜干涉技術(shù)獲得β-LG與VE之間的親和力常數(shù)，以確定兩者之間的結(jié)合程度；使用高效液相色譜法分析普通強(qiáng)化乳（添加VE）和復(fù)合物強(qiáng)化乳（添加β-LG/VE復(fù)合物）中VE的熱損失率，探究β-LG對(duì)VE熱穩(wěn)定性的影響，以期為用于維生素強(qiáng)化乳制品中提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

VE（純度＞97%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-LG（純度90%） 上海源葉生物科技有限公司；生牛乳樣品 哈爾濱市宏有牧業(yè)有限責(zé)任公司。

氫氧化鈉、鹽酸、氫氧化鉀、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、抗壞血酸、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.4）、無水乙醇、乙醚、無水硫酸鈉、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（均為分析純） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純） 德國(guó)CNW公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；生物素化試劑EN-Link NHSPEG12-Biotin（21312）、Zeba脫鹽離心柱（89889）美國(guó)Thermo Fisher公司；SA鏈霉親和素傳感器 美國(guó)ForteBio公司；吐溫-20 廣州賽國(guó)生物科技有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA124S-CW分析天平、pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司；恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；SCIENTZ-18ND冷凍干燥機(jī) 寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司；U3000高效液相色譜儀、Nicolet iS50傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；UV-2600/2700紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；Mastersizer 2000激光粒度儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；TM 3000掃描電子顯微鏡 日本日立公司；DYY-10C電泳儀 北京六一生物科技有限公司；RF-5301PC熒光分光光度計(jì) 日本Island Ferry公司；Octet RED96分子互作分析系統(tǒng) 美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1β-LG/VE復(fù)合物的制備

用蒸餾水制備0.5 mg/mL的β-LG溶液，室溫?cái)嚢? h，4 ℃過夜保存直至完全溶解，用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，待用。將VE溶于無水乙醇中，制備4 種不同質(zhì)量濃度的VE溶液（5、10、20、40 mg/mL）。將β-LG溶液與VE溶液按質(zhì)量比95∶5均勻混合，制備4 種VE質(zhì)量濃度的復(fù)合物，室溫?cái)嚢? h，直至反應(yīng)完全。用冷凍干燥機(jī)（－50 ℃、10 Pa）進(jìn)行凍干，4 ℃密閉容器保存。

1.3.2β-LG/VE復(fù)合物中VE含量的測(cè)定

參照GB 5009.82—2016 《食品中維生素A、D、E的測(cè)定》中反相高效液相色譜法測(cè)定VE的含量[25]。稱取0.001 0 g樣品于150 mL錐形瓶中加20 mL水混勻，再加入1.0 g抗壞血酸和0.1 g BHT，混勻后加入30 mL無水乙醇和15 mL氫氧化鉀溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%），邊加邊振搖，于80 ℃恒溫水浴振蕩皂化30 min，皂化后立即冷卻至室溫。將皂化液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用石油醚-乙醚混合液（1∶1，V/V）振蕩萃取。將醚層經(jīng)無水硫酸鈉濾入250 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，于40 ℃水浴中蒸餾，待醚液剩約2 mL時(shí)，取下蒸發(fā)瓶，立即用氮?dú)獯蹈?。用甲醇溶解瓶中殘留物并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容。溶液過0.22 μm有機(jī)系濾膜，待測(cè)。

高效液相色譜條件：色譜柱為C30柱（250 mm×4.6 mm，3 μm）；柱溫20 ℃；流動(dòng)相：A為水，B為甲醇，洗脫梯度見表1；流速0.8 mL/min；波長(zhǎng)294 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表1 洗脫梯度條件Table 1 Gradient elution conditions

1.3.3 濁度的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取一定量的VE和4 種VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物，分別溶解在10 mL PBS中，用來制備VE溶液和β-LG/VE復(fù)合物溶液，具體添加量見表2。每列中VE添加量與對(duì)應(yīng)復(fù)合物所含VE的量相同（復(fù)合物所含VE的量為1.3.2節(jié)中的測(cè)定含量），以保證VE溶液與復(fù)合物溶液中的VE含量相同。使用紫外分光光度計(jì)在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定4 種VE溶液和4 種復(fù)合物溶液的吸光度，用PBS作為空白，測(cè)定溫度為25 ℃，每個(gè)樣本測(cè)量3 次。濁度計(jì)算公式如下：

式中：T為濁度；A為吸光度。

表2 濁度測(cè)定液中VE及其復(fù)合物的添加量Table 2 Concentrations of VE and its complex in turbidity measurement solution

1.3.4 粒徑和Zeta電位的測(cè)定

VE溶液和β-LG/VE復(fù)合物溶液的制備方法同1.3.3節(jié)。使用Mastersizer 2000激光粒度儀測(cè)定4 種VE溶液和4 種復(fù)合物溶液的平均粒徑和Zeta電位，折光率為1.33，在25 ℃條件下，每個(gè)樣品測(cè)量3 次。

1.3.5 掃描電子顯微鏡

使用掃描電子顯微鏡觀察β-LG和40 mg/mL VE質(zhì)量濃度制備的復(fù)合物微觀結(jié)構(gòu)。將樣品噴一層20 nm厚的金粉，在電壓5 kV和放大倍數(shù)500 倍條件下觀察樣品。

1.3.6 SDS-PAGE分析

使用SDS-PAGE法檢測(cè)β-LG和4 種VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物的分子質(zhì)量。制備蛋白質(zhì)量濃度為1 mg/mL的β-LG和4 種β-LG/VE復(fù)合物溶液，與上樣緩沖液混合，煮沸5 min，待用。按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒的方法制備15%分離膠和5%濃縮膠。上樣體積為10 μL，電壓為80 V，待樣品進(jìn)入分離濃縮膠后，將電壓調(diào)整為120 V。

1.3.7 紅外光譜分析

使用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)β-LG和4 種VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物進(jìn)行測(cè)定。將1 mg樣品與150 mg溴化鉀粉末混合后壓片，掃描范圍為4 000～400 cm-1。

1.3.8 熒光光譜分析

用PBS制備蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的β-LG和4 種VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物溶液。使用熒光分光光度計(jì)測(cè)β-LG和4 種β-LG/VE復(fù)合物的熒光強(qiáng)度，狹縫寬度為10 nm，掃描波長(zhǎng)在300～500 nm之間，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm。

1.3.9 生物膜干涉技術(shù)

1.3.9.1 固化物和分析物的制備

將1 mg EN-Link NHS-PEG12生物素化試劑溶于0.106 mL DMSO中，制備濃度為10 mmol/L的生物素化試劑母液。將500 μL 500 μg/mL的β-LG原液（0.01 mol/L PBS）與10 μL生物素化試劑母液混合。在25 ℃條件下，反應(yīng)混合物孵育30 min后，使用Zeba脫鹽離心柱將進(jìn)行離心脫鹽處理以去除未反應(yīng)的生物素（1 000×g離心2 min），收集離心后的蛋白作為固化物，待用。樣品PBST（0.01 mol/L PBS＋0.02%吐溫-20）作為分析物稀釋液。將40 mg VE溶于1 mL PBST中制備分析物（40 mg/mL），隨后進(jìn)行梯度稀釋為5、10、20、40 mg/mL，待用。

1.3.9.2 上機(jī)實(shí)驗(yàn)

將SA鏈霉親和素傳感器在PBS中預(yù)濕至少10 min。第1步，傳感器在PBS中平衡60 s；第2步，傳感器與固化物結(jié)合300 s；第3步，傳感器在PBST中平衡120 s；第4步，傳感器轉(zhuǎn)入分析物中，使固化物與分析物結(jié)合60 s；第5步，傳感器轉(zhuǎn)入PBST中解離60 s。根據(jù)上機(jī)測(cè)量出的結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)計(jì)算親和力常數(shù)，計(jì)算公式如下：

式中：KD為親和力常數(shù)/（mol/L）；Ka為結(jié)合速率常數(shù)/（L/（mol·s））；Kd為解離速率常數(shù)/s-1。

1.3.10 普通強(qiáng)化乳和復(fù)合物強(qiáng)化乳的制備

根據(jù)中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素每日參考攝入量，制備的普通強(qiáng)化乳中加入VE（8 mg/100 g），制備的復(fù)合物強(qiáng)化乳中加入40 mg/mL VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物，使得復(fù)合物強(qiáng)化乳中VE含量為8 mg/100 g。UHT處理?xiàng)l件為138 ℃、5 s，經(jīng)過無菌灌裝加工后，室溫保存。

1.3.11 VE損失率計(jì)算

普通強(qiáng)化乳和復(fù)合物強(qiáng)化乳中VE含量的參照1.3.2節(jié)中VE的測(cè)定方法，并計(jì)算VE在UHT前后的損失率，計(jì)算公式如下：

式中：C1為UHT處理前VE含量/（mg/100 g）；C2為UHT處理后VE含量/（mg/100 g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics 25軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，所有數(shù)據(jù)以表示。使用Origin 2018軟件作圖。在生物膜干涉實(shí)驗(yàn)中，原始數(shù)據(jù)采用Octet數(shù)據(jù)分析軟件（Version 6.4, ForteBio）分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-LG/VE復(fù)合物中VE含量的測(cè)定

通過高效液相色譜法測(cè)定4 種VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物中VE含量，見表3。當(dāng)VE質(zhì)量濃度為5、10、20 mg/mL和40 mg/mL時(shí)，對(duì)應(yīng)復(fù)合物中VE含量分別為（29.54±1.03）、（42.93±2.14）、（59.02±2.85）mg/100 mg和（72.18±4.07）mg/100 mg。當(dāng)VE質(zhì)量濃度為40 mg/mL時(shí)，對(duì)應(yīng)復(fù)合物中VE的含量最高，因此將40 mg/mL VE質(zhì)量濃度的復(fù)合物添加到復(fù)合物強(qiáng)化乳中。

表3 4 種VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物中VE含量Table 3 VE contents in β-LG/VE complexes prepared with four concentrations of VE

2.2 濁度的測(cè)定

濁度是評(píng)價(jià)脂溶性物質(zhì)溶解度的重要指標(biāo)，樣品的濁度越高，溶解度越低。如圖1所示，隨著VE質(zhì)量濃度的增加，4 種質(zhì)量濃度下VE和β-LG/VE復(fù)合物的濁度逐漸升高。在同一質(zhì)量濃度水平，β-LG/VE復(fù)合物的濁度低于VE的濁度。這是由于VE是脂溶性的，在水環(huán)境中會(huì)發(fā)生聚集導(dǎo)致濁度增加[26]。當(dāng)β-LG與VE結(jié)合后，可以減少暴露在水溶液中VE的數(shù)量，減少VE的自我聚集，形成更多親水性的復(fù)合物，使?jié)岫冉档蚚16,27]。因此，可以證明β-LG與VE存在結(jié)合，結(jié)合后增加了VE在水溶液中的溶解度。

圖1 4 種質(zhì)量濃度下VE和β-LG/VE復(fù)合物的濁度Fig. 1 Turbidity of free VE and β-LG/VE complexes prepared with four concentrations of VE

2.3 粒徑和Zeta電位的測(cè)定

4 種質(zhì)量濃度下VE和β-LG/VE復(fù)合物的粒徑測(cè)定見圖2A，隨著VE質(zhì)量濃度增加，VE和β-LG/VE復(fù)合物的粒徑逐漸升高，這說明VE質(zhì)量濃度越高，VE在水中聚集程度越高，粒徑越大[16]。在同一質(zhì)量濃度下，β-LG/VE復(fù)合物的粒徑高于β-LG的粒徑，說明β-LG與VE存在相互作用，使復(fù)合物尺寸變大；β-LG/VE復(fù)合物的粒徑低于VE的粒徑，進(jìn)一步證明β-LG與VE之間存在結(jié)合，結(jié)合后使暴露在水中的VE數(shù)量減少，VE聚集程度降低，粒徑減小。Haham等[26]測(cè)定VD3和酪蛋白膠束/VD3納米復(fù)合物的粒徑，結(jié)果表明納米復(fù)合物的粒徑低于VD3的粒徑，與本研究結(jié)果一致。

4 種質(zhì)量濃度下VE和β-LG/VE復(fù)合物的Zeta電位，如圖2B所示。隨著VE質(zhì)量濃度增加，VE和β-LG/VE復(fù)合物的Zeta電位幾乎保持不變。在同一VE質(zhì)量濃度時(shí)，β-LG的電位高于VE和β-LG/VE復(fù)合物的電位，這三者的電位都是負(fù)值。據(jù)報(bào)道，VE不帶電荷，VE的負(fù)電位可能是由于脂溶性維生素在水溶液中形成較大的納米聚集體，聚集體表面會(huì)迅速吸收水中的羥基離子，呈現(xiàn)負(fù)電位[16]。

圖2 4 種質(zhì)量濃度下VE和β-LG/VE復(fù)合物的粒徑（A）和Zeta電位（B）Fig. 2 Particle sizes (A) and zeta potentials (B) of free VE and β-LG/VE complexes prepared with four VE concentrations

2.4 掃描電子顯微鏡結(jié)構(gòu)表征

由圖3可見，β-LG和β-LG/VE復(fù)合物的表面結(jié)構(gòu)呈片狀，這是由于在冷凍干燥過程中，水從溶液中蒸發(fā)，分子之間的作用力更容易導(dǎo)致溶質(zhì)聚集[28]。β-LG呈現(xiàn)光滑的片狀結(jié)構(gòu)，而β-LG/VE的微觀結(jié)構(gòu)呈微突起的片狀結(jié)構(gòu)，這可能是由于VE附著在β-LG表面形成了VE聚集物[29]。

圖3 β-LG（A）和40 mg/mL VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物（B）的微觀結(jié)構(gòu)Fig. 3 Microstructure of β-LG (A) and β-LG/VE complex prepared with 40 mg/mL VE (B）

2.5 SDS-PAGE分析結(jié)果

圖4 β-LG和4 種VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物的SDS-PAGE結(jié)果Fig. 4 Electrophoresis patterns of β-LG and β-LG/VE complexes prepared with four VE concentrations

通過SDS-PAGE分析β-LG與VE發(fā)生共價(jià)結(jié)合情況[30]。從圖4可以看出，β-LG的分子質(zhì)量約為18.3 kDa，4 種VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物的分子遷移率與β-LG遷移率基本一致，這說明β-LG與VE結(jié)合后，β-LG的分子質(zhì)量沒有變化，結(jié)合過程中沒有破壞β-LG的二硫鍵，屬于非共價(jià)結(jié)合。

2.6 紅外光譜分析

用紅外光譜分析與VE結(jié)合后的β-LG的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，如圖5所示。在β-LG光譜中，氫鍵的峰值在3 292.38 cm－1，是氫鍵的—OH基團(tuán)的伸縮振動(dòng)吸收峰[31]。添加VE后，4 種VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物的氫鍵峰向左移動(dòng)，分別為3 292.82、3 293.34、3 294.30 cm－1和3 295.26 cm－1，說明氫鍵是β-LG與VE之間的重要作用力之一。在β-LG/VE復(fù)合物光譜中，酰胺I帶（1 650～1 600 cm－1）和酰胺II帶（1 550～1 500 cm－1）峰的位置也發(fā)生移動(dòng)，表明β-LG通過疏水相互作用與VE結(jié)合[32]。與VE結(jié)合后，β-LG的α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲的相對(duì)含量均未發(fā)生顯著變化（表4），說明與VE結(jié)合后，β-LG的二級(jí)結(jié)構(gòu)未受影響。Swain等[12]研究與VB12結(jié)合后β-LG的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明β-LG的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)沒有改變，與本研究結(jié)果一致?？偟膩碚f，β-LG可通過氫鍵和疏水作用與VE結(jié)合形成復(fù)合物，但蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)不受影響。

圖5 β-LG和4 種VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物的紅外光譜Fig. 5 Infrared spectra of β-LG and β-LG/VE complexes prepared with four VE concentrations

表4 β-LG和4 種VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Table 4 Secondary structure contents of β-LG and β-LG/VE complexes prepared with four VE concentrations

2.7 熒光光譜分析結(jié)果

使用熒光光譜分析與VE結(jié)合后的β-LG的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化。如圖6所示，蛋白的內(nèi)在熒光是由280 nm波長(zhǎng)處的酪氨酸（Tyr）和色氨酸（Trp）殘基激發(fā)引起的[16]。通過對(duì)β-LG和4 種VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物的熒光光譜分析發(fā)現(xiàn)，在332 nm波長(zhǎng)處，β-LG的熒光強(qiáng)度最大，依次為5、10、20、40 mg/mL VE質(zhì)量濃度下的復(fù)合物，這說明與VE結(jié)合增加了β-LG的熒光猝滅程度。熒光強(qiáng)度降低的主要原因是VE作為猝滅劑使得β-LG中Tyr和Trp的熒光猝滅。4 種VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物的最大熒光強(qiáng)度始終保持在332 nm波長(zhǎng)處，說明VE是與β-LG相互作用的小分子猝滅劑，與VE結(jié)合只是減少β-LG中熒光基團(tuán)的數(shù)量，對(duì)β-LG的三級(jí)結(jié)構(gòu)沒有影響。Swain等[12]通過熒光光譜分析與VB12結(jié)合后β-LG的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明β-LG的三級(jí)結(jié)構(gòu)不受VB12的影響，與本研究結(jié)果一致。

圖6 β-LG和4 種VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物的熒光光譜Fig. 6 Fluorescence spectra of β-LG and β-LG/VE complexes prepared with four VE concentrations

2.8 生物膜干涉技術(shù)檢測(cè)結(jié)果

生物膜干涉技術(shù)包括5 個(gè)步驟：平衡1（PBS）、固化（β-LG）、平衡2（PBST）、結(jié)合（VE）和解離（PBST）。在固化步驟，SA傳感器捕捉蛋白中的生物素標(biāo)簽使得蛋白固定在傳感器上。隨后將帶有蛋白的SA傳感器與4 種不同質(zhì)量濃度的VE結(jié)合，在PBST中解離結(jié)合在β-LG上的VE完成解離過程。圖7為β-LG和VE的結(jié)合解離擬合曲線（R2=0.99），可以觀察到明顯的結(jié)合信號(hào)，隨著VE質(zhì)量濃度的升高，結(jié)合信號(hào)逐漸增強(qiáng)，最高達(dá)到0.065 nm；在解離過程中，結(jié)合信號(hào)降低。通過數(shù)據(jù)分析軟件得到結(jié)合速率常數(shù)為1.17 L/（mol?s），解離速率常數(shù)8.766×10－2s－1，計(jì)算的β-LG和VE的親和力常數(shù)為7.493×10－2mol/L。已有研究表明在生物膜干涉技術(shù)中能夠得到親和力常數(shù)就可以證明兩個(gè)分子之間存在結(jié)合，張英等[23]采用生物膜干涉技術(shù)研究花生蛋白與花生蛋白過敏患者血清IgE的相互作用，結(jié)果表明這兩者之間親和力常數(shù)為5.5×10－5mol/L，可以證明兩者之間存在結(jié)合；Shang Jiaqi等[33]通過生物膜干涉技術(shù)研究乳清分離蛋白與金針菇多糖之間的相互作用，結(jié)果表明這兩者之間親和力常數(shù)為1.736×10－4mol/L，可以證明兩者之間存在結(jié)合。由此得出β-LG和VE之間存在結(jié)合。

圖7 4 種VE質(zhì)量濃度下β-LG/VE復(fù)合物的結(jié)合解離擬合曲線Fig. 7 Fitting curves of association and dissociation of β-LG/VE complexes prepared with four VE concentrations

2.9 VE損失率計(jì)算

表5為普通強(qiáng)化乳和復(fù)合物強(qiáng)化乳中VE含量，可以看出熱處理后VE含量均顯著降低（P＜0.05），這是由于高溫條件下VE對(duì)熱不穩(wěn)定，導(dǎo)致VE降解，還可以觀察到復(fù)合物強(qiáng)化乳中VE損失率（4.01±0.18）%顯著低于普通強(qiáng)化乳中VE損失率（10.90±0.17）%（P＜0.05），這說明β-LG與VE結(jié)合后可以保護(hù)VE免受熱降解。因此，β-LG可有效改善VE的熱穩(wěn)定性。Saiz-Abajo等[34]研究在食品加工過程中酪蛋白對(duì)β-胡蘿卜素的保護(hù)情況，結(jié)果表明酪蛋白可以降低β-胡蘿卜素的降解程度。Gupta等[35]研究表明酪蛋白可有效提高VA的穩(wěn)定性。Relkin等[36]研究，結(jié)果表明在儲(chǔ)存過程中乳清蛋白具有保護(hù)α-生育酚的作用。綜上所述，之前的研究已經(jīng)表明乳蛋白可以作為維生素的保護(hù)載體，這與本研究的結(jié)果一致。

表5 普通強(qiáng)化乳和復(fù)合物強(qiáng)化乳中VE含量和損失率Table 5 VE contents and loss rates in common fortified milk and complex fortified milk

3 結(jié) 論

本研究以β-LG和VE為材料制備β-LG/VE復(fù)合物，通過濁度、粒徑、Zeta電位、掃描電子顯微鏡、SDS-PAGE、紅外光譜和熒光光譜分析證明β-LG與VE之間通過氫鍵和疏水相互作用結(jié)合，結(jié)合后提高VE在水溶液中的溶解性，不改變蛋白的結(jié)構(gòu)。生物膜干涉技術(shù)進(jìn)一步證明β-LG與VE之間存在結(jié)合，親和力常數(shù)為7.493×10－2mol/L，因此，生物膜干涉技術(shù)可用于分析β-LG和VE之間的結(jié)合程度。將β-LG/VE復(fù)合物添加到乳中制備復(fù)合物強(qiáng)化乳可有效的降低VE在加工過程中的損失，為維生素的綜合利用提供理論基礎(chǔ)。