樊 霞 姜訓(xùn)鵬 王 石 宋金彩 田淑麗 鄭學(xué)聰

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，北京100081；2.藍(lán)星安迪蘇南京有限公司，南京210048；3.中糧(北京)飼料科技有限公司，北京100081)

維生素是動(dòng)物維持生理機(jī)能所必需的一類低分子有機(jī)化合物，控制著動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的新陳代謝[1]。確定添加劑預(yù)混料產(chǎn)品中不同維生素的含量是產(chǎn)品質(zhì)量控制和精準(zhǔn)飼喂的重要基礎(chǔ)。飼料中維生素的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法一般為高效液相色譜法[2-4]，但該方法操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、儀器設(shè)備投入大，對(duì)檢測(cè)人員的技能經(jīng)驗(yàn)要求高，難以滿足飼料廠和養(yǎng)殖場(chǎng)在精細(xì)生產(chǎn)、精準(zhǔn)飼喂下的高通量篩查需求。近紅外光譜(near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS)法因具有操作簡(jiǎn)單、快速、無損等特點(diǎn)，已被成熟應(yīng)用于飼料的高通量檢測(cè)[5-7]，并部分形成了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法[8-9]。在研發(fā)構(gòu)建飼料中維生素含量測(cè)定的NIRS法中，定標(biāo)參考值選取制約著NIRS定量分析模型的快速構(gòu)建和應(yīng)用。因維生素檢測(cè)投入大和周期長(zhǎng)，且維生素組分眾多，目前見諸報(bào)道的NIRS定量分析模型有維生素A[10]、維生素E[11-12]等11種維生素[13-14]。為滿足飼料廠和養(yǎng)殖場(chǎng)的迫切需求，結(jié)合維生素預(yù)混料產(chǎn)品中維生素含量源于混合配制的原理，相關(guān)研究院所和企業(yè)[15]以理論值(或稱配方值)為定標(biāo)參考值構(gòu)建了12種維生素NIRS定量分析模型。該方法快速推進(jìn)了不同維生素NIRS定量分析模型的構(gòu)建和應(yīng)用，也為混合組分指標(biāo)NIRS定量分析模型的快速構(gòu)建拓展了新方向。深入研究比較以檢測(cè)值為定標(biāo)參考值和以理論值為定標(biāo)參考值2類NIRS定量分析模型的預(yù)測(cè)精準(zhǔn)度差異，有助于為該方法標(biāo)準(zhǔn)化奠定更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)基于同一維生素預(yù)混料定標(biāo)集，分別以檢測(cè)值、理論值為定標(biāo)參考值，構(gòu)建維生素E的NIRS定量分析模型，并采用同一獨(dú)立驗(yàn)證集進(jìn)行檢驗(yàn)，比較了2類NIRS定量分析模型的預(yù)測(cè)精準(zhǔn)度差異，并進(jìn)一步分析了維生素預(yù)混料存放時(shí)間對(duì)理論值類NIRS定量分析模型預(yù)測(cè)精準(zhǔn)度的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品制備

共制備225個(gè)維生素預(yù)混料樣品，以稻殼粉為稀釋劑，配伍含維生素E等14種維生素成分的維生素預(yù)混料樣品，包括維生素A、維生素D3、維生素E、維生素K3、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、葉酸(維生素B9)、D-生物素(維生素B7)、煙酰胺(維生素B3)、D-泛酸(維生素B5)、維生素C磷酸酯和肌醇，并符合豬、禽和水產(chǎn)動(dòng)物等的營(yíng)養(yǎng)需求，覆蓋添加比例1%～10%。

制備后的所有樣品均真空密封包裝，存貯于4 ℃恒溫冷藏箱中。試驗(yàn)開始前，取出樣品，放至室溫20～25 ℃。每個(gè)樣品取500 g，通過四分法分成2份，一份用于維生素E含量測(cè)定，另一份用于NIRS掃描。

1.2 樣本集劃分

樣本集-1(Set-1)：為比較檢測(cè)值和理論值對(duì)NIRS定量分析模型精準(zhǔn)度的影響，選取全部制備樣品為Set-1的樣本。兼顧維生素E含量梯度，隨機(jī)選取160個(gè)樣品為定標(biāo)集-1(Cal-1)樣本，剩余65個(gè)樣品為獨(dú)立驗(yàn)證集-1(Val-1)樣本?；贑al-1，分別以檢測(cè)值和理論值為定標(biāo)參考值，構(gòu)建維生素E的NIRS定量分析模型A(Model-A)和B(Model-B)，并應(yīng)用Val-1對(duì)2個(gè)模型進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證。

樣本集-2(Set-2)：為進(jìn)一步分析維生素預(yù)混料存放時(shí)間對(duì)理論值類NIRS定量分析模型預(yù)測(cè)精準(zhǔn)度的影響，在全部制備樣品中隨機(jī)選取100個(gè)代表性樣品為Set-2的樣本，分別在室溫20～25 ℃下放置0、7和14 d時(shí)獲取樣本的NIRS。兼顧維生素E含量梯度，隨機(jī)選取80個(gè)樣品為定標(biāo)集-2(Cal-2)樣本，剩余20個(gè)樣品為獨(dú)立驗(yàn)證集-2(Val-2)樣本?；贑al-2的0 d的NIRS，構(gòu)建維生素E的NIRS定量分析模型C(Model-C)；基于Cal-2的0、7和14 d的NIRS，構(gòu)建維生素E的NIRS定量分析模型D(Model-D)；并應(yīng)用Val-2對(duì)2個(gè)模型進(jìn)行獨(dú)立驗(yàn)證。

1.3 定標(biāo)參考值獲取

按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《飼料中維生素E的測(cè)定 高效液相色譜法》(GB/T 17812—2008)[3]中規(guī)定的方法測(cè)定，獲得樣品中維生素E檢測(cè)值。

按照原料維生素E制劑有效含量和在維生素預(yù)混料中的添加比例計(jì)算，獲得樣品中維生素E理論值。

1.4 NIRS掃描

利用配備鍍金積分球的傅里葉變換近紅外光譜儀(Bruker Matrix-Ⅰ型，德國(guó))采集樣品的NIRS，配備高能量空氣冷卻預(yù)準(zhǔn)直近紅外光源及硫化鉛檢測(cè)器。光譜掃描參數(shù)設(shè)置為：光譜掃描范圍10 000～4 000 cm-1，分辨率16 cm-1[16]，掃描64次取平均值，旋轉(zhuǎn)式樣品池。樣品重復(fù)裝樣掃描2次，取2次掃描的平均光譜作為樣品原始光譜。

1.5 NIRS定量分析模型的構(gòu)建和篩選

模型構(gòu)建：利用全譜范圍10 000～4 000 cm-1，選擇偏最小二乘回歸(partial least squares regression，PLSR)方法，基于不同定標(biāo)集樣本及其參考值，構(gòu)建不同NIRS定量分析模型，包括Model-A、Model-B、Model-C和Model-D。采用留一交叉驗(yàn)證法，根據(jù)最小交互驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)誤差(root mean square error of cross validation，RMSECV)原則，確定最佳主因子數(shù)。

模型篩選：基于偏最小二乘回歸模型的RMSECV指標(biāo)，比較一階導(dǎo)數(shù)(first derivative，1D)、二階導(dǎo)數(shù)(second derivative，2D)、多元散射校正(multiple scattering correction，MSC)、變量標(biāo)準(zhǔn)化(standard normal variate，SNV)以及1D與MSC或SNV的組合(1D+MSC、1D+SNV)等光譜預(yù)處理方法?；谧顑?yōu)的光譜預(yù)處理方法，構(gòu)建NIRS定量分析模型，用于驗(yàn)證和交互評(píng)價(jià)。

1.6 預(yù)測(cè)效果評(píng)價(jià)

1.6.1 不同定標(biāo)參考值的比較評(píng)價(jià)

NIRS定量分析模型的預(yù)測(cè)效果評(píng)價(jià)方法是將模型對(duì)樣本中維生素E含量的模型預(yù)測(cè)值與檢測(cè)值相比，隨后驗(yàn)證線性模型(公式1)的特性[17]。公式1如下：

Y=a+bX。

(1)

式中：a為回歸截距；b為回歸系數(shù)；X為預(yù)測(cè)值；Y為檢測(cè)值。

用模型預(yù)測(cè)值與檢測(cè)值成對(duì)數(shù)據(jù)的一系列結(jié)果進(jìn)行參數(shù)檢驗(yàn)，確定a與0的差異及b與1的差異是否顯著。假定樣本檢測(cè)值Yi(i=1,2，…，n)服從正態(tài)分布，相互獨(dú)立且有相同方差，同時(shí)進(jìn)行2個(gè)參數(shù)假設(shè)(H0：a=0且b=1，H1：H0不真)檢驗(yàn)，即F-檢驗(yàn)。F值計(jì)算公式如下：

(2)

(3)

(4)

若假設(shè)H0為真時(shí)，F(xiàn)～Fα(2，n-2)，其中α為置信水平，說明在一定置信水平上，a與0及b與1無顯著差異，則認(rèn)為NIRS定量分析模型的預(yù)測(cè)結(jié)果完全可靠，具有較高精確度。

分析Model-A和Model-B 2個(gè)模型在不同置信水平(α=0.05和0.01)下的F-檢驗(yàn)，比較2個(gè)模型的預(yù)測(cè)效果。在2個(gè)F-檢驗(yàn)中，使用同一獨(dú)立驗(yàn)證集Val-1樣本。

1.6.2 不同存放時(shí)間的比較評(píng)價(jià)

根據(jù)同一獨(dú)立驗(yàn)證集Val-2的絕對(duì)誤差統(tǒng)計(jì)值，包括箱型圖的中位值、上四分位值和下四分位值，評(píng)價(jià)維生素預(yù)混料存放時(shí)間對(duì)理論值類NIRS定量分析模型預(yù)測(cè)精準(zhǔn)度的影響。絕對(duì)差值為NIRS定量分析模型的預(yù)測(cè)值減去理論值。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Matlab 2008軟件(The Math Works公司，美國(guó))配合PLS_toolbox 6.7軟件(Eigenvector Research公司，美國(guó))進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 化學(xué)成分統(tǒng)計(jì)分析

表1為不同樣本集中維生素E含量的統(tǒng)計(jì)分析。維生素E含量在2.48×104～25.54×104IU/kg(1 IU=1 mg)之間，變異系數(shù)為47%，分布較為廣泛，與市場(chǎng)主流維生素預(yù)混料的含量一致。Set-1的Cal-1和Val-1中維生素E檢測(cè)值的平均值、中位值、最大值、最小值和變異系數(shù)數(shù)值相近，說明具有相似的樣本分布。Set-2的Cal-2和Val-2中也具有相似的樣本分布。Cal-1中160個(gè)樣本的檢測(cè)值和理論值差異較小，這與稻殼粉及其他維生素組分中的維生素E含量極低相關(guān)。

表1 不同樣本集中維生素E含量的統(tǒng)計(jì)分析

2.2 維生素預(yù)混料NIRS特征分析

圖1為225個(gè)維生素預(yù)混料樣品的NIRS平均光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜。因維生素主要由碳、氫、氧、氮等元素構(gòu)成，維生素預(yù)混料在NIRS譜區(qū)存在多處明顯吸收峰，為進(jìn)行定量分析提供了良好的信息基礎(chǔ)。其中，4 380～4 100 cm-1區(qū)域的吸收峰主要由碳-氫(C-H)鍵伸縮振動(dòng)和C-H鍵變形振動(dòng)的合頻吸收引起，5 900～5 800 cm-1區(qū)域的吸收峰與C-H鍵的第一倍頻吸收相關(guān)[18-19]。但在粒度等因素影響下，10 000～5 200 cm-1波段的光譜變異明顯增大，光譜散射嚴(yán)重。

圖1 維生素預(yù)混料樣品的NIRS平均光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜

維生素E作為一種脂溶性維生素，是一種苯并二氫吡喃的衍生物，由1個(gè)β-色滿環(huán)和1個(gè)脂肪側(cè)鏈組成，存在8種異構(gòu)體[20]，但預(yù)混料中使用的商品維生素E主要為人工合成的DL-α-生育酚乙酸酯，不存在同分異構(gòu)體。商品維生素E一般為油劑加入適當(dāng)吸附劑之后的粉劑，在NIRS譜區(qū)8 788～7 973 cm-1、7 443～6 629 cm-1和6 061～5 246 cm-1具有特征吸收峰[21]。盡管維生素預(yù)混料的載體稀釋劑影響維生素E在NIRS的特征吸收峰，但相關(guān)研究表明此影響可通過化學(xué)計(jì)量學(xué)手段降低，甚至消除[22]。

2.3 不同NIRS定量分析模型的構(gòu)建和篩選

在構(gòu)建NIRS定量分析模型中，本文比較了多種光譜預(yù)處理技術(shù)的效果，具體如表2所示。因?yàn)樵脊庾V存在散射(圖1)，所以，相較于無預(yù)處理方法，MSC方法可大幅提高4個(gè)模型的質(zhì)量，決定系數(shù)(R2)提高1%～3%，RMSECV降低23%～47%。相較于無預(yù)處理方法，SNV方法也可提高4個(gè)模型的質(zhì)量，但僅對(duì)Model-B的提高幅度高于MSC方法。相較于無預(yù)處理方法，1D和2D方法降低了部分模型質(zhì)量，R2下降1%，RMSECV增加3%～18%。盡管導(dǎo)數(shù)處理具有消除光譜散射影響的能力，但也會(huì)引入噪聲，影響模型質(zhì)量改善，需要平衡使用。如果將1D方法結(jié)合SNV方法和MSC方法，則也可提高模型質(zhì)量，但提高幅度仍不高于MSC方法。以RMSECV最小為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，Model-A、Model-B、Model-C和Model-D的最優(yōu)光譜預(yù)處理方法分別為MSC、SNV、MSC和MSC，R2分別為0.992、0.991、0.989和0.991，RMSECV分別為4.50×103、4.94×103、5.47×103和5.49×103IU/kg，相對(duì)分析誤差(ratio performance deviation，RPD)分別為11.2、10.6、9.6和10.3。RPD反映模型對(duì)預(yù)測(cè)組分總體的定標(biāo)效果或預(yù)測(cè)效果，其值越大越好。如果RPD≥3，說明模型定標(biāo)效果良好，可用于實(shí)際檢測(cè)。

表2 基于不同光譜預(yù)處理方法的NIRS定量分析模型

2.4 定標(biāo)參考值選取的比較分析(Model-A和Model-B)

表3為基于不同定標(biāo)參考值的NIRS定量分析模型比較結(jié)果。Model-A和Model-B 2個(gè)模型的F-檢驗(yàn)評(píng)價(jià)結(jié)果顯示：在置信水平α=0.05下，2個(gè)模型的F值均高于F0.05(2,60)=3.15，說明2個(gè)模型均具有較高精確度，可直接用于定量分析，也說明參考值選擇檢測(cè)值和理論值的差異不大，預(yù)測(cè)散點(diǎn)圖如2所示；在置信水平α=0.01下，Model-A的F值5.48高于F0.01(2,60)=4.98，Model-B的F值3.77低于F0.01(2,60)=4.98，說明Model-A具有更高的精準(zhǔn)度，也說明在此置信水平下，參考值應(yīng)選擇檢測(cè)值。

表3 基于不同定標(biāo)參考值的NIRS定量分析模型比較

圖2 不同NIRS定量分析模型對(duì)同一獨(dú)立驗(yàn)證集的預(yù)測(cè)散點(diǎn)圖

2.5 不同存放時(shí)間的維生素預(yù)混料預(yù)測(cè)分析(Model-C和Model-D)

根據(jù)同一獨(dú)立驗(yàn)證集Val-2的絕對(duì)誤差的統(tǒng)計(jì)值，評(píng)價(jià)分析維生素預(yù)混料存放時(shí)間對(duì)理論值類NIRS定量分析模型預(yù)測(cè)精準(zhǔn)度的影響，如圖3所示。Model-C的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，同一樣本隨著存放時(shí)間由0 d增加至7、14 d，絕對(duì)誤差的中位值由0.01×104IU/kg增加至0.18×104、1.58×104IU/kg。預(yù)測(cè)值與理論值的絕對(duì)誤差逐漸朝單一方向增大，即預(yù)測(cè)值逐漸高于理論值。Model-D的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，同一樣本隨著存放時(shí)間由0 d增加至7、14 d，絕對(duì)誤差的中位值在0.15×104、-0.17×104和0.35×104IU/kg變動(dòng)。預(yù)測(cè)值與理論值的絕對(duì)誤差未出現(xiàn)單一方向增大或減少，但其絕對(duì)值在逐漸增大，由0.15×104IU/kg增加至0.17×104、0.35×104IU/kg?？梢娀? d掃描NIRS構(gòu)建的NIRS定量分析模型不適于預(yù)測(cè)存放超過7 d以上的NIRS。

圖3 不同存放時(shí)間下維生素預(yù)混料的NIRS預(yù)測(cè)絕對(duì)誤差的箱型圖

3 討 論

本研究基于同一維生素預(yù)混料的定標(biāo)集，分別以檢測(cè)值、理論值為定標(biāo)參考值，構(gòu)建維生素E的NIRS定量分析模型，R2分別為0.992和0.991，RMSECV分別為4.50×103和4.94×103IU/kg，RPD分別為11.2和10.6。已有國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道[11,14-15]的RMSECV多在1.3×103～11.2×103IU/kg。受載體稀釋劑類型等因素影響，維生素預(yù)混料中維生素E含量NIRS定量分析模型的精準(zhǔn)度會(huì)略有差異[16]。本研究模型的RMSECV均在此區(qū)間，且具有較低誤差。根據(jù)F-檢驗(yàn)，在置信水平α=0.05下，選擇以理論值為參考值構(gòu)建維生素E的NIRS定量分析模型具有可行性。但在置信水平α=0.01下，以檢測(cè)值為參考值的維生素E定量分析模型與以理論值為參考值的維生素E定量分析模型具有差異。由此可知，在一定的檢測(cè)精準(zhǔn)度要求下，選擇以理論值為參考值構(gòu)建維生素E的NIRS定量分析模型具有可行性。尤其考慮到構(gòu)建時(shí)間和成本等因素，選擇理論值作為參考值，可解決飼料廠和養(yǎng)殖場(chǎng)的迫切使用需求。本研究維生素預(yù)混料是以稻殼粉為載體，其中維生素E主要來源于外源添加，且配制過程中成分損失極小。這些因素降低了理論值與檢測(cè)值的差異，也成為選擇理論值為參考值的基礎(chǔ)條件。但鑒于飼料種類復(fù)雜，如其他添加組分中存在較高含量的維生素E，則需要進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的適用性。同時(shí)，在基于理論值的NIRS定量分析模型中，維生素預(yù)混料存放7 d以上，絕對(duì)誤差的中位值增大了0.17×104IU/kg。這與維生素預(yù)混料中眾多商品維生素對(duì)熱、氧、水分和光敏感性不一基本一致[1]。盡管環(huán)境因素未顯著降低組分含量，但致使NIRS光譜產(chǎn)生變化，影響NIRS定量分析模型的預(yù)測(cè)。區(qū)別于濕化學(xué)方法，NIRS方法是一種經(jīng)驗(yàn)方法，分為定標(biāo)和預(yù)測(cè)2個(gè)過程。為保障預(yù)測(cè)精準(zhǔn)性，要求對(duì)定標(biāo)和預(yù)測(cè)2個(gè)過程中的操作保持高度一致，以避免引入干擾。在構(gòu)建以理論值為參考值的維生素E定量分析模型上，尤其需要考慮操作一致。本研究同時(shí)指出，NIRS獲取時(shí)間是重要的影響因素，會(huì)對(duì)模型預(yù)測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大影響。

4 結(jié) 論

① 以理論值為定標(biāo)參考值構(gòu)建了維生素E的NIRS定量分析模型，可解決定標(biāo)參考值獲取周期長(zhǎng)和投入大等問題，滿足飼料廠和養(yǎng)殖場(chǎng)在精細(xì)化生產(chǎn)和飼喂下的高通量篩查需求，有助于其他相似混制飼料成分指標(biāo)的近紅外定量分析模型構(gòu)建。

② 樣品存放時(shí)間也是影響維生素預(yù)混料NIRS定量分析模型精準(zhǔn)度的重要因素。