孫紀(jì)，蘇恒，聊曉玉，桂文琪，方媛，韓嵐*，彭代銀*（1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230000；2. 中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230000；3. 安徽道地中藥材品質(zhì)提升協(xié)同創(chuàng)新中心，合肥230000；. 安徽康和中藥科技有限公司，安徽 亳州 236000）

腦小血管病（CSVD）是直徑介于40～200 μm的腦血管病變引起的綜合征[1]，臨床表現(xiàn)為腦白質(zhì)病變、腦微出血、腔隙性梗死等[2]。研究表明，CSVD與癡呆、卒中等疾病關(guān)系密切，約有45%的血管性癡呆和20%的缺血性卒中由CSVD引起[3]。西醫(yī)治療CSVD主要通過(guò)溶栓藥、降壓藥、抗血小板等早期干預(yù)，效果不佳且不良反應(yīng)較大。中醫(yī)理論認(rèn)為CSVD屬“絡(luò)病”范疇，治法為扶正祛邪，中藥治絡(luò)病效果顯著，不良反應(yīng)較少，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

紅曲（red yeast rice，HQ）為藥食兩用中藥，生產(chǎn)歷史悠久，藥用記載始于《飲膳正要》[4]。2020年版《中國(guó)藥典》[5]記載紅曲為紫色紅曲霉Monascus purpureusWent寄生于粳米發(fā)酵而得。其味甘，性溫，無(wú)毒，歸肝、脾經(jīng)，有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)功效。現(xiàn)代藥理研究表明，紅曲成分中MonacolinK及其衍生物、紅曲色素、γ-氨基丁酸等具有顯著的降血脂、降血壓、神經(jīng)保護(hù)、改善微循環(huán)等作用[6-7]，提示紅曲可作為治療CSVD的潛在藥物。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于生物信息學(xué)、藥理學(xué)等的綜合性學(xué)科，通過(guò)構(gòu)建生物分子互作網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)化詮釋分子作用機(jī)制[8]。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法構(gòu)建紅曲“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，獲取相關(guān)成分、靶點(diǎn)、通路信息，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，探討紅曲治療CSVD的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件 TCMSP（https：//tcmsp-e.com/）、SwissTargetPrediction數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、GeneCards數(shù) 據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù) 據(jù)庫(kù)（https：//omim.org/）、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//ctdbase.org/）、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.disgenet.org/）、Uniprot（https：//www.uniprot.org/）、STRING 11.0數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//string-db.org/）、DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）、CytoScape 3.7.1軟件。

1.1.2 紅曲成分及作用靶點(diǎn)收集 通過(guò)PubChem、SwissTargetPrediction及文獻(xiàn)收集紅曲成分，根據(jù)里賓斯基五規(guī)則進(jìn)行篩選。將紅曲成分文件上傳至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇物種為“Homo sapiens”，獲取紅曲作用靶點(diǎn)，并對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行去重整合。

1.1.3 CSVD疾病靶點(diǎn)篩選 將“Cerebral Small Vessel Disease”輸入GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)尋找CSVD疾病靶點(diǎn)。

1.1.4 交集靶點(diǎn)Venny分析 登入Venny 2.1網(wǎng)站，將CSVD疾病靶點(diǎn)信息輸入List 1，紅曲作用靶點(diǎn)輸入List 2，獲取交集靶點(diǎn)信息。

1.1.5 構(gòu)建紅曲“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 利用CytoScape 3.7.1軟件構(gòu)建藥物紅曲“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)CytoScape 3.7.1軟件工具NetworkAnalyzer對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，收集主要活性成分及靶點(diǎn)度值（degree）信息。

1.1.6 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將“1.1.4”項(xiàng)下的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“Homo sapiens”，置信度區(qū)間大于0.4，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。利用CytoScape 3.7.1軟件進(jìn)行參數(shù)分析，以大于Degree均值為條件篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.1.7 GO和KEGG富集分析 選擇獲取的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)，限定物種為“Homo sapiens”，獲取GO、KEGG富集結(jié)果并進(jìn)行可視化分析。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 儀器與試藥 酶標(biāo)儀（318MC，美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；石蠟包埋機(jī)（YB-7B，孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；離心機(jī)（LC-4016，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（BHWY-100BC，常州杰博森儀器有限公司）；紅曲（批號(hào)：210201，毫州市京皖中藥飲片廠），經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源室鑒定為正品。TNF-α、IL-6、IL-1β試劑盒（睿信生物公司）；尼莫地平（批號(hào)：200108，亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）。

1.2.2 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性大鼠，體質(zhì)量 200～230 g[杭州醫(yī)學(xué)院，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0002，動(dòng)物倫理編號(hào)：AHUCM-rats-2021051]。

1.2.3 紅曲水提液的制備 取紅曲原料藥，粉碎，過(guò)篩，加入藥物總量10倍的水煎煮1 h后，過(guò)濾并保留濾液，再加入藥物總量8倍的水煎煮1 h，過(guò)濾并保留濾液；合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮成3 g·kg－1的提取液備用。

1.2.4 CSVD模型大鼠的復(fù)制 健康雄性SD大鼠200～230 g，麻醉后鈍性分離右頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）采用絲線于右側(cè)CCA遠(yuǎn)、近心端進(jìn)行永久性結(jié)扎，距離約1.5 cm左右，結(jié)扎完成后縫合皮膚，放回籠中飼養(yǎng)。7 d后永久性結(jié)扎左側(cè)CCA，操作步驟同上。假手術(shù)組僅分離CCA，不進(jìn)行結(jié)扎操作。大鼠出現(xiàn)癲癇、偏癱等異常行為則判斷模型復(fù)制成功。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組與給藥 大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為假手術(shù)組、模型組、紅曲高劑量組（3 g·kg－1）、紅曲中劑量組（1.5 g·kg－1）、紅曲低劑量組（0.75 g·kg－1）、尼莫地平組（20 mg·kg－1），按體質(zhì)量灌胃給藥，假手術(shù)組、模型組灌胃等量生理鹽水，每日一次，連續(xù)30 d。

1.2.6 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 水迷宮為黑色圓形水池，等分為4個(gè)象限，平臺(tái)置于象限中。將大鼠面向池壁從4個(gè)象限隨機(jī)選擇入水點(diǎn)，記錄其在2 min內(nèi)尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間，即逃避潛伏期；撤除平臺(tái)，從平臺(tái)所在象限對(duì)側(cè)選入水點(diǎn)，觀察其在2 min內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)。實(shí)驗(yàn)為期5 d，前4 d用于訓(xùn)練大鼠，第5日進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 海馬CA1區(qū)病理觀察 各組大鼠麻醉后，從胸膛部剪開(kāi)暴露心臟，用4%多聚甲醛進(jìn)行灌注，灌注完成后將大鼠斷頭取腦，隨后用石蠟包埋、切片，于顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)。

1.2.8 指標(biāo)檢測(cè) 大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min，3000 r·min－1離心10 min，收集上層血清，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.9 Western blot實(shí)驗(yàn) 大鼠斷頭處死，迅速取出海馬組織置于冰上，剪碎，按每20 mg組織加入150～250 μL裂解液的比例加入裂解液，勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃、12 000 r·min－1離心15 min，取上清液，定量后貯存于－80℃冰箱用于蛋白測(cè)定，結(jié)果用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析方法

各組數(shù)據(jù)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”表示，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)研究

2.1.1 紅曲成分及作用靶點(diǎn)收集 經(jīng)篩選共獲得43種紅曲主要成分，包含Monacolin類(lèi)、紅曲色素類(lèi)、十氫萘衍生物、有機(jī)酸等；將紅曲成分上傳至SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，去重合并共獲得391個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。

2.1.2 紅曲作用靶點(diǎn)及CSVD疾病及預(yù)測(cè)“Cerebral Small Vessel Disease”作為檢索信息輸入GeneCards、OMIM、DisGeNET、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)尋找治療CSVD疾病的靶點(diǎn)，去重合并后共獲得1126個(gè)疾病靶點(diǎn)。

2.1.3 交集靶點(diǎn)收集 登入Venny 2.1網(wǎng)站，將1126個(gè)CSVD疾病靶點(diǎn)和391個(gè)紅曲作用靶點(diǎn)信息輸入列表，共獲得交集靶點(diǎn)91個(gè)。

2.1.4 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 如圖1所示，利用CytoScape 3.7.1軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用軟件內(nèi)置工具NetworkAnalyzer對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，收集活性成分度值（Degree）信息，結(jié)果顯示Degree值排名靠前的成分有Monacolin K、Monacolin J、Ankaflavin等，提示上述成分可能在紅曲治療CSVD過(guò)程中起重要作用。

圖1 紅曲“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Red yeast rice “drug-component-target” network

2.1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖2所示。結(jié)果顯示PPI網(wǎng)絡(luò)有91個(gè)節(jié)點(diǎn)，752條邊，平均Degree值為16.7，EGFR、MAPK1、ESR1、CLCX8等大于Degree均值關(guān)鍵靶點(diǎn)共計(jì)37個(gè)，提示這些蛋白可作為紅曲治療CSVD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Protein-protein interaction network

2.1.6 GO和KEGG富集分析 運(yùn)用DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO和KEGG分析，GO分析結(jié)果涉及171個(gè)生物過(guò)程，33個(gè)細(xì)胞組分和51個(gè)分子功能，選取排名前10結(jié)果繪制條形柱狀圖，如圖3所示；結(jié)果表明紅曲中的活性成分可能通過(guò)參與神經(jīng)炎癥、細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程發(fā)揮治療CSVD作用。KEGG分析得到104個(gè)通路，選取排名前20通路繪制氣泡圖，如圖4所示。去除與CSVD無(wú)關(guān)的通路，獲得PI3K-Akt信號(hào)通路、RAS信號(hào)通路等。其中，PI3K-Akt信號(hào)通路的count值最大，表示該差異蛋白富集顯著性較大。近年來(lái)的研究已證實(shí)PI3K-Akt信號(hào)通路在癡呆類(lèi)腦血管病中的治療是通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶蛋白mTOR、GSK3β等的活性，介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、增殖過(guò)程，因此選擇PI3K-AKT-mTOR通路作為機(jī)制研究對(duì)象。

圖3 GO富集分析Fig 3 GO enrichment analysis

圖4 KEGG通路富集分析Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 如表1所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)（P＜0.01），撤去平臺(tái)后穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少（P＜0.01），表明模型復(fù)制成功；與模型組相比，紅曲高、中劑量組及尼莫地平組逃避潛伏期顯著減少，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加（P＜0.05或P＜0.01），紅曲低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 紅曲對(duì)CSVD 模型大鼠逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)的影響( ±s，n＝10)Tab 1 Effect of HQ on the escape latency and the number of crossing platforms in CSVD model rats ( ±s，n＝10)

表1 紅曲對(duì)CSVD 模型大鼠逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)的影響( ±s，n＝10)Tab 1 Effect of HQ on the escape latency and the number of crossing platforms in CSVD model rats ( ±s，n＝10)

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the sham group，##P＜0.01；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別 劑量 逃避潛伏期/s 穿越平臺(tái)次數(shù)/次假手術(shù)組 － 14.37±5.39 8.30±1.42模型組 － 39.92±4.59## 2.10±1.37##紅曲高劑量組 3 g·kg－1 24.16±5.29** 5.20±1.40**紅曲中劑量組 1.5 g·kg－1 29.86±4.81** 4.50±1.96*紅曲低劑量組 0.75 g·kg－1 37.27±7.80 2.70±1.55尼莫地平組 20 mg·kg－1 23.96±4.98** 5.40±1.80**

2.2.2 大鼠海馬組織病理 如圖5所示，假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列整齊，形態(tài)完整，可明顯觀察到核仁和胞漿；與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列松散，細(xì)胞較為稀疏，細(xì)胞多呈不規(guī)則形，核仁和胞漿界限不清晰，提示造模成功；與模型組相比，紅曲各劑量組及尼莫地平組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列趨于規(guī)則、緊密，病變程度均有明顯改善，表明紅曲對(duì)CSVD模型大鼠的海馬組織具有一定的保護(hù)作用。

圖5 CSVD模型大鼠海馬CA1區(qū)HE染色（×200）Fig 5 HE staining of CA1 area of hippocampus in CSVD model rats（×200）

2.2.3 指標(biāo)測(cè)定 如表2所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著增高（P＜0.01）；與模型組相比，紅曲高、中劑量組及尼莫地平組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），紅曲低劑量組大鼠血清中TNF-α、IL-1β水平顯著降低（P＜0.05），IL-6水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明紅曲能顯著降低CSVD大鼠血清中炎癥因子水平，顯示出紅曲具有良好的抗炎作用。

表2 紅曲對(duì)CSVD大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子的影響( ±s，n＝10)Tab 2 Effect of HQ on TNF-α，IL-6 and IL-1β inflammatory factors in serum of CSVD rats ( ±s，n＝10)

表2 紅曲對(duì)CSVD大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子的影響( ±s，n＝10)Tab 2 Effect of HQ on TNF-α，IL-6 and IL-1β inflammatory factors in serum of CSVD rats ( ±s，n＝10)

注：與假手術(shù)組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note：Compared with the sham group，##P＜0.01；compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01.

組別 TNF-α/（ng·L－1）IL-6/（ng·L－1）IL-1β/（ng·L－1）假手術(shù)組 312.58±24.79 46.32±6.27 28.71±7.62模型組 491.52±39.89## 70.23±12.37## 42.37±4.36##紅曲高劑量組 372.62±45.59** 54.41±10.77** 30.44±6.23**紅曲中劑量組 394.23±20.35* 62.32±13.27** 32.25±5.27*紅曲低劑量組 412.61±49.58* 68.45±5.86 34.36±5.86*尼莫地平組 336.65±25.95** 50.37±10.68** 31.25±4.68**

2.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 蛋白電泳結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬區(qū)PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，紅曲高、中劑量組及尼莫地平組PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），紅曲低劑量組PI3K、mTOR表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Akt蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明紅曲可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3KAKT-mTOR通路，調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞增值、凋亡過(guò)程，發(fā)揮對(duì)于CSVD模型大鼠的治療作用。

圖6 各組大鼠海馬區(qū)PI3K，Akt，mTOR蛋白表達(dá)水平圖（ ±s，n＝3）Fig 6 Expression levels of PI3K，Akt and mTOR protein in the hippocampus of each group of rats（ ±s，n＝3）

3 討論

CSVD是臨床常見(jiàn)的腦血管疾病，與高血脂、高血壓等危險(xiǎn)因素關(guān)系密切[9]。中醫(yī)理論尚未明確定義CSVD，通常認(rèn)為其屬于絡(luò)病，病位在腦，由濁邪入血，入髓傷髓所致[10]。臨床治療CSVD應(yīng)以活血化瘀、化濁益髓的中藥為主[11]。紅曲具有活血化瘀、健脾消食的功效，臨床上常用的中成藥血脂康、脂必妥均以紅曲為主要成分，廣泛用于治療高血脂、動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管病等[12-14]，可作為治療CSVD的潛在藥物。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選獲得Monacolin K、Ankaflavin、GABA等43個(gè)紅曲活性成分，PIK3CA、MTOR、MAPK1等1126個(gè)腦小血管病靶點(diǎn)；PPI網(wǎng)絡(luò)分析共發(fā)現(xiàn)91個(gè)節(jié)點(diǎn)，752條邊，平均Degree值為16.7，獲得EGFR、MAPK1、ESR1等37個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)；GO分析結(jié)果涉及171個(gè)生物過(guò)程、33個(gè)細(xì)胞組分、51個(gè)分子功能，主要涉及神經(jīng)炎癥、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖等。研究表明，神經(jīng)炎癥在腦血管疾病的發(fā)展中起重要作用，降低相關(guān)炎癥因子如TNF-α、IL-6、IL-1β等水平，可改善血腦屏障通透性，減輕腦組織損傷，促使大腦結(jié)構(gòu)功能恢復(fù)正常[15-16]。KEGG分析結(jié)果得到104個(gè)通路，主要有PI3K-Akt、Rap1、RAS通路等，PI3K-Akt通路研究較為廣泛，其在腦卒中、血管性癡呆等疾病的治療中起著重要作用。Qi等[17]研究發(fā)現(xiàn)3-丁基苯酞（NBP）能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路抑制CSVD大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，恢復(fù)細(xì)胞基本功能，提高大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。Chen等[18]研究表明人參皂苷Rg1可通過(guò)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路增加缺血性卒中后血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)腦內(nèi)血管生成，改善腦血流量。

本研究選擇不同劑量紅曲干預(yù)CSVD模型大鼠，探究其作用機(jī)制，對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅曲能顯著縮短CSVD大鼠的逃避潛伏期，增加穿越平臺(tái)次數(shù)，表明紅曲顯著改善CSVD模型大鼠的短期學(xué)習(xí)記憶能力；HE病理切片結(jié)果顯示紅曲治療組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)完整、排列整齊，核仁和胞漿界限清晰，不同劑量紅曲治療組海馬CA1區(qū)病變程度均有明顯改善，高、中劑量效果較為明顯；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)GO分析結(jié)果表明，紅曲治療CSVD可能與神經(jīng)炎癥、細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過(guò)程相關(guān)，其中神經(jīng)炎癥在CSVD發(fā)展過(guò)程起重要作用。生化指標(biāo)結(jié)果顯示，不同劑量紅曲治療組可顯著降低CSVD模型大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子水平，其效果呈劑量依賴(lài)性；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果顯示紅曲中Monacolin類(lèi)、紅曲色素等為其活性成分，本研究結(jié)果中紅曲能顯著降低TNF-α、IL-6、IL-1β水平可能與上述成分有關(guān)。KEGG分析結(jié)果顯示，涉及CSVD的有PI3K-Akt、RAS、Rap1信號(hào)通路等。研究表明PI3K-Akt信號(hào)通路可通過(guò)調(diào)節(jié)下游靶蛋白mTOR活性，參與自噬清除β淀粉樣蛋白的沉積、恢復(fù)細(xì)胞功能等發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[17-18]；Western blot結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組PI3K、AKT、mTOR蛋白水平顯著降低；與模型組相比，紅曲治療組可不同程度增加PI3K、AKT、mTOR蛋白水平，提示紅曲可通過(guò)上調(diào)PI3K/AKT/mTOR蛋白的表達(dá)，參與調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞增殖、分化、凋亡等發(fā)揮治療CSVD的作用。

綜上，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接，構(gòu)建紅曲治療CSVD的成分、疾病、作用靶點(diǎn)、相關(guān)通路之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，展現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的治療優(yōu)勢(shì)。通過(guò)Morris水迷宮，海馬組織HE染色，TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子檢測(cè)，PI3K、AKT、mTOR蛋白測(cè)定等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，初步揭示了紅曲治療CSVD的藥效機(jī)制，可為后期深入探究其治療CSVD機(jī)制提供理論依據(jù)。