李 歡,劉 蘇,張靜麗,陳建秋

聚苯乙烯微塑料對糖尿病小鼠腎臟的影響

李 歡,劉 蘇,張靜麗,陳建秋*

(中國藥科大學(xué)工學(xué)院,江蘇 南京 211198)

以糖尿病小鼠為模式生物,探究了100nm和5μm的聚苯乙烯微塑料(PSMPs)(200μg/L)通過飲水暴露28d后對小鼠腎臟的毒性.結(jié)果表明,糖尿病小鼠對PSMPs的暴露更加敏感,100nm和5μm PSMPs暴露導(dǎo)致糖尿病小鼠腎臟出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤和淤血等病理損傷,且100nm PSMPs對腎臟造成的病理損傷更為嚴(yán)重.此外100nm PSMPs暴露顯著加劇了糖尿病小鼠腎臟炎癥因子(TNF-α和IL-6)、超氧化物歧化酶(SOD)和血清肌酐表達(dá)水平,并導(dǎo)致腎臟代謝紊亂.與5μm PSMPs相比,100nm PSMPs暴露呈現(xiàn)出的小粒徑毒性效應(yīng)可能與納米級別PSMPs更易透過腸道屏障在腎臟中累積有關(guān).此外,腎臟代謝通路紊亂引起的糖酵解能力受損和能量代謝水平降低也增加了PSMPs對糖尿病小鼠腎臟的負(fù)荷.

聚苯乙烯微塑料；糖尿病小鼠；腎臟；炎癥；氧化損傷

微塑料(MPs),粒徑小于5mm的塑料顆粒[1],能在環(huán)境中長時間遷徙和積累,導(dǎo)致其在海洋、湖泊和陸地環(huán)境中被頻繁檢測到[2].MPs的化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且不易降解,進(jìn)入到環(huán)境中不僅對水生和陸地動物有害,還可以通過諸多途徑進(jìn)入哺乳動物甚至人類體內(nèi)對人類健康造成極大威脅.

MPs可以在生物腸道中積累,并可透過腸道屏障通過循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入其他臟器[3].生物體內(nèi)MPs的累積對其正常生理功能造成許多不良影響.例如被魚類誤食的MPs可誘導(dǎo)腸道微絨毛損傷,并造成腸道細(xì)胞的破裂,產(chǎn)生炎癥效應(yīng)[4].累積在肝臟中MPs可顯著誘導(dǎo)小鼠肝脂質(zhì)紊亂[5].近年來針對MPs毒性的研究主要集中在對腸道和肝臟的毒性效應(yīng),對腎臟的影響還研究較少.已有研究表明,經(jīng)口攝入的MPs隨著時間的推移在生物體的腸道、肝臟和腎臟均有明顯的累積[6].累積在哺乳動物甚至人類腎臟中的MPs對腎臟的正常生理功能具有潛在的威脅.

糖尿病是一種特征為慢性多病因代謝疾病,糖尿病的發(fā)生與病情的加重已不僅限于遺傳、肥胖、不良的飲食習(xí)慣和生活方式等傳統(tǒng)危險因素,環(huán)境污染物也影響著糖尿病進(jìn)程[7-8].研究發(fā)現(xiàn),雙酚A的暴露使得小鼠胰島巨噬細(xì)胞的相對數(shù)量明顯減少,小鼠內(nèi)膜巨噬細(xì)胞的吞噬功能降低,加速了小鼠糖尿病發(fā)展[9].糖尿病患者中腎臟功能不全已得到了廣泛的報道,其主要的病理表現(xiàn)為腎功能衰竭,代謝紊亂等[10].對于健康人群,完整的腎臟功能在代謝廢物和有毒物質(zhì)的排泄中發(fā)揮著重要的作用.腎臟正常功能如果進(jìn)一步受到破壞,可能會對糖尿病人群的健康造成威脅[11].

本文選擇檢出頻率高、毒性作用明顯的聚苯乙烯微塑料(PSMPs) (100nm和5μm)作為研究對象,通過飲水暴露(200μg/L),同等處理健康小鼠和糖尿病小鼠28d,探究不同粒徑的PSMPs經(jīng)消化系統(tǒng)進(jìn)入糖尿病小鼠體內(nèi)后對小鼠腎臟產(chǎn)生的毒性.旨在為MPs對小鼠腎臟毒性影響研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

100nm和5μm粒徑的PSMPs購自天津市倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心.使用掃描電子顯微鏡(SU8010,日本)觀察PSMPs的表面形貌,利用傅里葉變換紅外光譜(Thermo Scientific Nicolet iS5,上海)對PSMPs的表面官能團(tuán)進(jìn)行表征.

1.2 實驗動物和暴露方式

6周齡雄性C57BL/6J (Norm)健康小鼠和C57BKS/Leprdb (db/db)糖尿病小鼠購買于上海斯萊克實驗動物有限公司(上海),置于(22±1)℃,12:12h光照-黑暗循環(huán),以自由攝食和飲水方式馴養(yǎng)1周.待馴養(yǎng)結(jié)束后將小鼠隨機(jī)分為6組,每組6只.具體實驗暴露方案如表1所示.暴露期間每7d記錄一次體重,每天更換飲用水以保證溶液濃度穩(wěn)定.在PSMPs暴露過程中,每周從每組中隨機(jī)挑選4只小鼠測量空腹血糖和血胰島素水平.暴露28d后進(jìn)行葡萄糖耐受性檢測和胰島素抵抗檢測.利用眼球取血的方式采集新鮮血液3000r/min離心15min以得到血清樣本.使用10%水合氯醛(1mL/200g)麻醉小鼠后安樂死.采集小鼠腎臟并立即用10%福爾馬林浸泡或用液氮冷凍后置于?80℃冰箱保存用于后續(xù)分析.本研究通過了中國藥科大學(xué)動物倫理委員會的批準(zhǔn).

表1 實驗暴露方案

1.3 組織病理學(xué)檢測

將腎臟在10%福爾馬林緩沖液中固定24h后,用70%、80%、90%、100%乙醇逐級脫水,將脫水后的組織先后浸漬于無水乙醇、二甲苯混合液及純二甲苯中進(jìn)行透明處理,隨后經(jīng)石蠟包埋,垂直切成4μm切片黏附于載玻片上烘干備用.切片在著色前用二甲苯脫蠟,然后經(jīng)乙醇溶液水化處理.使用蘇木精-曙紅(H&E)染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察和拍照,記錄腎臟的組織病理學(xué)變化.

1.4 炎癥因子水平和血清肌酐水平的測定

將冷凍的腎臟融化后稱重,加入一定量的磷酸鹽(PBS)緩沖液(pH=7.4),用勻漿器在冰上制成10%的組織勻漿液,將組織勻漿液離心20min (2000～ 3000r/min)后仔細(xì)收集上清液.上清液中TNF-α和IL-6的水平使用酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所,中國)測定.小鼠血清肌酐水平使用肌酐(CRE)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所,中國)測定.

1.5 氧化應(yīng)激分析

將冷凍的腎臟融化后稱重,加入一定量的PBS緩沖液(pH=7.4),用勻漿器在冰上制成10%的組織勻漿液,將組織勻漿液離心20min (2000～3000r/min)后仔細(xì)收集上清液.基于BCA法(蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒,南京建成生物工程研究所)測定小鼠腎臟蛋白質(zhì)濃度.利用超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(南京建成生物工程研究所,中國)和還原性谷胱甘肽(GSH)測試盒(南京建成生物工程研究所,中國)檢測勻漿上清液中SOD和GSH水平.

1.6 代謝組學(xué)分析

將冷凍的腎臟融化后稱取50mg腎臟組織,使用預(yù)冷的甲醇-水混合物(2/1,/) 600μL混合,利用超聲波破碎機(jī)(Ymnl-1000T,中國南京)分3次對組織提取.12000×,4℃離心10min后,將上清液合并在2mL離心管中,并在45℃下使用氮吹儀吹干樣本.使用600μL含有100% D2O(百靈威科技有限公司,中國)和0.005% TSP-d4(劍橋同位素實驗室,美國)的PBS緩沖液(pH=7.4)將水溶性提取物充分溶解.再次(12000×,4℃)離心10min后,將上清液轉(zhuǎn)移到5mm核磁共振(NMR)管中進(jìn)行測定.采用MestReC軟件(Mestrelab Research,西班牙)分析1HNMR譜.先進(jìn)行化學(xué)位移零點的校正,以及譜圖信號相位與基線的校正.將0～10.0×10-6化學(xué)位移段內(nèi)的譜峰信號進(jìn)行分段積分,間距為0.005×10-6,積分時去除4.5～5.0×10-6的水峰.根據(jù)NMR譜的化學(xué)位移和峰形,識別出相應(yīng)的代謝分子.化學(xué)位移對應(yīng)的代謝物如表2所示.通過計算每個代謝分子對應(yīng)化學(xué)位移范圍的峰積分,分析樣品中各代謝物的相對含量.采用單因素方差分析(ANOVA)比較各組間差異,篩選出顯著變化的代謝物(SCMs) (<0.05).將所有積分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)出到Excel文件,使用MetaboAnalyst 4.0軟件進(jìn)行在線分析.

表2 代謝物的化學(xué)位移

續(xù)表2

1.7 統(tǒng)計分析

采用Graphpad Prism 7的單因素方差分析(ANOVA)評估組間差異,以<0.05為標(biāo)準(zhǔn)判斷顯著性變化.所有試驗進(jìn)行3次重復(fù),除非另有說明,實驗結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示.

2 實驗結(jié)果

2.1 PSMPs的表征

圖1 100nm和5 μm PSMPs的SEM及FTIR圖像

如圖1(a)所示,100nm和5μm PSMPs的顆粒表面光滑,均呈現(xiàn)規(guī)則球形結(jié)構(gòu).如圖1(b)所示,在波長為3061和3024cm-1處吸收峰來自苯環(huán)C-H鍵伸縮振動.在波長為2923cm-1處存在特征峰來自亞甲基的C-H鍵伸縮振動.在1603cm-1處的特征峰可能與雙鍵的伸縮振動有關(guān).1450cm-1處為C-O、C-X(鹵素)的伸縮振動峰.756和700cm-1處的特征吸收峰由苯基取代引起.PSMPs的特征峰和組成與前期結(jié)果一致[12].

2.2 PSMPs對小鼠腎臟組織的病理損傷

如圖2所示,對照組健康小鼠腎臟細(xì)胞排列較為緊密,細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整.Norm-100nm和Norm-5μm組小鼠的腎臟細(xì)胞的緊密排列被破壞,細(xì)胞間隙變大,出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤以及淤血現(xiàn)象,且100nm PSMPs造成的炎癥和淤血現(xiàn)象更為嚴(yán)重.與健康小鼠相比,糖尿病小鼠的腎臟組織細(xì)胞出現(xiàn)一定程度的炎癥細(xì)胞浸潤現(xiàn)象.100nm和5μm PSMPs暴露均加劇了糖尿病小鼠腎臟組織的炎癥細(xì)胞浸潤,且100nm PSMPs暴露導(dǎo)致糖尿病小鼠腎臟組織淤血現(xiàn)象更加明顯.此外,與Norm-100nm組相比,db/db- 100nm組小鼠腎臟組織的炎癥細(xì)胞浸潤與淤血現(xiàn)象更為嚴(yán)重.組織病理學(xué)結(jié)果表明,糖尿病小鼠的腎臟對PSMPs的暴露更為敏感.

圖2 小鼠腎臟H&E染色切片

圖中組織病理學(xué)變化包炎癥細(xì)胞浸潤(黑色箭頭),淤血(黃色圓圈)

2.3 PSMPs對小鼠血清肌酐水平的影響

血清肌酐濃度變化反映腎小球的濾過能力,肌酐濃度升高,則表明腎小球濾過能力下降,腎臟功能受損.如圖3所示,與對照組相比,100nm和5μm PSMPs暴露顯著增加了小鼠血清中肌酐水平(< 0.05).與健康小鼠相比,糖尿病小鼠血清中肌酐濃度顯著增加,達(dá)到(3653.58±156.86)μmoL/L,提示糖尿病小鼠的腎臟存在一定的損傷.相較于db/db-5μm組,小鼠血清肌酐濃度在db/db-100nm組中也顯著增加(<0.05),達(dá)到(4069.63±98.88)μmoL/L.100nm PSMPs暴露對糖尿病小鼠腎臟功能造成了嚴(yán)重的損傷.

圖3 小鼠血清肌酐水平的變化

2.4 PSMPs對小鼠腎臟炎癥因子水平的影響

如圖4(a)所示,與對照組中健康小鼠相比, 100nm PSMPs的暴露顯著增加了小鼠腎臟中TNF-α的表達(dá)水平(<0.05).而Norm-5μm組中小鼠腎臟的TNF-α表達(dá)水平無明顯變化,表明100nm PSMPs對小鼠腎臟造成了嚴(yán)重的炎癥損傷.與健康小鼠相比,糖尿病小鼠腎臟中TNF-α表達(dá)量達(dá)到(92.49±11.71) ng/g,顯著高于健康小鼠(<0.05),表明糖尿病小鼠腎臟存在一定程度的損傷.此外,100nm PSMPs的暴露導(dǎo)致糖尿病小鼠TNF-α表達(dá)量較對照組明顯增加(<0.05),說明100nm PSMPs的暴露進(jìn)一步加重了糖尿病小鼠腎臟的損傷.

IL-6的表達(dá)水平如圖4(b)所示,與對照組中健康小鼠相比,100nm和5μm PSMPs的暴露均顯著增加了小鼠腎臟中IL-6的表達(dá)水平(<0.05).與Norm-5μm組相比,IL-6的表達(dá)水平在Norm-100nm組中顯著增加,達(dá)到(21.90±1.06) pg/mg.表明100nm PSMPs對小鼠的腎臟造成更為嚴(yán)重的損傷.與健康小鼠相比,糖尿病小腎臟中IL-6的表達(dá)水平無明顯變化(0.05).與糖尿病小鼠相比,IL-6的表達(dá)水平在db/db-100nm和db/db-5μm組中均顯著增加且db/db-100nm組中IL-6的表達(dá)水平要顯著高于db/db-5μm組,表明100nm和5μm PSMPs的暴露均能夠?qū)μ悄虿⌒∈竽I臟造成損傷且100nm PSMPs對糖尿病小鼠腎臟的損傷更為嚴(yán)重.

圖4 小鼠腎臟炎癥因子水平的表達(dá)

2.5 PSMPs對小鼠腎臟SOD和GSH表達(dá)的影響

SOD是重要的抗氧化酶,廣泛分布于生物體內(nèi),可以清除體內(nèi)過多的自由基,SOD水平升高表明自由基含量升高誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激.如圖5(a)所示,100nm PSMPs暴露顯著增加了小鼠腎臟中SOD的表達(dá)(<0.05),達(dá)到(96.64±3.23) U/mgprot,而Norm-5μm組小鼠腎臟SOD的表達(dá)水平無明顯變化.與健康小鼠相比,糖尿病小腎臟中SOD表達(dá)量達(dá)到(116.65±10.56) U/mgprot,顯著高于健康小鼠腎臟中SOD表達(dá)水平(<0.05),提示糖尿病小鼠腎臟存在一定程度的氧化損傷.在db/db-100nm和db/db- 5μm組中,SOD表達(dá)量均顯著增加(<0.05),且在db/db-100nm組中表達(dá)最為顯著,達(dá)到(132.25±8.20) U/mgprot.小鼠腎臟SOD表達(dá)水平的結(jié)果說明100nm PSMPs對糖尿病小鼠腎臟的氧化損傷更為顯著.

GSH是生物體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑,可與自由基結(jié)合排出體外,GSH含量降低意味著體內(nèi)自由基增多,細(xì)胞變性和壞死.如圖5(b)所示,與對照組中健康小鼠相比,100nm和5μm PSMPs的暴露均顯著減少了小鼠腎臟中GSH的表達(dá)水平(<0.05).與健康小鼠相比,糖尿病小腎臟中GSH表達(dá)量達(dá)到(39.72±6.52) U/mgprot,顯著高于健康小鼠腎臟中GSH表達(dá)水平(<0.05).100nm和5μm PSMPs暴露后,糖尿病小鼠腎臟GSH的表達(dá)水平均顯著下降,且db/db-100nm組中GSH的表達(dá)水平顯著低于db/db-5μm組,進(jìn)一步證明了100nm PSMPs對糖尿病小鼠腎臟的損傷顯著高于5μm PSMPs.此外,100nm PSMPs的暴露導(dǎo)致健康小鼠腎臟GSH的表達(dá)水平相對于對照組下調(diào)了(1.38±1.13)倍,而糖尿病小鼠腎臟GSH水平相對于對照組下調(diào)了(1.73±1.15)倍.小鼠腎臟GSH表達(dá)水平的結(jié)果也進(jìn)一步表明糖尿病小鼠的腎臟對100nm PSMPs的暴露更加敏感.

圖5 小鼠腎臟SOD和GSH的表達(dá)

2.6 PSMPs暴露對小鼠腎臟代謝組學(xué)的影響

采用偏最小二乘判別分析(PLS-DA)比較不同處理組間代謝產(chǎn)物的差異,如圖6(a)所示,各實驗組均能與對照組產(chǎn)生明顯區(qū)分與清晰聚類,表明100nm和5μm PSMPs的暴露對健康小鼠和糖尿病小鼠腎臟的代謝均有明顯影響.此外Norm-5μm組、db/db-5μm組聚類結(jié)果與對照組相距較近,而Norm-100nm和db/db-100nm組聚類結(jié)果與對照組較遠(yuǎn),聚類結(jié)果說明PSMPs暴露對腎臟代謝的影響具有一定的粒徑依賴性,且100nm PSMPs暴露對小鼠腎臟的代謝影響最為嚴(yán)重.通過比較各對照組和實驗組,篩選出各組中顯著差異性代謝物(SCMs), SCMs篩選標(biāo)準(zhǔn)為<0.05.如圖6(b)所示,Norm- 100nm組、Norm-5μm組、db/db-100nm組和db/db- 5μm組中分別鑒定出13、11、21和12個SCMs.根據(jù)組間差異篩選的SCMs可以看出兩種粒徑PSMPs的暴露共計導(dǎo)致26種代謝物較對照組發(fā)生顯著變化,不同實驗組間具有一定的差異性且db/db-100nm組小鼠腎臟代謝紊亂更為顯著.

進(jìn)一步對SCMs涉及的代謝通路進(jìn)行分析,結(jié)果如圖7所示.與Norm-CK組相比,Norm-100nm組涉及甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝以及酮體的合成和分解等相關(guān)代謝通路的改變(圖7a).Norm-5μm組涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等相關(guān)代謝通路的改變(圖7b). db/db-100nm組涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及檸檬酸循環(huán)等相關(guān)代謝通路的改變(圖7c).db/db-5μm組涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成,甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸代謝,檸檬酸循環(huán)等相關(guān)代謝通路的改變(圖7d).對代謝通路進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)這些代謝途徑主要參與氨基酸代謝、能量代謝、脂肪酸代謝和氧化應(yīng)激等過程.

圖6 小鼠腎臟1H NMR圖譜的PLS-DA得分圖和SCMs的Venn圖

圖中每一個點表示一個小鼠腎臟樣本,相同顏色的點表示來自同一個處理組,兩點之間距離越近表明兩樣品間的代謝差異越小

圖中氣泡的大小及顏色深淺代表不同代謝通路的值和影響值大小

對參與能量代謝和氧化應(yīng)激通路的SCMs豐度變化情況進(jìn)行分析,結(jié)果如表3所示.在參與能量代謝如檸檬酸循環(huán)、糖酵解/糖異生、氮代謝和丙酮酸代謝通路的SCMs中,Norm-100nm組、Norm-5μm組、db/db-100nm組和db/db-5μm組中分別共有1、2、5和3種不同的SCMs表達(dá)倍數(shù)較對照組發(fā)生顯著變化.其中在db/db- 100nm組中有4種SCMs豐度下調(diào),1種SCMs豐度上調(diào).參與能量代謝的SCMs數(shù)量和表達(dá)倍數(shù)變化的結(jié)果表明db/db-100nm組中小鼠腎臟能量代謝紊亂最為嚴(yán)重.在氧化應(yīng)激方面,與對照組相比,Norm-100nm組和db/db-100nm組小鼠腎臟中對氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)具有保護(hù)作用的?；撬嶝S度均顯著降低(<0.05),且?；撬嶝S度在db/db-100nm組下調(diào)最為明顯,說明100nm PSMPs暴露對小鼠腎臟造成了嚴(yán)重的氧化損傷,且對糖尿病小鼠更為明顯,進(jìn)一步驗證了腎臟的生化結(jié)果.

表3 能量代謝和氧化損傷相關(guān)SCMs的豐度變化

3 討論

本研究以糖尿病小鼠為模式生物,研究了PSMPs對糖尿病小鼠腎臟的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn),糖尿病小鼠腎臟對PSMPs暴露更加敏感.100nm和5μm PSMPs暴露誘導(dǎo)糖尿病小鼠腎臟組織出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤和淤血等病理損傷,100nm PSMPs暴露導(dǎo)致糖尿病小鼠腎臟出現(xiàn)更為嚴(yán)重的氧化損傷和代謝紊亂,表現(xiàn)出明顯的粒徑毒性效應(yīng).這可能與小粒徑PSMPs易透過腸道屏障在腎臟中累積有關(guān).此外,代謝組學(xué)結(jié)果顯示腎臟代謝通路紊亂引起的糖酵解能力受損和能量代謝水平降低也增加了PSMPs對糖尿病小鼠腎臟的損傷.

前期研究證明MPs可以在生物體內(nèi)累積并對肝、腎等器官造成嚴(yán)重?fù)p傷,如炎癥、氧化損傷等[13].本研究中,100nm和5μm PSMPs的暴露顯著增加了糖尿病小鼠腎臟促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的表達(dá)水平.TNF-α和IL-6作為免疫和炎癥反應(yīng)的生物標(biāo)志物其表達(dá)上調(diào)是炎癥反應(yīng)的重要特征[14].與健康小鼠相比,TNF-α和IL-6的表達(dá)水平在db/db- 100nm和db/db-5μm組中顯著上調(diào)表明PSMPs的暴露顯著加重了糖尿病小鼠腎臟的炎癥效應(yīng).前期研究中也有類似結(jié)果,例如Deng等[15]研究發(fā)現(xiàn)MPs能夠聚集在小鼠腎臟及腸道部位引起小鼠炎癥、氧化應(yīng)激和代謝紊亂等.王英雪等[16]證實,富集在哺乳動物腎臟的MPs可誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng).氧化應(yīng)激被認(rèn)為是PSMPs誘導(dǎo)損傷的主要毒性機(jī)制[17].機(jī)體的正常生理功能有賴于氧化與抗氧化系統(tǒng)的相互拮抗平衡[18],PSMPs的暴露促進(jìn)了生物體內(nèi)ROS(活性氧)的產(chǎn)生,而抗氧化物質(zhì)如GSH的含量下降,抗氧化能力降低,不能有效地清除ROS,多余的ROS進(jìn)一步導(dǎo)致腎臟的炎癥效應(yīng)[19].本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSMPs的暴露能夠顯著上調(diào)糖尿病小鼠腎臟SOD水平并下調(diào)GSH濃度,進(jìn)一步證實了PSMPs的暴露誘導(dǎo)了糖尿病小鼠腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥和氧化應(yīng)激效應(yīng).

MPs的生物毒性受到其在體內(nèi)吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程的影響,而MPs的尺寸和形狀是決定其體內(nèi)吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的重要因素[20].一般來說,尺寸越小的MPs具有更好的穿透力,對機(jī)體的損傷也越大.例如Lu等[21]發(fā)現(xiàn)5μm的MPs可以透過斑馬魚腸道屏障進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng),并在肝臟和脾臟中積累,誘導(dǎo)斑馬魚組織學(xué)變化和肝臟的氧化應(yīng)激,而20μm的MPs僅在魚鰓和腸道中積累.Jin等[22]研究結(jié)果表明500nm PSMPs的暴露對斑馬魚的毒性效應(yīng)要明顯高于5μm PSMPs對斑馬魚的損傷.本研究中,100nm PSMPs的暴露誘導(dǎo)小鼠腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥效應(yīng)和氧化損傷,這可能與較小粒徑的PSMPs易突破機(jī)體腸道屏障進(jìn)入血液循環(huán)在腎臟中累積有關(guān).

前期研究表明,大多數(shù)環(huán)境污染物進(jìn)入體內(nèi)可通過誘發(fā)氧化應(yīng)激破壞腎臟組織細(xì)胞,導(dǎo)致腎組織纖維化,促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)展[23].此外,糖尿病小鼠腎臟炎癥效應(yīng)導(dǎo)致的腎小球濾過屏障破壞也增加了糖尿病小鼠腎臟對污染物的易感性[24].對于腎臟功能不全的糖尿病機(jī)體,可能使更多的污染物在腎臟中累積,從而導(dǎo)致腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷[25].Jin等[26]證實鎘在糖尿病大鼠腎臟組織的累積量比非糖尿病大鼠高2倍,并進(jìn)一步加重了糖尿病小鼠腎小球和腎小管的損傷.Wei等[27]研究指出,與健康小鼠相比,砷更易在糖尿病小鼠腎臟中累積,從而誘導(dǎo)糖尿病小鼠腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重的損傷和代謝紊亂.綜上,糖尿病小鼠腎小球濾過屏障的破壞可能導(dǎo)致PSMPs在腎臟中累積增加,對腎臟造成更嚴(yán)重的損傷.

代謝組學(xué)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)等方面的研究,用于揭示環(huán)境污染物影響機(jī)體代謝的分子機(jī)制疾病[28].本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),2種粒徑PSMPs的暴露顯著擾亂了小鼠腎臟的氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝以及能量代謝通路,且100nm PSMPs對糖尿小鼠腎臟的代謝影響更為嚴(yán)重.已有研究證實氨基酸代謝異?？烧T導(dǎo)糖代謝紊亂,促進(jìn)慢性腎臟疾病的發(fā)生[29].脂質(zhì)代謝紊亂會誘發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激,從而導(dǎo)致胰腺β細(xì)胞功能受損,引發(fā)能量代謝障礙[30].腎臟細(xì)胞需要利用能量重吸收各種代謝廢物,而能量代謝障礙使得腎功能無法正常發(fā)揮,增加腎臟組織的負(fù)荷,誘發(fā)腎臟氧化應(yīng)激損傷[31].腎臟代謝組學(xué)數(shù)據(jù)顯示與能量代謝如檸檬酸循環(huán)、糖酵解/糖異生和氮代謝等有關(guān)的代謝物豐度在db/db-100nm組中顯著下調(diào).因此推測, 100nm PSMPs的暴露導(dǎo)致糖尿病小鼠腎臟代謝功能異常,細(xì)胞糖酵解能力受損以及能量代謝水平降低,進(jìn)而誘導(dǎo)腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重的氧化損傷.此外,本研究中與氧化應(yīng)激有關(guān)的代謝結(jié)果表明PSMPs暴露導(dǎo)致?；撬岬认嚓P(guān)代謝產(chǎn)物豐度顯著降低.Ghosh等[32]研究結(jié)果證實了?；撬峋哂袕?qiáng)抗氧化特性,可以通過減少氧化應(yīng)激來預(yù)防大鼠的糖尿病并發(fā)癥.與對照組相比,?；撬嶝S度在db/db-100nm組下調(diào)最為明顯,進(jìn)一步解釋了本研究中糖尿病小鼠腎臟的生化結(jié)果和100nm PSMPs表現(xiàn)出的粒徑毒性效應(yīng).

現(xiàn)有環(huán)境污染物的毒理學(xué)研究多基于健康模型開展,忽略了慢性病人群對污染物的毒性響應(yīng).以糖尿病為代表的慢性病人群在藥物調(diào)節(jié)的作用下其壽命與健康人群可能沒有明顯的差別,對于環(huán)境污染物具有相同的暴露風(fēng)險.流行病學(xué)研究表明,環(huán)境污染物是慢性病人群的重要危險因素,然而環(huán)境污染物與自身機(jī)能缺陷的慢性病人群間是否會產(chǎn)生交互作用尚缺乏基礎(chǔ)數(shù)據(jù).本文研究結(jié)果提示糖尿病等慢性病人群很有可能對環(huán)境污染物更加敏感,在今后的健康風(fēng)險研究中應(yīng)予以重視.

4 結(jié)論

4.1 糖尿病小鼠腎臟對PSMPs暴露更加敏感.與健康小鼠相比,100nm和5μm PSMPs暴露導(dǎo)致糖尿病小鼠腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重的病理學(xué)損傷(炎性細(xì)胞浸潤和淤血)、炎癥因子(TNF-α和IL-6)和SOD的表達(dá)水平顯著上調(diào),并誘導(dǎo)GSH的表達(dá)水平下調(diào)和代謝紊亂.

4.2 100nm PSMPs對糖尿病小鼠腎臟造成的損傷更為顯著.100nm PSMPs誘導(dǎo)糖尿病小鼠腎臟TNF- α、IL-6和SOD的表達(dá)水平顯著增加至(130.49±12.33) ng/g、(23.50±1.45) pg/mg和(132.25±8.20) U/mgprot,表現(xiàn)出明顯的粒徑毒性效應(yīng).這可能與小粒徑的PSMPs更易突破腸道屏障在腎臟中累積有關(guān).

4.3 腎臟代謝通路紊亂引起的糖酵解能力受損和能量代謝水平降低可能是PSMPs加劇糖尿病小鼠腎臟損傷的重要機(jī)制.

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Effects of polystyrene microplastics on kidney of diabetic mice.

LI Huan, LIU Su, ZHANG Jing-li, CHEN Jian-qiu*

(Department of Environmental Science, School of Engineering, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China)., 2022,42(3)：1369～1378

Diabetic mice were used as model organisms to investigate the toxicity of 100nm and 5μm polystyrene microplastics (PSMPs) (200μg/L) after exposure to drinking water for 28days. The results of the study indicated that diabetic mice were more sensitive to the exposure of PSMPs. Exposure to 100nm and 5μm PSMPs led to obvious pathological damage such as inflammatory cell infiltration and congestion in the kidneys of diabetic mice, and 100nm PSMP caused more severe pathological damage to the kidney. In addition, exposure to 100nm PSMPs significantly aggravated the expression levels of renal inflammatory factors (TNF-α and IL-6), superoxide dismutase (SOD) and serum creatinine in diabetic mice, and caused renal metabolic disorders. Compared with 5μm PSMPs, the small particle size toxicity exhibited by microplastics may be related to the easier accumulation of nano-level PSMPs in the kidneys through the intestinal barrier. Moreover, the impaired glycolysis and reduced energy metabolism levels caused by disorders of renal metabolic pathways also increased the burden of PSMPs on kidneys of diabetic mice.

polystyrene microplastics；diabetic mice；kidney；inflammation；oxidative stress

X174

A

1000-6923(2022)03-1369-10

李 歡(1994-),男,安徽阜陽人,中國藥科大學(xué)碩士研究生,主要從事環(huán)境毒理學(xué)方向研究.發(fā)表論文2篇.

2021-08-18

國家自然科學(xué)基金面上項目(21876207)

*責(zé)任作者, 教授, cjqer@163.com