張婷婷，馬希瑞，于雙華

（1.威海市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東 威海 264200；2.威海市環(huán)翠區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，山東 威海 264200；3.榮成市靖海畜牧獸醫(yī)站，山東 榮成 264300）

山東省某規(guī)模肉雞場(chǎng)20日齡左右白羽肉雞出現(xiàn)急性死亡，解剖發(fā)現(xiàn)以胸腺、肺臟、腎臟、腺胃乳頭等不同程度出血為主要癥狀。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室PCR檢測(cè)和細(xì)菌分離鑒定，確診該病為傳染性支氣管炎繼發(fā)大腸桿菌病，通過(guò)投用抗病毒、保肝護(hù)腎以及抗菌藥進(jìn)行治療，該病得到了有效的控制。現(xiàn)將該病的診治過(guò)程大致報(bào)告如下。

1 臨床癥狀與解剖病變

4.5 萬(wàn)只20日齡左右白羽肉雞，發(fā)病5d，每天死亡200～800只，主要表現(xiàn)呼吸道癥狀：有鑼音。據(jù)調(diào)查，該場(chǎng)肉雞1日齡噴霧免疫新城疫傳染性支氣管炎二聯(lián)疫苗，7日齡免疫新流法腺疫苗，9日齡刺種傳染性喉氣管炎雞痘二聯(lián)疫苗。解剖12只病死雞發(fā)現(xiàn)：幾乎所有病死雞都存在腎臟嚴(yán)重出血、胸腺出血、肺嚴(yán)重水腫出血、腺胃乳頭不同程度出血等病變；部分雞發(fā)現(xiàn)支氣管有黃色栓子，氣管環(huán)有不同程度出血，氣囊渾濁，十二指腸水腫出血，胸肌、腿肌出血等病變；還有少數(shù)雞出現(xiàn)心包積液、包心包肝等病變（見圖1）。

圖1 腎臟嚴(yán)重出血、肺嚴(yán)重水腫出血、腺胃乳頭出血、包心包肝

2 材料與方法

2.1 主要試劑胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色液等購(gòu)自青島海博生物；細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒、DL 2000 DNA Marker、PCR Mix購(gòu)自TaKaRa公司；一步法RT-PCR試劑盒購(gòu)自諾維贊生物科技有限公司；所用引物由生工生物合成。

2.2 可疑病原的PCR檢測(cè)采集病死雞的肝、肺、脾、腎、胸腺等組織，研磨后離心取上清液。按照說(shuō)明書操作，提取病毒核酸。參考標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行流感病毒（GB/T18936-2020）、傳染性支氣管炎病毒（GB/T 23197-2008）、新城疫病毒（GB/T 16550-2020）、傳染性喉氣管炎病毒（NY/T 556-2002）的PCR檢測(cè)。

2.3 細(xì)菌分離鑒定無(wú)菌采集病死雞的肝臟，分別接種于TSA平板和麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)、顏色，革蘭氏染色鏡檢。取單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中過(guò)夜搖菌，按照說(shuō)明書操作提取細(xì)菌核酸，以通用引物進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后送至生工生物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果上傳到NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)。

3 結(jié)果

3.1 可疑病原的PCR檢測(cè)經(jīng)PCR/RT-PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)樣品的流感、新城疫、傳染性喉氣管炎均為陰性，傳染性支氣管炎為陽(yáng)性（如圖2）。

圖2 四種病毒的PCR/RT-PCR檢測(cè)電泳圖

3.2 細(xì)菌分離鑒定在12只病死雞中有3只的肝臟中分離到圓形、灰白色的中等大小菌落；在麥康凱瓊脂平板上生長(zhǎng)，呈中等大小、圓形、紅色；鏡檢發(fā)現(xiàn)為革蘭氏陰性桿菌（如圖3）。16S rRNA基因擴(kuò)增得到相應(yīng)大小的條帶（如圖4）。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站在線BLAST比對(duì)，與大腸桿菌同源性最高。

圖3 分離菌菌落形態(tài)及鏡檢特性

圖4 分離菌16S rRNA基因擴(kuò)增電泳圖

4 討論

雞傳染性支氣管炎是一種急性高度接觸性傳染病，是由雞傳染性支氣管炎病毒感染所致，在肉雞中主要危害呼吸道，引起氣管鑼音、咳嗽、打噴嚏等癥狀。大腸桿菌為條件性致病菌，在雞場(chǎng)環(huán)境中廣泛存在，當(dāng)雞群免疫狀態(tài)差、空氣質(zhì)量差時(shí)，侵入雞上呼吸道的大腸桿菌無(wú)法被及時(shí)清除，就會(huì)導(dǎo)致氣囊炎、包心包肝等大腸桿菌病。本例中肉雞20日齡左右，正處于母源抗體下降的時(shí)期；適逢發(fā)病前幾天，天氣炎熱多雨，雞舍高溫高濕、氨氣含量升高；環(huán)境因素與病原體相互作用，雞群感染傳染性支氣管炎病毒，造成了呼吸道組織損傷，呼吸道上皮細(xì)胞喪失了清除致病菌的能力，引起雞大量死亡。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，我們確定造成該場(chǎng)肉雞死亡的原因?yàn)閭魅拘灾夤苎着c病毒大腸桿菌混合感染，后續(xù)通過(guò)投用抗病毒、保肝護(hù)腎以及抗菌藥治療，該病得到了有效的控制。