王 楊,吳國輝,錢秋慧,趙晨曦,閆 瑾,王學(xué)東,王慧利

三氯生對斑馬魚發(fā)育和脂質(zhì)代謝的影響

王 楊,吳國輝,錢秋慧,趙晨曦,閆 瑾,王學(xué)東,王慧利*

(蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 蘇州 215009)

通過TCS(三氯生)亞致死劑量急性暴露斑馬魚胚胎至幼魚,探究其對斑馬魚胚胎發(fā)育和脂質(zhì)代謝的影響.結(jié)果表明,在體視顯微鏡下統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)TCS在200μg/L濃度急性暴露延遲了72hpf胚胎的孵化,孵化率下降13.24%,而畸形率提高80%以上.120hpf(受精后小時)幼魚畸形表現(xiàn)為能量淤積、卵黃囊腫、吸收障礙而后延,游囊閉合,心包囊腫,脊椎彎曲,少數(shù)個體小眼畸形.利用Metascape在線數(shù)據(jù)庫進行TCS作用靶的預(yù)測和分析,并對藥靶分子GO(基因本體)功能聚類和KEGG(京都基因與基因組百科全書)代謝途徑分析,多數(shù)基因在分子功能、生物過程和細胞組成上參與羧酸代謝、類固醇激素受體活性、脂質(zhì)綁定、脂質(zhì)分解與代謝過程、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)定位的調(diào)控等生物學(xué)功能,有3條KEGG信號通路與脂質(zhì)代謝有直接或間接的關(guān)系.通過ELISA試劑盒和Thermo全波段酶標(biāo)儀對幼魚(120hpf)生化指標(biāo)的檢測發(fā)現(xiàn),總膽固醇(T-CHO)與甘油三脂(TG)濃度顯著升高.利用油紅O染料進行脂質(zhì)染色發(fā)現(xiàn)幼魚肝臟、卵黃、血管有脂滴堆積現(xiàn)象,尤其集中于肝臟和卵黃中.脂質(zhì)代謝和能量供應(yīng)與運動行為密切相關(guān),借助Noldus行為分析儀進行行為學(xué)測試,表明TCS暴露后斑馬魚自主運動活力抑制,對聲光刺激敏感程度顯著下降.上述現(xiàn)象均可被100μg/L的脫氧膽酸鈉供給而減輕.預(yù)示TCS低劑量環(huán)境暴露通過影響肝膽循環(huán)誘導(dǎo)斑馬魚脂質(zhì)代謝紊亂,造成能量供應(yīng)障礙.

三氯生；斑馬魚；脂質(zhì)代謝；運動行為；脫氧膽酸鈉

三氯生(TCS)是廣譜殺菌劑,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、洗滌劑及日常護理品等領(lǐng)域.在世界各地的市政污水、河流、海洋及底泥等介質(zhì)中均有檢出,環(huán)境監(jiān)測濃度在ng～mg/L(kg)級之間[1-4].

TCS在淡、海水光化學(xué)轉(zhuǎn)化中能和本底氯離子發(fā)生反應(yīng),形成多種穩(wěn)定態(tài)氯代衍生物[5-6],其中間衍生物的生物毒性多數(shù)高于母體化合物.TCS是一種親脂化學(xué)物質(zhì),它容易在脂肪組織、肝臟和膽汁中積聚[7].因此,環(huán)境中低劑量TCS長期作用于水生態(tài)系統(tǒng)引發(fā)的慢性致毒效應(yīng)、生物放大、生物積蓄[8],及多種污染物共存的加和協(xié)同作用對水生生物和人類健康構(gòu)成了嚴重威脅.

目前,關(guān)于脂質(zhì)代謝研究主要利用離體脂肪細胞及小鼠模型,前者無法模擬復(fù)雜的在體過程與微環(huán)境,而后者因成本高、非高通量等局限.斑馬魚作為廉價的脊椎模式生物,它與人類基因組高度同源[9],尤其適合脂質(zhì)代謝研究,大多數(shù)使用斑馬魚模型的藥物毒性和安全性評估從ECVAM(歐洲替代方法驗證中心)獲得了良好(75%～85%)或優(yōu)秀(85%)的準(zhǔn)確性標(biāo)準(zhǔn),顯示其在藥物發(fā)現(xiàn)和毒理學(xué)研究種的巨大優(yōu)勢.

本文結(jié)合預(yù)測和實驗測定獲得TCS的LC50實驗值,依據(jù)環(huán)境監(jiān)測濃度,設(shè)置TCS亞致死劑量處理斑馬魚,研究對胚胎及幼魚發(fā)育的影響,然后基于表觀畸形特征,結(jié)合藥靶預(yù)測,確定TCS作用靶分子、毒效應(yīng)靶系統(tǒng)、以及產(chǎn)生的生物學(xué)功能異常等,通過生化指標(biāo)的測定和特異染色及行為學(xué)分析等在體展示其致脂質(zhì)代謝紊亂的毒性效應(yīng).

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗生物為野生型AB品系斑馬魚,于中國科學(xué)院武漢水生生物研究所獲得,根據(jù)斑馬魚的養(yǎng)殖指南,雌雄成魚分開飼養(yǎng)在專用養(yǎng)殖系統(tǒng)中(水溫為(28.5±0.5)℃;pH值為6.8～7.5;光周期為14h光照:10h黑暗),每天早晚各喂食一次新鮮孵化的豐年蝦.

1.2 實驗試劑及儀器

主要試劑:TCS(CAS No.3380-34-5, 99.9%),油紅(CAS No.1320-06-5)均購于Sigma-Aldrich公司(St. Louis, USA);甘油三酯試劑盒(南京建成生物有限公司);總膽固醇試劑盒(南京建成生物有限公司);BCA蛋白測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司).

主要儀器:斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(上海海圣生物實驗設(shè)備有限公司);Thermo全波長酶標(biāo)儀(美國賽默飛公司);行為分析系統(tǒng)(Danio Vision,荷蘭Noldus);體視顯微鏡(Nikon SMZ1500上海千欣儀器有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 斑馬魚的胚胎收集與染毒 實驗前1d晚上將成魚按雌雄比3:4放入產(chǎn)卵器中,第2d早上拔掉插板并開啟日光燈刺激產(chǎn)卵,0.5h后收集胚胎,挑選發(fā)育良好的6hpf(受精后小時數(shù))優(yōu)質(zhì)胚胎,隨機置于96孔板中,加入200μL/孔用胚胎培養(yǎng)液預(yù)先配制好的染毒工作液進行體外浸液給藥,設(shè)置對照組(Control)、TCS處理組200μg/L,挽救組TCS200μg/L+ 100μg/L脫氧膽酸鈉.每處理設(shè)置3次生物重復(fù),每24h更換一次新鮮的染毒液,以保持染毒濃度,以備進行各項測定實驗,連續(xù)染毒至5dpf.

1.3.2 TCS急性暴露對斑馬魚發(fā)育毒性的表觀形態(tài)觀察 胚胎自6hpf染毒后,實時跟蹤斑馬魚不同體節(jié)期的發(fā)育生長狀況,選取24,48,72,96,120hpf的幼魚,體視顯微鏡下觀察各處理組幼魚發(fā)育,并Nikon顯微鏡拍照記錄其發(fā)育畸形特征,統(tǒng)計72hpf孵化率,120hpf死亡率及畸形率.

1.3.3 基于在線平臺數(shù)據(jù)庫進行TCS作用靶分子預(yù)測與基因功能分析 用ChemDraw18.0畫出TCS化學(xué)結(jié)構(gòu)式,將其3D圖片輸入至PharmMapper在線數(shù)據(jù)庫得到并篩選靶標(biāo)蛋白.將候選蛋白導(dǎo)入STRING在線數(shù)據(jù)庫進行String轉(zhuǎn)化為靶標(biāo)基因.將靶標(biāo)基因輸入至Metascape數(shù)據(jù)庫進行斑馬魚來源基因的GO(基因本體)功能富集及KEGG(京都基因與基因組百科全書)信號通路分析.

1.3.4 斑馬魚幼魚脂質(zhì)代謝相關(guān)指標(biāo)的測定與分析 從各處理組中分別取60條幼魚(120hpf)于1.5mLEP管內(nèi),用去酶PBS溶液沖洗2次,根據(jù)1:9質(zhì)量份數(shù)加入無水乙醇研磨勻漿, 2500r/min 低溫離心10min,收集酶粗提液.待測樣本蛋白濃度、甘油三酯(TG)和總膽固醇(T-CHO)濃度,統(tǒng)計分析均根據(jù)試劑盒的測定指導(dǎo)方法進行,酶標(biāo)儀檢測波長分別為562,510nm.

1.3.5 幼魚整體油紅(ORO)染色檢測脂質(zhì)堆積與分布 在每處理組隨機選取30尾120hpf幼魚,4%多聚甲醛 (PFA)固定-PBS清洗-梯度1,2-丙二醇滲透等處理后,用新鮮配置的3%油紅(ORO)染色過夜.然后再用PBS清洗2次后,100 %1,2-丙二醇去背景色,體視顯微鏡成像記錄,觀察脂滴堆積與分布.

1.3.6 TCS亞致死劑量暴露對幼魚行為的影響 TCS持續(xù)暴露(6～120hpf)的幼魚,轉(zhuǎn)移至96孔無菌培養(yǎng)板中并在Noldus(荷蘭)行為分析儀中進行自主運動,光暗節(jié)律,聲刺激實驗測定,參照Xia等[10]的實驗方法進行.

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析視頻分析 使用EthoVision XT軟件(NoldusIT,Wageningen,荷蘭)跟蹤斑馬魚的個體運動.所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示,比較不同處理組時,在Tukey排序檢驗后進行單因素方差分析(ANOVA).統(tǒng)計分析均采用SPSS18.0軟件(芝加哥,美國)進行,顯著性水平記錄為0.05(*),0.01(**),0.001(***).

2 結(jié)果與分析

2.1 TCS環(huán)境暴露對不同物種LC50預(yù)測與實驗?zāi)M

為確定TCS亞致死作用劑量以更接近評判其環(huán)境中暴露風(fēng)險,首先經(jīng)過EcosarApplcation軟件對非靶標(biāo)生物的LC50進行預(yù)測分析,得出TCS對魚類的半致死濃度為0.582mg/L(表1).參考此LC50值上下設(shè)置系列TCS濃度梯度暴露胚胎至120hpf幼魚期,模擬出TCS對120hpf幼魚的LC50為0.5117mg/L,2值為0.985(圖1).根據(jù)TCS對斑馬魚毒性效應(yīng)的研究及代表性的表型特征[11],結(jié)合環(huán)境中TCS嚴重污染區(qū)的監(jiān)測濃度,本實驗選取其LC501/3～1/2作為處理組染毒濃度(200μg/L).

表1 TCS對不同生物L(fēng)C50的預(yù)測

圖1 TCS 120hpf幼魚的LC50擬合曲線

2.2 TCS亞致死劑量暴露誘導(dǎo)斑馬魚胚胎發(fā)育畸形

胚胎是一切器官發(fā)育的來源,胚胎早期發(fā)育影響著機體后天的生長與存亡,致畸現(xiàn)象是評價污染物對個體發(fā)育的影響[12].經(jīng)染毒24、48、72、96、120后TCS處理組畸形特征表現(xiàn)為能量淤積,卵黃囊腫,吸收障礙而后延;游囊閉合;心包囊腫;脊椎彎曲;少數(shù)個體小眼畸形(圖2(a)).如圖2(b)所示,對照組72hpf時孵化率為100%,與對照相比TCS處理組孵化率顯著降低(0.001),即下降了13.24%,而在100μg/L的脫氧膽酸鈉與TCS的復(fù)合處理下孵化率顯著提升(0.01).如圖2(c)所示,120hpf幼魚的主要畸形比率中游囊關(guān)閉和卵黃囊腫占比較高,且卵黃囊腫、心包囊腫及游囊閉合程度在100mg/L的脫氧膽酸鈉復(fù)合作用有所減輕.

2.3 TCS作用靶分子的預(yù)測與靶基因功能分析

為進一步探究造成上述表觀畸形潛在的分子機制,利用PharmMapper網(wǎng)站在線實現(xiàn)TCS分子結(jié)構(gòu)與其可能作用的目標(biāo)蛋白的表達影響,根據(jù)系統(tǒng)默認的匹配閾值,從中篩選出可能靶向的編碼基因.作用靶標(biāo)基因GO功能分類和涉及的KEGG代謝通路富集分析表明,符合作用有179條,多數(shù)基因在分子功能、生物過程和細胞組成上參與羧酸代謝(carboxylic acid metabolic process)、類固醇激素受體活性(steroid hormone receptor activity)、脂質(zhì)綁定(lipid binding)、脂質(zhì)分解代謝過程(lipid catabolic process)、脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)(lipid homestasis)、脂質(zhì)定位的調(diào)控(regulation of lipid localization)等生物學(xué)功能(圖3(a));從圖3(b)可知,TCS作用靶基因涉及的KEGG代謝途徑主要有13條顯著富集KEGG途徑與代謝通路,主要分為3個方面:(1)氨基酸代謝相關(guān)途徑,苯丙氨酸代謝(Phenylalanine metabolism),氨基酸的生物合成(Biosynthesis of amino acids),半胱氨酸和蛋氨酸的代謝(Cysteine and methionine metabolism);(2)與脂質(zhì)代謝有關(guān)的途徑, PPAR信號通路(PPAR signaling pathway),類固醇激素的生物合成(Steroid biosynthesis);(3)碳代謝相關(guān)途徑(Carbon metabolism).顯然,3類代謝途徑均與脂質(zhì)代謝、碳代謝,膽固醇轉(zhuǎn)化和能量轉(zhuǎn)化等有直接或間接的關(guān)系,這為進一步探討TCS環(huán)境暴露誘發(fā)脂代謝紊亂的分子機制提供指導(dǎo).

(a)斑馬魚胚胎發(fā)育畸形

發(fā)育畸形包括a心包囊腫;b卵黃囊腫;c游囊閉合;d脊柱彎曲;e小眼畸形;f吸收障礙后延

(a) GO功能分類

(b) KEGG Pathway 信號通路富集分析

圖3 TCS作用靶基因的GO功能分類和KEGG Pathway富集分析

Fig.3 GO functional classification and KEGG pathway analysis of TCS target genes

2.4 TCS亞致死劑量暴露誘導(dǎo)斑馬魚甘油三脂和膽固醇升高

圖4 TCS暴露對斑馬魚脂質(zhì)代謝紊亂生物指標(biāo)的測定

基于上述藥物作用靶的分析數(shù)據(jù)和表觀畸形特征,為證實TCS是否造成脂質(zhì)代謝紊亂,進一步進行生化指標(biāo)的測定,總膽固醇(T-CHO)與甘油三脂(TG)含量失衡是衡量脂質(zhì)代謝異常、高血脂和肥胖效應(yīng)或肝損傷的重要生化標(biāo)志物[13].如圖4所示, TCS處理組斑馬魚幼魚的T-CHO與 TG顯著高于對照組(0.01),而在TCS與低濃度100μg/L的DCA復(fù)合處理下,T-CHO與TG的含量比單獨TCS作用有所緩和(0.05).這一結(jié)果與發(fā)育畸形嚴重程度的挽救是一致的.由此說明TCS暴露會導(dǎo)致斑馬魚幼魚脂滴堆積,能量傳遞障礙,誘發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂綜合征.

2.5 TCS亞致死劑量暴露造成肝臟和卵黃中的脂質(zhì)沉積

利用油紅O與脂滴的高度親和性進行染色,在體展示脂質(zhì)在斑馬魚體內(nèi)的堆積及分布.如圖5(a)所示,與對照組相比,TCS暴露組幼魚(120hpf)肝臟、卵黃囊,血管內(nèi)均表現(xiàn)脂滴堆積現(xiàn)象,其中在肝臟和卵黃中沉積尤其明顯,并對肝臟和卵黃中脂滴沉積光密度定量分析(圖5(b)).同樣,在TCS與低濃度DCA(100μg/L)復(fù)合處理下,顯著減輕了脂滴堆積的嚴重程度(<0.05),與對照組沒有差別.這一結(jié)果與生物標(biāo)志物變化相吻合.

圖5 油紅(ORO)染色展示脂肪沉積與分布

2.6 TCS亞致死劑量暴露導(dǎo)致幼魚運動行為異常

能量供給與運動活力密切相關(guān),糖酵解和β-脂肪氧化是提供能量的重要方式[14],為進一步證實上述TCS暴露誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝紊亂是否影響著其運動行為,測定了各處理組的幼魚(120hpf)自主運動活力和對聲光刺激的響應(yīng)敏感度.如圖6(a)所示,TCS暴露組斑馬魚總體運動距離和速率顯著降低(<0.001),自主運動行為緩慢,活力下降.由運動軌跡的熱圖示蹤可知(圖6(b)),TCS處理組幼魚多以定點旋轉(zhuǎn)運動,無法長距離的運動起來.這也與游囊關(guān)閉和能量淤積有關(guān).由圖6(c),(d)可知,幼魚對強光刺激的驚恐逃避反射實驗表明,暴露于TCS的幼魚在光暗刺激下,運動距離、速度顯著抑制(<0.001), 同樣,上述運動行為的異常均可在TCS與100μg/LDCA濃度復(fù)合處理下得到挽救.上述行為學(xué)的異常與脂質(zhì)代謝紊亂和能量供給障礙是相輔相成的.

圖6 TCS暴露對斑馬魚運動行為學(xué)分析

2.7 討論

斑馬魚作為模式生物因其有眾多優(yōu)勢,被廣泛用于環(huán)境毒理學(xué)研究中.本文通過TCS亞致死劑量的急性暴露發(fā)現(xiàn)120hpf的斑馬魚畸形主要為卵黃囊腫、游囊閉合及脊椎彎曲.游囊是斑馬魚對外界環(huán)境脅迫反應(yīng)最敏感的器官.游囊通過充氣和放氣的方式維持魚體在水中的沉浮以減少水體中懸浮狀態(tài)所需的能量[15].此外,斑馬魚早期發(fā)育所需的能量及營養(yǎng)物質(zhì)主要由卵黃囊中儲存的卵黃蛋白提供[16],同時卵黃囊也具有隔離屏障和保護作用,使斑馬魚的發(fā)育避受外界干擾[17].因此,基于上述TCS致斑馬魚發(fā)育畸形的特征,為進一步探究造成上述表觀畸形潛在的分子機制,本文利用生物信息學(xué)分析得出TCS作用靶基因的功能聚類和通路富集均與脂質(zhì)代謝的進程相關(guān).其中過氧化物酶增殖激活受體PPAR家族作為一種核受體信號在脂質(zhì)代謝紊亂中起重要的作用[18],其中PPARγ為脂肪形成和分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子.肝細胞中的甘油三酯(TG)積聚會破壞機體內(nèi)的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)[19].由120hpf斑馬魚的TG、TC指標(biāo)異常,也證實TCS確實會破壞斑馬魚體內(nèi)的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài).油紅O為一種能在脂肪內(nèi)高度溶解的脂溶性染料,特異著色脂肪滴[20],120hpf斑馬魚的油紅染色結(jié)果與生化指標(biāo)結(jié)果相一致.為進一步證實上述TCS暴露誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝紊亂影響著運動行為的能量供應(yīng),TCS處理組幼魚運動活力下降得以證實.鄧軍等[21]發(fā)現(xiàn)六溴環(huán)十二烷暴露斑馬魚胚胎／幼魚會延遲卵黃囊內(nèi)生脂肪的吸收,抑制電子呼吸鏈中的酶活及ATP的產(chǎn)生,導(dǎo)致能量供應(yīng)不足,與本研究結(jié)果相似.

脫氧膽酸鈉為次級膽汁酸鹽,注射至活體脂肪塊中可以通過細胞機械性破壞作用使脂肪細胞溶解[22],達到美容效果[23].正因為其乳化脂肪的作用,因此它可以作為藥物治療面部脂肪瘤[24],所以本文選用低濃度(100mg/L)的脫氧膽酸鈉作為挽救實驗組.結(jié)果表明在100μg/L的DCA復(fù)合處理下,挽救了孵化率下降的趨勢、發(fā)育畸形率與嚴重程度,降低了TG、TC的水平,緩解了脂滴在斑馬魚體內(nèi)的積聚,顯著提升了幼魚自主運動的活力,為TCS引起的發(fā)育毒性及脂質(zhì)代謝紊亂提供了治療方法.

3 結(jié)論

3.1 TCS亞致死劑量急性暴露造成游囊閉合、心包囊腫、卵黃囊腫等表觀畸形,利用生物信息學(xué)分析預(yù)測出TCS對斑馬魚作用靶分子與靶基因的功能與脂質(zhì)代謝相關(guān)

3.2 生理生化指標(biāo)TG/TC的檢測結(jié)果顯示TCS使斑馬魚幼魚的TG、TC水平顯著上調(diào),低劑量濃度的脫氧膽酸鈉則會挽救這一上調(diào)趨勢.

3.3 幼魚的整體油紅染色結(jié)果證實了TCS造成斑馬魚脂肪堆積,引起脂質(zhì)代謝紊亂,進而導(dǎo)致運動行為異常.證實了亞致死劑量的TCS環(huán)境暴露有影響幼體發(fā)育障礙和誘發(fā)代謝性疾病的健康風(fēng)險.

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Effects of triclosan environmental exposure on zebrafish development and lipid metabolism.

WANG Yang, WU Guo-hui, QIAN Qiu-hui, ZHAO Chen-xi, YAN Jin, WANG Xue-dong, WANG Hui-li*

(School of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science andTechnology, Suzhou 215009, China)., 2022,42(3)：1394～1400

Herein, we explored in detail the effects of TCS acute exposure at sublethal dosage on zebrafish embryonic development and lipid metabolism. TCS at 200μg/L significantly delayed the 72-hpf embryonic hatching with a decreased hatching percentage of 13.24% and an increased deformity rate of >80%. In the TCS-exposure group (4-120hpf), the main larval malformations were reflected in energy stasis、yolk cyst、dyssorption and swim sac closure, pericardial cyst, spinal curvature and so on. Using metascape online database, the target molecules of TCS, and the underlying GO (gene ontology) function clustering and KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes) metabolic pathways were analyzed systemically. Most of the target genes were involved in various biological functions, such as carboxylate metabolism, steroid hormone receptor activity, lipid binding, lipid catabolic process, lipid homeostasis and regulation of lipid localization based on the roles in molecular function, biological process and cellular component. Three KEGG signaling pathways were found to be directly or indirectly concerned with lipid metabolism. The changes in biochemical indicators of 120-hpf larvae demonstrated that TCS exposure resulted in the significant increases of the total cholesterol (T-CHO) and triglycerides (TG) levels. By oil red O staining, we observed the prominent accumulation of lipid droplets in larval liver, egg yolk and blood vessels after exposure to TCS, especially in the liver and yolk. Lipid metabolism and energy supply are closely related to motor behavior. Using Noldus behavior analyzer, after TCS exposure, zebrafish voluntary motor activity was obviously inhibited, and the sensitivity to acoustic-optic stimulation was significantly decreased. The aforementioned toxic effects could be alleviated upon addition of 100μg/L sodium deoxycholate. These findings provide compelling evidence that low-dose TCS exposure induced zebrafish lipid-metabolism disorders by affecting hepatobiliary circulation and causing energy-supply obstacle.

triclosan；zebrafish；lipid metabolism；movement behavior；sodium deoxycholate

X174

A

1000-6923(2022)03-1394-07

王 楊(1997-),女,山東萊陽人,蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院碩士研究生,主要從事風(fēng)險評價與生態(tài)安全方面的研究.

2021-07-30

國家自然科學(xué)基金資助項目(31770552)

*責(zé)任作者, 教授, whuili@163.com