崔浩然 白天天 趙林波 陳顏旭 郭雪峰,2* 金 巍

(1.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾843300；2.塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點實驗室，阿拉爾843300；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京210032)

新疆是我國的畜牧大省，有著豐富的物種資源，擁有超過3 000萬只的本地品種羊資源，主要有策勒黑羊、和田羊、卡拉庫爾羊、哈薩克羊、多浪羊等品種，這些本地品種羊有著耐粗飼和對環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點[1-2]。近幾年新疆響應(yīng)國家號召大力發(fā)展畜牧業(yè)，從國內(nèi)外引進(jìn)了大量的優(yōu)秀品種來擴(kuò)大繁育，湖羊因其生長發(fā)育快、多胎性等特點成為了新疆引種擴(kuò)繁的重點[3-4]。瘤胃是反芻動物重要的消化器官，內(nèi)部有豐富的瘤胃微生物，瘤胃菌群的結(jié)構(gòu)處于相對穩(wěn)定的動態(tài)平衡，該平衡對于維持動物機(jī)體健康、瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、營養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收及提高動物的生產(chǎn)性能等起著重要的作用[5-7]。瘤胃菌群結(jié)構(gòu)主要受動物品種、日齡、地區(qū)、飼糧結(jié)構(gòu)等多種因素的影響[8-10]。不同品種之間的瘤胃菌群結(jié)構(gòu)具有一定的相似性，但其菌群組成和相對豐度存在一定差異。King等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在相同的飼養(yǎng)條件下，娟姍牛和荷斯坦牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)相似度很高，但娟姍牛瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷短桿菌的相對豐度顯著高于荷斯坦牛。韓帥[12]在比較呼倫貝爾羔羊和呼倫貝爾羊與杜泊羊雜一代(呼杜雜一代)羔羊瘤胃微生物動態(tài)的研究中發(fā)現(xiàn)呼杜雜一代羔羊在產(chǎn)甲烷菌、脂解厭氧弧桿菌、反芻月形單胞菌、牛鏈球菌的相對豐度上高于呼倫貝爾羔羊。以上研究表明不同品種間由于動物品種遺傳學(xué)差異會引起瘤胃內(nèi)部分菌落相對豐度的差異。本試驗以新疆地方品種羊卡拉庫爾羊和引入品種湖羊為研究對象，在飼喂相同飼糧的條件下分析湖羊與卡拉庫爾羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的差異性，揭示卡拉庫爾羊較湖羊耐受高粗飼料飼糧的瘤胃微生物機(jī)制，為南疆地區(qū)不同品種羊的飼養(yǎng)管理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

本試驗選取體重[(35±2) kg]相近的健康卡拉庫爾羊羯羊和湖羊羯羊各6只，飼喂相同飼糧。參考《肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 816—2004)[13]配制基礎(chǔ)飼糧(維持需要)，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平如表1所示，分別于每日08：00與20：00分2次限量飼喂1.2 kg，自由飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 樣品采集

試驗預(yù)試期為30 d，正試期為3 d。在正試期第1～3天于晨飼前通過口腔采集瘤胃液，經(jīng)4層紗布過濾，每天收集每組混合瘤胃液約50 mL，立即放入液氮中，后于-80 ℃冰箱保存，以備送檢。

1.3 樣品送檢

將瘤胃液樣品送至百邁客生物有限公司用PacBio測序方法對細(xì)菌16S rRNA基因進(jìn)行高通量測序。

1.4 測序及生物信息分析

提取樣品總DNA后，利用細(xì)菌16S rRNA基因全長引物序列合成帶有Barcode的特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測序文庫(SMRT Bell)，建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫用PacBio Sequel進(jìn)行測序。通過smrtlink分析軟件導(dǎo)出CCS文件，根據(jù)Barcode序列識別不同樣品的數(shù)據(jù)并轉(zhuǎn)化為fastq格式數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)預(yù)處理：將PacBio下機(jī)的數(shù)據(jù)導(dǎo)出為CCS文件(CCS序列使用Pacbio提供的smrtlink工具獲取)后，主要有如下3個步驟：1)CCS識別。使用lima v1.7.0軟件，通過Barcode對CCS進(jìn)行識別，得到的Raw-CCS序列數(shù)據(jù)。2)CCS過濾。使用cutadapt 1.9.1軟件進(jìn)行引物序列的識別與去除并且進(jìn)行長度過濾，得到不包含引物序列的Clean-CCS序列。3)去除嵌合體。使用UCHIME v4.2軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到Effective-CCS序列。后續(xù)進(jìn)行多樣性分析、差異分析、相關(guān)性分析及功能預(yù)測等。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 26.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗，P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，試驗結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 湖羊與卡拉庫爾羊瘤胃菌群Alpha多樣性分析

由表2可知，樣品的覆蓋度(Coverage)均約等于1，說明本次測序結(jié)果能夠反映樣本的真實情況；卡拉庫爾羊的操作分類單元(OTUs)數(shù)目、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)均極顯著高于湖羊(P<0.01)，說明在飼喂相同飼糧條件下卡拉庫爾羊瘤胃菌群的多樣性和豐富度均高于湖羊。

表2 湖羊與卡拉庫爾羊瘤胃菌群Alpha多樣性指數(shù)

2.2 湖羊與卡拉庫爾羊瘤胃菌群組成特異性分析

如圖1所示，本試驗所有樣本共得到626個OTUs，其中278個OTUs為2個品種羊共有的，占OTUs總數(shù)的44.4%。湖羊特有OTUs 109個，占17.4%；卡拉庫爾羊特有OTUs 239個，占38.2%，上述結(jié)果說明湖羊和卡拉庫爾羊的瘤胃菌群結(jié)構(gòu)存在差異性。

圖1 維恩圖

2.3 湖羊與卡拉庫爾羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)分析

湖羊和卡拉庫爾羊瘤胃菌群在門水平上的組成和相對豐度如表3所示。本試驗共獲得20個細(xì)菌門，其中在至少1個品種羊上的相對豐度大于1%的菌門有厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、Kiritimatiellaeota、軟壁菌門(Tenericutes)、浮霉菌門(Planctomycetes)、髕骨細(xì)菌門(Patescibacteria)和互養(yǎng)菌門(Synergistetes)。湖羊的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(86.25%)、擬桿菌門(4.3%)和藍(lán)細(xì)菌門(3.12%)；卡拉庫爾羊的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門(59.57%)、擬桿菌門(21.34%)和Kiritimatiellaeota(9.75%)。湖羊厚壁菌門和藍(lán)細(xì)菌門的相對豐度顯著高于卡拉庫爾羊(P<0.05)，髕骨細(xì)菌門和互養(yǎng)菌門的相對豐度顯著低于卡拉庫爾羊(P<0.05)，擬桿菌門、變形菌門、Kiritimatiellaeota和軟壁菌門的相對豐度極顯著低于卡拉庫爾羊(P<0.01)。

表3 湖羊與卡拉庫爾羊瘤胃菌群在門水平上的組成和相對豐度

湖羊和卡拉庫爾羊瘤胃菌群在屬水平上的組成和相對豐度如表4所示。本試驗在屬水平上共鑒定出130個細(xì)菌屬，在至少1個品種羊中相對豐度大于1%的菌屬有10個。湖羊的優(yōu)勢菌屬有為奎恩氏菌屬(46.43%)、丁酸弧菌屬(6.34%)和克里斯滕森菌科_R-7_群(5.72%)；卡拉庫爾羊的優(yōu)勢菌屬為普雷沃氏菌屬_1(18.20%)、克里斯滕森菌科_R-7_群(17.09%)和奎恩氏菌屬(6.97%)。湖羊奎恩氏菌屬的相對豐度極顯著高于卡拉庫爾羊(P<0.01)，丁酸弧菌屬的相對豐度顯著高于卡拉庫爾羊(P<0.05)；卡拉庫爾羊克里斯滕森菌科_R-7_群、普雷沃氏菌屬_1、瘤胃球菌科_NK4A214、Uncultured_bacterium_o_WCHB1-41、Uncultured_bacterium_o_Mollicutes_RF39的相對豐度極顯著高于湖羊(P<0.01)，毛螺旋菌科_XPB1014_群、解琥珀酸菌屬、瘤胃球菌科_UCG-014的相對豐度顯著高于湖羊(P<0.05)。

表4 湖羊與卡拉庫爾羊瘤胃細(xì)菌菌群在屬水平上的相對豐度

2.4 湖羊與卡拉庫爾羊瘤胃菌群代謝途徑和功能預(yù)測

湖羊在細(xì)胞過程和環(huán)境信息處理2個生物代謝通路的富集高于卡拉庫爾羊(圖2)；卡拉庫爾羊在生物系統(tǒng)和遺傳信息處理2個生物代謝通路的富集高于湖羊。進(jìn)一步對預(yù)測基因二級功能層進(jìn)行分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)湖羊在傳染病(細(xì)菌)、細(xì)胞運動、輔因子和維生素的代謝、能量代謝以及折疊、修飾和降解等生物代謝通路的富集高于卡拉庫爾羊；而卡拉庫爾羊在核苷酸代謝、脂質(zhì)代謝、復(fù)制和修復(fù)、氨基酸代謝、其他次生代謝物的生物合成、碳水化合物代謝、翻譯、老化、膜運輸?shù)确矫嫔锎x通路的富集高于湖羊。

Organismal systems：生物系統(tǒng)；Cellular processes：細(xì)胞過程；Environmental information processing：環(huán)境信息處理；Human diseases：人類疾??；Genetic information processing：遺傳信息處理。

Circulatory system：循環(huán)系統(tǒng)；Drug resistance: antimicrobial：耐藥性(抗菌)；Nucleotide metabolism：核苷酸代謝；Lipid metabolism：脂質(zhì)代謝；Infectious diseases: bacterial：傳染病(細(xì)菌)；Replication and repair：復(fù)制和修復(fù)；Signaling molecules and interaction：信號分子和相互作用；細(xì)胞運動：Cell motility；輔因子和維生素的代謝：Metabolism of cofactors and vitamins；Immune diseases：免疫疾病；Energy metabolism：能量代謝；Amino acid metabolism：氨基酸代謝；Biosynthesis of other secondary metabolites：其他次生代謝物的生物合成；Nervous system：神經(jīng)系統(tǒng)；Cancers: specific types：癌癥：特定類型；Neurodegenerative diseases：神經(jīng)退行性疾病；Transcription：轉(zhuǎn)錄；Carbohydrate metabolism：碳水化合物代謝；Excretory system：排泄系統(tǒng)；Translation：翻譯；Folding, sorting and degradation：折疊、分類和降解；Infectious diseases: parasitic：傳染病(寄生蟲)；Aging：老化；Global and overview maps：全局和概覽圖；Environmental adaptation：環(huán)境適應(yīng)；Metabolism of terpenoids and polyketides：萜類化合物和聚酮化合物的代謝；Cardiovascular diseases：心血管疾病；Membrane transport：膜運輸。

3 討 論

瘤胃微生物對反芻動物的生產(chǎn)性能、營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收有著重要的意義。動物品種被證明是影響反芻動物瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的重要因素[14]。Chang等[15]研究表明，藏綿羊的瘤胃菌群豐富度和多樣性均顯著高于小尾寒羊和杜波羊。Huang等[16]報道，西藏綿羊比甘肅高山細(xì)毛羊更能適應(yīng)高原惡劣環(huán)境的原因可能是西藏綿羊瘤胃菌群組成更多樣性。本研究中卡拉庫爾羊的瘤胃菌群豐富度和多樣性均高于湖羊，暗示卡拉庫爾羊?qū)Νh(huán)境擁有更好的適應(yīng)能力。

在本研究中湖羊與卡拉庫爾羊的優(yōu)勢菌門均為厚壁菌門和擬桿菌門，且厚壁菌門的相對豐度高于擬桿菌門。這與眾多研究描述的瘤胃內(nèi)厚壁菌門的相對豐度高于擬桿菌門的結(jié)果[17-18]相一致，但與一些研究描述的擬桿菌門相對豐度高于厚壁菌門的報道[19-20]不同。這可能與羊的品種、飼糧結(jié)構(gòu)及飼養(yǎng)環(huán)境的差異有關(guān)。厚壁菌門和擬桿菌門被報道是瘤胃內(nèi)最豐富的菌門[21]，其中厚壁菌門主要與瘤胃內(nèi)纖維的降解和脂肪的沉積有關(guān)[22-23]，而擬桿菌門主要參與淀粉的降解過程[21]。Fernando等[24]研究發(fā)現(xiàn)，牛瘤胃菌群中厚壁菌門與擬桿菌門的比值隨著飼糧結(jié)構(gòu)中粗飼料占比的增加而增加。本研究中湖羊與卡拉庫爾羊優(yōu)勢菌門中厚壁菌門的相對豐度更高，這與本試驗采用的是高粗飼料占比的飼糧結(jié)構(gòu)相一致。

在本試驗中湖羊的優(yōu)勢菌屬是奎恩氏菌屬、丁酸弧菌屬和克里斯滕森菌屬_R-7_群；卡拉庫爾羊的優(yōu)勢菌屬為普雷沃氏菌屬_1、克里斯滕森菌屬_R-7_群和奎恩氏菌屬?？魇暇鷮俦粓蟮乐饕獏⑴c瘤胃內(nèi)碳水化合物的降解過程[25]，本試驗中湖羊奎恩氏菌屬的相對豐度極顯著高于卡拉庫爾羊，表明湖羊可能在消化富含非纖維碳水化合物的飼糧時更具優(yōu)勢?？死锼闺芲R-7_群是參與蛋白質(zhì)降解過程的主要菌屬[26]。普雷沃氏菌和丁酸弧菌被證明與瘤胃內(nèi)纖維的降解過程相關(guān)[27-29]。其中普雷沃氏菌屬于擬桿菌門，是瘤胃內(nèi)最活躍的菌屬，不僅參與纖維素的降解過程，還與瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)、可溶性碳水化合物和半纖維素的降解相關(guān)[30-31]。提高飼糧中精料的占比會引起普雷沃氏菌相對豐度的增加[32]，而當(dāng)飼糧結(jié)構(gòu)中粗飼料占比高時也會引起普雷沃氏菌的大量增殖[33]。其原因可能是普雷沃氏菌既參與蛋白質(zhì)和碳水化合物的降解和過程，又是瘤胃內(nèi)主要的纖維素菌?？ɡ瓗鞝栄虻钠绽孜质暇鷮賍1的相對豐度極顯著高于湖羊，這或許是卡拉庫爾羊具有更強(qiáng)適應(yīng)性的原因。本試驗未能開展更多品種和飼糧結(jié)構(gòu)對反芻動物瘤胃菌群影響的綜合研究，具有一定的局限性，因此，后期需要綜合研究品種和飼糧結(jié)構(gòu)對反芻動物瘤胃菌群的影響作用。

KEGG代謝途徑常用來分析微生物群落的功能基因在代謝途徑上的差異，是研究群落樣本為適應(yīng)環(huán)境變化發(fā)生的代謝功能改變的有效手段[34]。在本試驗中，湖羊在傳染病(細(xì)菌)、免疫疾病、能量代謝以及折疊、分類和降解等生物代謝通路的富集高于卡拉庫爾羊；而卡拉庫爾羊則在核苷酸代謝、復(fù)制和修復(fù)、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、膜運輸?shù)壬锎x通路的富集更高。其中微生物的復(fù)制和修復(fù)、核苷酸代謝通路被證明與細(xì)菌增長密切相關(guān)[35]。本試驗中卡拉庫爾羊瘤胃菌群的多樣性和豐富度均高于湖羊組，說明卡拉庫爾羊良好的適應(yīng)性可能與其瘤胃微生物的復(fù)制和修復(fù)、核苷酸代謝通路的表達(dá)有關(guān)。李勇[36]研究表明，瘤胃內(nèi)許多微生物能夠共享代謝通路，瘤胃微生物的差異性并不會改變瘤胃微生物的功能。因此，造成瘤胃菌群代謝途徑差異的原因尚需要更加深入的研究。

4 結(jié) 論

湖羊與卡拉庫爾羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)和瘤胃微生物的代謝通路具有一定的相似性，但卡拉庫爾羊瘤胃菌群的多樣性和豐富度均高于湖羊，一些特異性菌屬相對豐度和生物代謝通路富集的差異可能與卡拉庫爾羊適應(yīng)高粗飼料飼糧的特性有關(guān)。