趙佳鑫，張娟利，馬陽，黃少杰，陳海霞，牟菲，文愛東，*，丁一*（.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 7046；.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，西安 7003）

冠狀動脈粥樣硬性化心臟病簡稱為“冠心病”（coronary heart disease，CHD），是由于冠狀動脈硬化導(dǎo)致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病。據(jù)《中國心血管健康與疾病2020》報(bào)告，自2018年以來，我國冠心病患者的死亡率快速增加，冠心病已經(jīng)成為危害國人生命健康的重要疾病之一。

活絡(luò)效靈丹出自于我國著名醫(yī)家張錫純的《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，是用于治療氣血凝滯、心腹疼痛的著名方劑。該方由四味中藥組成，分別是丹參（

Salvia miltiorrhiza

Bge）、當(dāng)歸（

Angelica sinensis Oliv.

Diels）、乳香（

Boswellia carterii

Birdw）和沒藥（

Commiphora myrrha

Engl）。方中當(dāng)歸和丹參能活血祛瘀、涼血消癰又兼以養(yǎng)血；而乳香、沒藥可以活血行氣、通經(jīng)活絡(luò)。四藥配伍共同發(fā)揮活血通絡(luò)，止痛祛瘀的功效。白幸華等利用丹參飲聯(lián)合活絡(luò)效靈丹加味治療急性心肌梗死并發(fā)急性左心衰不僅取得了良好的治療效果，而且無不良反應(yīng)發(fā)生；楊德林在活絡(luò)效靈丹的基礎(chǔ)方劑上加味治療冠心病解除了冠狀動脈痙攣?；罱j(luò)效靈丹雖在臨床中應(yīng)用頻繁，但其在治療冠心病方面缺乏深入的研究，尤其是有效成分和作用機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步的研究。

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已經(jīng)成為研究中藥的一種非常有效的科研方法，它可以系統(tǒng)、全面地揭示中藥生物活性成分與其潛在作用機(jī)制之間的關(guān)系，因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法，探究活絡(luò)效靈丹治療冠心病的分子作用機(jī)制，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥與儀器

活絡(luò)效靈丹（北京同仁堂，由丹參、當(dāng)歸、生明乳香、生明沒藥組成），GAPDH 抗體（批號：2118s，CST）；4%多聚甲醛組織固定液（批號：G1101）、PTGS2 抗體（批號：GB11077-1，GB11077-2）、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（批號：GB23303）（武漢塞維爾）。RM2016病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；NIKON ECLIPSE C1 正置熒光顯微鏡（日本尼康）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號：A020-2，南京建成）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

雄性SD 大鼠40 只，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SCKX（軍）字第2007-007 號]，體質(zhì)量200 ～250 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，期間自由飲水，12 h 循環(huán)光照，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)庫、分析平臺及軟件

本研究使用的數(shù)據(jù)庫、分析平臺及軟件信息見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫、分析平臺及軟件信息
Tab 1 Database，data analysis platform and software information

名稱網(wǎng)址TCMSP 2.3https：//tcmspw.com/tcmsp.php GeneCardshttps：//www.genecards.org/DrugBankhttps：//go.drugbank.com/Uniprothttps：//www.uniprot.org/OMIMhttps：//omim.org/DisGeNEThttps：//www.disgenet.org/search DAVID 6.8https：//david.ncifcrf.gov/ImageGPhttp：//www.ehbio.com/ImageGP PDBhttps：//www.rcsb.org/STRINGhttps：//string-db.org/Cytoscape 3.7.1https：//cytoscape.org/

2 方法與結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 活絡(luò)效靈丹活性成分篩選及相關(guān)靶點(diǎn)收集 在TCMSP2.3 數(shù)據(jù)庫中分別以“丹參”“當(dāng)歸”“乳香”和“沒藥”為關(guān)鍵詞檢索四味中藥的化學(xué)成分，以類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，上皮滲透性（Caco-2）≥－0.4 和藥物半衰期（HL）≥4 為篩選條件并去重后獲得活絡(luò)效靈丹83 個(gè)有效成分，其中丹參48 個(gè)，當(dāng)歸2 個(gè)，乳香4 個(gè)和沒藥31 個(gè)。然后，通過TCMSP2.3收集靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)共有67 個(gè)有效成分有靶點(diǎn)（見表2），16 個(gè)有效成分未收到相關(guān)靶點(diǎn)，將所有靶點(diǎn)合并去重后使用Uniport 數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化為基因名稱，共收集到216 個(gè)靶點(diǎn)。

表2 活絡(luò)效靈丹中有靶點(diǎn)的67 個(gè)有效成分表
Tab 2 Information of 67 compounds with targets in Huoluo Xiaoling pill

No.化合物 ID成分名稱OB 上皮滲透性 DLHL 來源藥材1MOL001601 1，2，5，6-tetrahydrotanshinone38.750.960.36 18.05丹參2MOL001659 poriferasterol43.831.440.765.34丹參3MOL001771 poriferast-5-en-3beta-ol36.911.450.755.07丹參4MOL002222 sugiol36.111.140.28 14.62丹參5MOL002651 dehydrotanshinone Ⅱ A43.761.020.423.71丹參6MOL000006 luteolin36.160.190.25 15.94丹參7MOL007036 5，6-dihydroxy-7-isopropyl-1，1-dimethyl-2，3-dihydrophenanthren-4-one 33.771.190.29 14.91丹參8MOL007041 2-isopropyl-8-methylphenanthrene-3，4-dione40.861.230.23 14.89丹參9MOL007045 3α-hydroxytanshinoneⅡa44.930.530.44 23.78丹參10 MOL007048（E）-3-[2-（3，4-dihydroxyphenyl）-7-hydroxy-benzofuran-4-yl]acrylic acid 48.240.180.318.87丹參11MOL007049 4-methylenemiltirone34.351.250.23 14.6丹參12 MOL007050 2-（4-hydroxy-3-methoxyphenyl）-5-（3-hydroxypropyl）-7-methoxy-3-benzofurancarboxaldehyde 62.780.350.47.89丹參13 MOL007058 formyltanshinone73.440.540.42 24.12丹參14 MOL007059 3-beta-hydroxymethyllenetanshiquinone32.160.380.41 22.51丹參15 MOL007061 methylenetanshinquinone37.071.030.36 24.33丹參16 MOL007068 przewaquinone B62.240.390.41 24.94丹參17 MOL007069 przewaquinone c55.740.420.423.7丹參18 MOL007070（6S，7R）-6，7-dihydroxy-1，6-dimethyl-8，9-dihydro-7H-naphtho[8，7-g]benzofuran-10，11-dione 41.31－0.060.45 22.54丹參19 MOL007071 przewaquinone f40.31－0.090.46 22.45丹參20 MOL007077 sclareol43.670.840.214.71丹參21 MOL007079 tanshinaldehyde52.470.570.45 23.49丹參22 MOL007081 danshenol B57.950.530.564.28丹參23 MOL007082 danshenol A56.970.330.525.15丹參24 MOL007085 salvilenone30.381.460.38 20.81丹參25 MOL007088 cryptotanshinone52.340.950.417.3丹參26 MOL007093 dan-shexinkum d38.880.670.55 30丹參27 MOL007094 danshenspiroketallactone50.430.880.31 15.19丹參28 MOL007098 deoxyneocryptotanshinone49.40.850.29 27.17丹參29 MOL007100 dihydrotanshinlactone38.681.260.325.42丹參30 MOL007101 dihydrotanshinoneⅠ45.040.950.36 18.32丹參31 MOL007108 isocryptotanshi-none54.980.930.39 31.92丹參

續(xù)表2

No.化合物 ID成分名稱OB 上皮滲透性 DLHL 來源藥材32MOL007111 isotanshinone Ⅱ49.921.030.424.73丹參33MOL007115 manool45.041.280.25.81丹參34MOL007119 miltionone Ⅰ49.680.350.32 41.49丹參35 MOL007122 miltirone38.761.230.25 14.82丹參36 MOL007124 neocryptotanshinone Ⅱ39.460.760.23 26.98丹參37 MOL007125 neocryptotanshinone52.490.350.32 14.46丹參38 MOL007127 1-methyl-8，9-dihydro-7H-naphtho[5，6-g]benzofuran-6，10，11-trione34.720.50.37 37.89丹參39 MOL007130 prolithospermic acid64.370.10.318.82丹參40 MOL007150（6S）-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8，9-dihydro-7H-naphtho[8，7-g]benzofuran-10，11-quinone 75.390.030.46 23.45丹參41 MOL007151 tanshindiol B42.670.050.45 22.25丹參42 MOL007152 przewaquinone E42.85－0.040.45 22.44丹參43 MOL007154 tanshinone ⅡA49.891.050.423.56丹參44 MOL007155（6S）-6-（hydroxymethyl）-1，6-dimethyl-8，9-dihydro-7H-naphtho[8，7-g]benzofuran-10，11-dione 65.260.440.45 23.48丹參45 MOL007156 tanshinone Ⅵ45.640.480.315.21丹參46 MOL000358 beta-sitosterol36.911.320.755.36 當(dāng)歸、沒藥47 MOL000449 stigmasterol43.831.440.765.57 當(dāng)歸、沒藥48 MOL001006 poriferasta-7，22E-dien-3beta-ol42.981.450.765.48沒藥49 MOL001013 mansumbinoic acid48.110.326.67沒藥50 MOL001022 11α-hydroxypregna-4，17（20）-trans-diene-3，16-dione36.620.820.474.53沒藥51 MOL001031 epimansumbinol61.811.360.44.71沒藥52 MOL001040（2R）-5，7-dihydroxy-2-（4-hydroxyphenyl）chroman-4-one42.360.380.21 16.83沒藥53 MOL001049 16-hydroperoxymansumbin-13（17）-en-3β-ol41.050.50.495.7沒藥54 MOL001052 mansumbin-13（17）-en-3，16-dione41.780.780.454.29沒藥55 MOL001061（16S，20R）-dihydroxydammar-24-en-3-one37.340.690.787.59沒藥56 MOL001062 15α-hydroxymansumbinone37.511.410.444.73沒藥57 MOL001063 28-acetoxy-15α-hydroxymansumbinone41.850.310.677.85沒藥58 MOL001095 isofouquierone40.950.950.788.48沒藥59MOL001126 [（5aS，8aR，9R）-8-oxo-9-（3，4，5-trimethoxyphenyl）-5，5a，6，9-tetrahydroisobenzofurano[6，5-f][1，3]benzodioxol-8a-yl] acetate 44.080.60.913.01沒藥60MOL001131 phellamurin_qt56.60.140.39 14.89沒藥61MOL001138（3R，20S）-3，20-dihydroxydammar-24-ene37.491.480.756.94沒藥62MOL001156 3-methoxyfuranoguaia-9-en-8-one35.151.040.187.97沒藥63 MOL000098 quercetin46.430.050.28 14.4沒藥64 MOL000988 4，17（20）-（cis）-pregnadiene-3，16-dione51.420.890.484.3沒藥65 MOL000996 guggulsterol Ⅳ33.590.930.744.83沒藥66 MOL001215 tirucallol42.121.380.756.9乳香67 MOL001241 O-acetyl-α-boswellic acid42.730.680.74.13乳香

2.1.2 冠心病靶點(diǎn)的獲取 以“Coronary Heart Disease”為關(guān)鍵詞分別在DisGeNET、DrugBank、GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫中搜索冠心病靶點(diǎn)。為了確保冠心病靶點(diǎn)的準(zhǔn)確性，將DisGeNET 數(shù)據(jù)庫的篩選條件設(shè)置為Score ≥0.3，GeneCards數(shù)據(jù)庫設(shè)置relevance score ≥30。合并4 個(gè)數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果并去重后得到695 個(gè)冠心病靶點(diǎn)。

2.1.3 共有靶點(diǎn)獲取與PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將216 個(gè)活絡(luò)效靈丹的成分靶點(diǎn)與695 個(gè)冠心病靶點(diǎn)取交集獲得50 個(gè)共有靶點(diǎn)。然后，將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫，物種設(shè)置為“人類”的同時(shí)設(shè)置“置信分?jǐn)?shù)≥0.4”獲得PPI 相互作用網(wǎng)絡(luò)。將作用網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1 軟件，利用cytoHubba插件計(jì)算排名前10 的hub 蛋白。結(jié)果顯示hub 蛋白分別為：IL6、TNF、VEGFA、TP53、MMP9、PTGS2、ICAM1、CASP3、CCL2 和IL1

β

，見圖1。

圖1 共有靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 PPI network diagram of common targets

2.1.4 GO 生物富集分析與KEGG 通路富集分析 將共有靶點(diǎn)上傳至DAVID6.8 數(shù)據(jù)庫獲取GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。選取

P

＜0.05 的分析結(jié)果并根據(jù)富集的基因數(shù)目進(jìn)行可視化處理。獲得了258 個(gè)生物學(xué)過程、23 個(gè)細(xì)胞成分以及37 個(gè)分子功能。選擇GO 生物富集分析的10 條結(jié)果繪制柱狀圖見圖2。結(jié)果顯示活絡(luò)效靈丹主要影響凋亡過程負(fù)調(diào)控，正向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)和應(yīng)對缺氧等生物學(xué)過程；對細(xì)胞成分的影響主要在細(xì)胞質(zhì)、生物質(zhì)膜、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等部位；通過與不同的酶結(jié)合，調(diào)控不同細(xì)胞因子活性等方面影響分子功能。通過KEGG 通路富集分析，獲得76 條有效通路。主要涉及炎癥反應(yīng)、凋亡、缺氧反應(yīng)等信號通路，提示活絡(luò)效靈丹可能是通過這些通路發(fā)揮治療冠心病的作用，前20 條通路氣泡圖，見圖3。

圖2 活絡(luò)效靈丹GO 富集分析Fig 2 GO enrichment and analysis of Huoluo Xiaoling pill

圖3 KEGG 通路富集分析結(jié)果前20 展示Fig 3 Top 20 pathways based on KEGG pathway enrichment analysis

2.1.5 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖 基于“2.1.3”項(xiàng)下的hub 蛋白逆向獲得對應(yīng)的有效成分，選取KEGG 富集的前20 條通路繪制“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖。如圖4 所示，通過對網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)在靶點(diǎn)排序中Degree 值排序前5 的靶點(diǎn)分別是PTGS2、TNF、IL6、CASP3 和IL1

β

。在有效成分的Degree 值排序中前5 的有效成分分別是槲皮素、木犀草素、丹參酮ⅡA、

β

-谷甾醇和豆甾醇。提示這些成分與靶點(diǎn)可能是活絡(luò)效靈丹治療冠心病的重要成分與靶點(diǎn)。

圖4 “成分-靶點(diǎn)-通路”圖Fig 4 Component-target-pathway network

2.1.6 分子對接驗(yàn)證核心靶點(diǎn)與有效成分 根據(jù)“成分-靶點(diǎn)-通路”圖篩選出的核心靶點(diǎn)PTGS2、TNF、IL6、CASP3、IL1

β

與核心成分槲皮素、木犀草素、丹參酮ⅡA、

β

-谷甾醇、豆甾醇進(jìn)行兩兩對接。首先，從TCMSP2.3 數(shù)據(jù)庫下載核心成分的結(jié)構(gòu)并以mol2 格式保存。然后從RCSB（PDB）數(shù)據(jù)庫下載核心靶點(diǎn)的配體結(jié)構(gòu)，使用Autodock Vina 對接每個(gè)成分和配體。結(jié)合能＜－5 kcal·mol的對接分?jǐn)?shù)表明該化合物與靶點(diǎn)之間具有良好的結(jié)合活性，結(jié)合能越低，說明結(jié)合活性越好。對接結(jié)果見表3，大部分靶點(diǎn)與有效成分具有較好的結(jié)合活性，提示網(wǎng)絡(luò)藥理預(yù)測的相關(guān)靶點(diǎn)具有較高的可靠性。將結(jié)合活性最強(qiáng)的前6 個(gè)成分靶點(diǎn)對接結(jié)果利用Discovery Studio 可視化，如圖5 所示。

圖5 分子對接結(jié)果可視化Fig 5 Visualization of molecular docking results

表3 活絡(luò)效靈丹核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對接結(jié)果
Tab 3 Docking results of core components and key targets

靶點(diǎn)結(jié)合能/（kcal·mol－1）槲皮素木犀草素丹參酮ⅡAβ-谷甾醇豆甾醇曲美他嗪PTGS2-5KIR－8.5－8.4－8.2－2.9－5－6.9 IL6-4CNI－4－4.4－4.2－3.9－4.4－3.3 TNF-2AZ5－7.7－7.8－8.5－7.8－8.3－5.8 CASP3-3DEI－7.5－7.8－7.6－8.8－8.7－5.8 IL1β-5R88－6.7－7.3－7.1－7.1－7.2－5.4

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.3.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，

P

＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.3.1 大鼠心肌缺血模型建立 將SD 大鼠隨機(jī)分為4 組，假手術(shù)組、模型組（等體積的生理鹽水）、活絡(luò)效靈丹高劑量組（5.4 g·kg）和低劑量組（2.7 g·kg），每組10 只，術(shù)后第1日開始給藥，第7日末次給藥2 h 后麻醉大鼠，腹主動脈取血并收集心臟組織。

分組完成后麻醉大鼠并連接12 導(dǎo)聯(lián)心電圖監(jiān)測心率，經(jīng)口無創(chuàng)插管連接呼吸機(jī)，對左胸進(jìn)行消毒，打開左胸3、4 肋間隙，撕開心包膜，結(jié)扎左心耳下緣以下2 mm 處的左前降支（LAD），最后擠壓胸腔內(nèi)空氣并逐層縫合。隨后放入恒溫箱中等待蘇醒。假手術(shù)組大鼠只開胸，不結(jié)扎。

2.3.2 大鼠血漿LDH 測定 腹主動脈取血收集各組大鼠血液1 ～3 mL，3000 r·min離心20 min 后收集血漿，按照試劑盒步驟嚴(yán)格操作測定LDH 含量，結(jié)果見表4。

表4 大鼠血漿中LDH 含量(±s， ＝3)
Tab 4 Content of plasma LDH in rats of each group (± s， ＝3)

注：與假手術(shù)組相比， ＜0.01；與模型組相比， ＜0.05， ＜0.01。
Note：Compared with the sham operation group， ＜0.01；compared with the model group， ＜0.05， ＜0.01.

組別LDH/（U·L－1）假手術(shù)組1060±141.4模型組1906±209.5**活絡(luò)效靈丹低劑量組1406±185.3#活絡(luò)效靈丹高劑量組1072±94.67##

2.3.3 心肌組織組織病理學(xué)檢查 取新鮮大鼠心臟組織用預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)沖洗后浸泡在4%多聚甲醛中固定24 h，隨后石蠟包埋，制片，脫蠟至水，使用HE 染色和Masson 染色后，置于顯微鏡下觀察心肌組織的病理學(xué)變化并采集圖像，結(jié)果見圖6，HE 染色結(jié)果顯示假手術(shù)組的心肌組織結(jié)構(gòu)排列緊密，細(xì)胞形態(tài)均勻，未見明顯的心肌損傷；與假手術(shù)組相比，模型組心肌組織結(jié)構(gòu)松散，肌纖維嚴(yán)重?cái)嗔?，并伴有大量炎性?xì)胞浸潤和細(xì)胞間質(zhì)水腫；活絡(luò)效靈丹低劑量組心肌結(jié)構(gòu)松散，中度炎性細(xì)胞浸潤和間質(zhì)水腫；活絡(luò)效靈丹高劑量組心肌排列基本完整，少量炎性細(xì)胞浸潤，未見明顯的細(xì)胞間質(zhì)水腫及少量纖維斷裂，說明活絡(luò)效靈丹可以不同程度的減輕心肌損傷與心肌炎癥。

Masson 染色如圖6 所示，假手術(shù)組的心肌組織排列緊密，細(xì)胞核形態(tài)表達(dá)正常，只有少量的纖維沉積；而模型組可見大量膠原沉積和纖維裂層，表明心肌纖維化程度非常嚴(yán)重；與模型組比較，活絡(luò)效靈丹不同劑量組均能明顯的減少膠原纖維的增生，改善心肌纖維化。

圖6 各組大鼠心肌組織HE 染色與Masson 染色（×200）Fig 6 HE staining and Masson staining of the myocardial tissues of rats in each group（×200）

2.3.4 免疫熒光染色法 將心臟組織的石蠟切片脫蠟至水，切片放入抗原修復(fù)緩沖液中隨后加入血清封閉30 min，切片與一抗于4℃下孵育過夜，TBST 洗滌3 次，每次5 min。隨后與二抗室溫避光孵育50 min；重復(fù)上述洗滌步驟后，封片，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。免疫熒光切片和光密度測定結(jié)果如圖7 所示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心臟的PTGS2 蛋白熒光表達(dá)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)（

P

＜0.01）；與模型組相比，活絡(luò)效靈丹低劑量組與高劑量組均能夠顯著降低PTGS2 蛋白的熒光表達(dá)強(qiáng)度（

P

＜0.05，

P

＜0.01）。

圖7 各組心肌組織的PTGS2 熒光染色與半定量分析（×400，n ＝3）Fig 7 PTGS2 fluorescence staining and semi-quantitative analysis in each group（×400，n ＝3）

2.3.5 蛋白免疫印跡法 取新鮮的心肌組織200 mg 加入2 mL 預(yù)制的蛋白裂解液置于冰上打碎勻漿，靜置30 min 后，4℃、12 000 r·min離心15 min。取部分上清液BCA 蛋白法測定蛋白質(zhì)濃度。其余上清液制成蛋白樣品后，12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）中電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗（PTGS2）在4℃下孵育過夜，次日PVDF 膜洗滌3 次后加入二抗并在室溫下孵育1 h，清洗PVDF膜3 次，采用ECL 法進(jìn)行顯色，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（ChemiDOCTM XRS ＋，BIO-RAD）掃描圖像。結(jié)果如圖8 所示，模型組大鼠心肌組織中的PTGS2 蛋白表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組（

P

＜0.01）；與模型組相比，經(jīng)活絡(luò)效靈丹不同劑量組治療后均能夠有效降低PTGS2 的表達(dá)量，尤其是活絡(luò)效靈丹高劑量組的治療效果較為顯著（

P

＜0.05）。

圖8 各組大鼠心肌組織中的PTGS2 蛋白表達(dá)水平（n ＝3）Fig 8 Expression level of PTGS2 protein in the myocardial tissues of rats in each group（n ＝3）

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對活絡(luò)效靈丹防治冠心病的作用靶點(diǎn)和相關(guān)通路進(jìn)行挖掘，探究其可能的分子機(jī)制。并通過PPI 網(wǎng)絡(luò)分析和“成分-靶點(diǎn)-通路”圖篩選出了活絡(luò)效靈丹治療冠心病的5個(gè)核心成分與5 個(gè)核心靶點(diǎn)。最后通過分子對接和動物實(shí)驗(yàn)對其藥效和相關(guān)分子機(jī)制進(jìn)行了初步驗(yàn)證。

通過“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)分析，提示槲皮素、木犀草素、丹參酮ⅡA、

β

-谷甾醇和豆甾醇等可能是活絡(luò)效靈丹治療冠心病的主要成分。何亞磊等通過建立缺血再灌注（MIRI）模型發(fā)現(xiàn)槲皮素可以降低大鼠的IL-6、TNF-

α

和IL-1

β

水平，提示槲皮素可以改善相關(guān)的炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)木犀草素能夠有效降低MIRI 大鼠的NF-

κ

B 表達(dá)，提示木犀草素可能通過NF-

κ

B 信號通路抑制炎癥反應(yīng)。丹參酮ⅡA 可以阻止I

κ

B磷酸化和NF-

κ

B 的激活，從而抑制炎癥反應(yīng)，減輕心肌細(xì)胞凋亡和纖維化過程；

β

-谷甾醇可以降低IL-1

β

、IL-6 和TNF-

α

的水平，抑制炎癥反應(yīng)；同時(shí)，

β

-谷甾醇可以通過PPAR

γ

/NF-

κ

B信號通路發(fā)揮對心肌的保護(hù)作用。豆甾醇與

β

-谷甾醇均為重要的植物甾醇，研究發(fā)現(xiàn)豆甾醇可以降低脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的COX-2 和iNOS蛋白的表達(dá)。PPI 網(wǎng)絡(luò)與“成分-靶點(diǎn)-通路”圖表明PTGS2、TNF、IL-6、CASP3 和IL-1

β

具有較高的Degree 值，可能是活絡(luò)效靈丹治療冠心病的核心靶點(diǎn)。其中，PTGS2、TNF、IL-6 和IL-1

β

均與炎癥過程密切相關(guān)，提示活絡(luò)效靈丹可能主要通過抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮治療冠心病的作用。PTGS2 也稱為環(huán)氧合酶2（COX-2），主要存在于炎癥細(xì)胞內(nèi)，比如組織損傷的內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，在各種炎癥因子的刺激下，COX-2 會上調(diào)損傷部位的PGE2、PGI2 和TXA1 的含量，使炎癥反應(yīng)和組織損傷進(jìn)一步加劇。Scheuren 等在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)抑制COX-2 的表達(dá)后能減少心肌梗死面積，其機(jī)制是減少巨噬細(xì)胞在梗死區(qū)域和邊緣的浸潤，且能抑制心臟損傷部位的成纖維細(xì)胞增殖而減少心肌梗死。此外，抑制COX-2 表達(dá)還可以改善內(nèi)皮依賴性血管舒張功能，減少冠心病的輕度慢性炎癥和氧化應(yīng)激水平。童靜燕等通過大鼠MIRI 模型發(fā)現(xiàn)活絡(luò)效靈丹給藥組能夠明顯下調(diào)心肌組織中IL1-

β

、TNF-

α

和IL-6 的表達(dá)水平，降低心肌組織中的炎癥水平，這一研究結(jié)果與預(yù)測的核心靶點(diǎn)相一致。根據(jù)GO 生物富集分析和KEGG 信號通路分析，發(fā)現(xiàn)活絡(luò)效靈丹治療冠心病的核心成分與靶點(diǎn)主要參與調(diào)控炎癥反應(yīng)信號通路，如TNF、NF-

κ

B 等關(guān)鍵的炎癥信號相關(guān)通路，說明抑制炎癥反應(yīng)可能是治療冠心病的主要通路之一。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果與分子對接結(jié)果，發(fā)現(xiàn)PTGS2 在“成分-靶點(diǎn)-通路”圖中Degree值排名第一，與多個(gè)核心成分具有較好的結(jié)合活性，同時(shí)參與多條信號通路的調(diào)節(jié)，于是對核心蛋白PTGS2 進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。研究證明活絡(luò)效靈丹可以有效抑制心肌組織中PTGS2 的表達(dá)。此外，本研究還通過檢驗(yàn)大鼠血漿LDH 含量，HE 染色與Masson 染色比對病理組織切片，發(fā)現(xiàn)活絡(luò)效靈丹不同劑量組能不同程度地改善心肌缺血的病理學(xué)狀態(tài)，明確了活絡(luò)效靈丹對冠心病的治療作用。

總之，本研究為之后活絡(luò)效靈丹治療冠心病的深入研究與臨床研究提供了可靠的數(shù)據(jù)支持和探索方向。但是由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的局限性，后續(xù)還需開展更加深入的研究。