李 濤，宋國新，李 霄，孫浩然，李 海，劉 沖

漿細胞腫瘤(plasma cell neoplasms, PCN)是由終末分化的B細胞產(chǎn)生，通常分泌具有重鏈重排的單克隆丙種免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)，或稱M蛋白。PCN包括多種亞型：漿細胞骨髓瘤、漿細胞瘤、Ig沉積病、骨硬化性骨髓瘤(亦稱POEMS綜合征)等，其中漿細胞瘤又分為骨孤立性漿細胞瘤和骨外(髓外)漿細胞瘤。骨外(髓外)漿細胞瘤是發(fā)生于骨外軟組織的局限性孤立性腫瘤，最常見于上呼吸道，尤其是老年人的口咽、鼻腔鼻竇和喉等部位，形態(tài)學(xué)特點類似骨內(nèi)孤立性漿細胞瘤[1]。近年，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)部分發(fā)生于鼻腔鼻竇的漿細胞瘤伴有EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)感染，但WHO(2017)淋巴造血系統(tǒng)腫瘤分類中未提及該特征，目前也僅有少量的個案報道[2-7]，兩者之間潛在的關(guān)聯(lián)尚不明確。本文著重探討原發(fā)于鼻腔鼻竇的EBV陽性漿細胞瘤的臨床病理學(xué)特征及其與相關(guān)腫瘤的鑒別診斷，為臨床和病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年1月～2020年12月江蘇省人民醫(yī)院/南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理學(xué)部診斷的22例鼻腔鼻竇漿細胞瘤，其中7例為EBV陽性漿細胞瘤(占31.8%)。

1.2 方法

1.2.1HE及免疫組化 標本均經(jīng)10%中性福爾馬林充分固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、3 μm厚連續(xù)切片、HE染色、中性樹膠封固。免疫組化染色采用EnVision兩步法，所用一抗包括CD3(SP7)、CD5(SP19)、CD20(L26)、PAX-5(MX017)、CD79a(MX076)、CD38(MX044)、CD138(MI15)、MUM1(MUM1P)、CD30(Ber-H2)、CD56(MX039)、C-myc(EP121)、Ki-67(MIB-1)等，均購自福州邁新公司，利用Lumatas全自動免疫組化染色儀進行制片。

1.2.2EBER原位雜交 石蠟4 μm厚切片，烘烤后進行脫蠟和水化，隨后進行蛋白酶K處理、雜交孵育、顯色、水洗、蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水、中性樹膠封固等程序。其中EBV編碼的小RNA(EBER)探針購自北京中杉金橋公司，以EBV陽性的鼻咽癌作為陽性對照，用PBS代替探針作為陰性對照，實驗過程中酶處理和雜交孵育過程嚴格遵守?zé)o菌操作，保證實驗室和所有器械等均為專用，避免RNA酶污染。陽性結(jié)果判斷標準：僅為細胞核著色，胞質(zhì)和胞膜著色為陰性(核分裂除外)。

1.2.3FISH 石蠟3 μm厚切片2張，烘烤后進行脫蠟和水化，胃蛋白酶消化10 min，后經(jīng)70%、85%和100%梯度乙醇脫水固定，自然干燥。然后轉(zhuǎn)入暗室進行基因變性和雜交，加入探針放入原位雜交儀進行雜交反應(yīng)及后續(xù)處理，待實驗完畢，晾干，利用熒光顯微鏡觀察基因的突變形式。C-myc基因斷裂重組檢測試劑盒購自北京金菩嘉公司，所用探針為GLP C-myc(8q24)。判讀標準：10%以上腫瘤細胞出現(xiàn)1個黃色融合信號、1個紅色信號和1個綠色信號為陽性(正常為2個黃色信號)。

1.2.4Ig基因重排檢測 DNA提取試劑盒采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit，引物系統(tǒng)符合BIOMED-2標準，PCR反應(yīng)液購自上海源奇生物公司，在ABI3130遺傳分析儀上進行片段掃描的克隆性分析，再根據(jù)“BIOMED-2解讀指南”進行判斷分析，其中單克隆結(jié)果為：目的范圍內(nèi)出現(xiàn)明確單峰熒光信號或在弱的多信號背景中出現(xiàn)明確單峰信號判斷為單克隆性重排；顯示連續(xù)多熒光信號的鐘型曲線判斷為多克隆性重排。實驗過程包含質(zhì)控要求：若標本在100、200、300、395 bp位置收集到ROX熒光信號(紅色峰)，則表示標本DNA的質(zhì)量和數(shù)量符合要求；反之，重新檢測樣品，若仍無熒光信號則檢測結(jié)果報告為“用于檢測的DNA數(shù)量或者質(zhì)量不合格，無法進行檢測”。檢測基因(含有效監(jiān)測范圍)如下：管家基因(100、200、300、394 bp)、FR1-JH(310～360 bp)、FR2-JH(250～295 bp)、DH-JH(110～290 bp、390～420 bp)、Vk-Jk(120～160 bp、190～210 bp、260～300 bp)、Vk-Kde+intron-Kde(210～250 bp、270～300 bp、350～390 bp)。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征7例均為老年男性患者，年齡范圍58～70歲，平均65.7歲。發(fā)病部位包括鼻腔(3例)、鼻竇(2例)、鼻中隔(1例)、鼻前庭(1例)。腫瘤直徑1～3.5 cm，平均2.2 cm。所有患者均為孤立性偶發(fā)病例，無免疫抑制劑治療、器官移植以及漿細胞骨髓瘤等相關(guān)病史，主要臨床表現(xiàn)依據(jù)發(fā)病頻率依次為：鼻出血(5/7)、鼻塞(5/7)、鼻息肉(2/7)、不規(guī)則新生物(2/7)、癤腫(1/7)。

2.2 病理特征7例腫瘤性漿細胞呈彌漫實性生長，根據(jù)漿細胞分化成熟度分為三個級別：1級2例，腫瘤細胞分化好，具有成熟漿細胞形態(tài)，細胞呈卵圓形，核偏位，染色質(zhì)深染、均質(zhì)狀或呈“車輻狀”分布在核膜邊緣，無核仁，有豐富的嗜堿性胞質(zhì)和核周空暈(圖1)；2級1例，腫瘤細胞分化較不成熟，瘤細胞體積大，核染色質(zhì)疏松，核質(zhì)比例高，核異型增加，核仁明顯，可見雙核或多核細胞，但胞質(zhì)仍較豐富、嗜堿性，核周空暈可見(圖2)；3級4例，瘤細胞分化更為不成熟，其中1例呈現(xiàn)漿母細胞樣形態(tài)(核大空泡狀，核仁明顯、居中，核分裂易見，胞質(zhì)較少聚集在細胞膜邊緣，核周空暈不明顯或缺如，圖3)，另外3例呈現(xiàn)間變性形態(tài)(顯著的多形性和異形性，圖4)。為進一步觀察腫瘤的病理特征，將本組7例再分為分化成熟組2例和不成熟組5例，其中2例分化成熟組中部分區(qū)域仍散在分布較為不成熟的腫瘤性漿細胞。

圖1 腫瘤細胞具有成熟漿細胞形態(tài)，異型小，細胞呈卵圓形，核偏位，染色質(zhì)深染、均質(zhì)狀或呈“車輻狀”分布 圖2 腫瘤細胞分化較不成熟，瘤細胞體積大，核染色質(zhì)疏松，核質(zhì)比例高，核異型增加 圖3 腫瘤細胞呈漿母細胞樣，具有大而空泡狀的細胞核，核仁明顯、居中，核分裂易見 圖4 腫瘤細胞異型性顯著(體積增大，核形不規(guī)則、核仁顯著、多核、巨核)，符合間變性特征 圖5 腫瘤細胞彌漫表達CD79a，EnVision兩步法 圖6 腫瘤細胞彌漫表達CD138，EnVision兩步法 圖7 腫瘤細胞彌漫表達MUM1，EnVision兩步法 圖8 具有漿母細胞樣形態(tài)特征的腫瘤Ki-67增殖指數(shù)高達90%，EnVision兩步法 圖9 EBER原位雜交檢測陽性

2.3 免疫表型腫瘤細胞主要表達CD79a(圖5)以及漿細胞分化的標記，如CD38、CD138(圖6)、MUM1(圖7)，陽性率均為100%，不表達CD20和PAX-5。Ki-67增殖指數(shù)為10%～90%，其中分化成熟組為10%～20%，分化不成熟組為40%～90%(圖8)。Ki-67陽性率>70%的3例腫瘤細胞CD30陰性、CD56陽性。

2.4 EBER原位雜交檢測22例漿細胞瘤中7例出現(xiàn)彌漫強陽性，陽性定位于細胞核，呈棕黃色(圖9)，7例切片陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控組織較理想著色或不著色，提示EBER原位雜交檢測陽性。

2.5 FISH檢測7例C-myc基因斷裂重組檢測鏡下所見C-myc基因為2個黃色信號或表現(xiàn)為1紅1綠1黃比率<10%，提示C-myc基因均未發(fā)生易位。

2.6 Ig基因重排檢測7例均為陽性，其中5例表現(xiàn)為IGH和IHK(重鏈和輕鏈)重排，1例表現(xiàn)為IGH重排，1例表現(xiàn)為IGK重排，涉及的基因及出現(xiàn)頻率為：FR2-JH(6/7)、FR1-JH(1/7)、DH-JH(1/7)、Vk-Kde+intron-Kde(5/7)、Vk-Jk(1/7)。所有病例均可見輕鏈限制性表達(κ或λ)。

2.7 預(yù)后7例患者6例獲得隨訪資料，1例失訪，隨訪2.7～40個月，均存活，至今無復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，其中4例術(shù)后進行了放療，1例進行細胞免疫治療，1例未進行治療。

3 討論

漿細胞瘤伴EBV陽性這一特征并未在WHO(2017)淋巴造血系統(tǒng)腫瘤分類中提及，目前僅為少數(shù)個案報道[2-9]，文獻報道該現(xiàn)象多見于移植后的漿細胞瘤[4]。本組22例鼻腔鼻竇漿細胞瘤中EBV陽性7例(占31.8%)。腫瘤細胞CD79a、MUM1、CD138、CD38陽性，CD20和PAX-5陰性。Ig基因重排檢測均為陽性并可見輕鏈限制性表達(κ或λ)。C-myc基因斷裂重組檢測均為陰性。患者均為孤立性偶發(fā)病例，無免疫抑制劑治療、器官移植以及漿細胞骨髓瘤等相關(guān)病史。7例均符合骨外(髓外)孤立性漿細胞瘤的臨床病理特征，但與一般的漿細胞瘤不同的是所有病例EBER原位雜交檢測均呈陽性。

EBV又稱人類皰疹病毒-4型(human herpesvirus-4, HHV-4)，是一種普遍存在的雙鏈DNA病毒，主要感染人口咽上皮和淋巴細胞，通過病毒的包膜糖蛋白Gp350與B淋巴細胞表面的CD21受體結(jié)合，優(yōu)先感染B淋巴細胞[10]。目前，已明確EBV與許多疾病有關(guān)，包括上皮和間葉性腫瘤以及淋巴造血系統(tǒng)疾病等，但其發(fā)病機制的確切作用尚未完全明了[11]。EBV的生命周期具有原發(fā)感染(包括溶解復(fù)制階段)和潛伏期雙向性特點：原發(fā)感染階段，由于宿主缺乏對病毒的免疫力，病毒可破壞口咽細胞。接下來的幾天和幾周內(nèi)，細胞免疫和體液免疫得以發(fā)展，病毒潛伏在記憶B細胞中，使記憶B細胞成為EBV貯存庫，被病毒感染的細胞便逃避了機體的免疫識別[10]。盡管全球90%以上的人口感染了EBV，但僅有一小部分相關(guān)感染會導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)化[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)EBV血清陽性的健康個體中，受EBV感染的記憶B細胞向漿細胞的終末分化與病毒復(fù)制和EBV裂解周期的啟動有關(guān)，呈現(xiàn)一種限制性潛伏期模式[2,6,12]。EBER作為EBV編碼的小RNA，屬于EBV的表達產(chǎn)物，在EBV感染的細胞核中以高拷貝數(shù)存在，可能參與了抑制細胞凋亡、誘導(dǎo)細胞增殖和腫瘤形成等過程[13]。結(jié)合本組分析發(fā)現(xiàn)鼻腔鼻竇的漿細胞瘤雖然少見，但發(fā)病人群中EBV感染率占31.8%，盡管相關(guān)機制尚不明確，推測EBV可能與漿細胞瘤的發(fā)生有一定的關(guān)系，需要擴大樣本量進行深入探究。

本組7例腫瘤細胞均呈彌漫浸潤，形態(tài)上依據(jù)漿細胞分化程度呈完整的譜系，即腫瘤細胞從成熟到不成熟形態(tài)，甚至呈現(xiàn)間變性或漿母樣特征。本組3例呈間變性特征，1例具有漿母細胞樣形態(tài)特點，此外分化較為成熟的2例中也有部分區(qū)域散在分布分化較為不成熟的漿細胞。腫瘤增殖指數(shù)在2例分化較成熟組分別為10%和20%，在5例分化不成熟組為40%～90%。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，個別學(xué)者亦觀察到EBV陽性漿細胞瘤的形態(tài)學(xué)特征可表現(xiàn)為漿母細胞性、局灶漿母細胞性或間變性[14]。結(jié)合本組病例，發(fā)現(xiàn)EBV對腫瘤的形態(tài)和增殖活性可造成一定的影響。

鑒別診斷：當EBV陽性漿細胞瘤中存在間變性或漿母細胞樣形態(tài)特征時，需與漿母細胞淋巴瘤(plasmablastic lymphoma, PBL)進行鑒別[15]。PBL更易呈EBV陽性(陽性率為60%～75%，發(fā)生于口腔黏膜的陽性率接近100%)，同時具有高增殖活性[1]，其形態(tài)及免疫表型等諸多特征均與EBV陽性漿細胞瘤極為相似，但兩者臨床治療方案卻截然不同，因此PBL是EBV陽性漿細胞瘤最重要的鑒別點之一。PBL好發(fā)于HIV陽性的男性患者，大部分腫瘤細胞類似于B免疫母細胞，目前歸類于大B細胞淋巴瘤范疇。形態(tài)學(xué)具有較大的變化范圍，從彌漫和鑲嵌排列到顯著的漿細胞性分化，腫瘤細胞具有顯著的異型性、核偏位、胞質(zhì)豐富、核仁明顯、核分裂象易見，可見凋亡小體等。PBL細胞具有漿細胞表型，表達CD138、CD38、Vs38c、IRF4/MUM1，不表達或弱表達CD20、PAX-5，但與漿細胞瘤不同的是該腫瘤常表達EMA、CD30，不表達CD56，Ki-67增殖指數(shù)一般較高(>90%)[1]。遺傳學(xué)上MYC基因是在PBL中最早報道的異常基因[16]，也是PBL中最常見的染色體異常(陽性率達49%)[17]。本組有3例Ki-67呈高增殖指數(shù)(>70%)，但CD30陰性、CD56陽性，C-myc基因斷裂重組檢測均為陰性，不符合PBL的特點，盡管形態(tài)存在間變性或漿母細胞樣的特點，最終診斷為EBV陽性漿細胞腫瘤，伴有間變性或漿母細胞樣形態(tài)特征。另一方面當腫瘤細胞形態(tài)學(xué)呈現(xiàn)分化較為成熟以及伴有Ki-67低增殖指數(shù)時，需進一步與低級別的結(jié)外邊緣區(qū)黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤伴廣泛的漿樣分化以及漿細胞單克隆性增殖鑒別[18-19]。因此，外檢中如果發(fā)現(xiàn)漿細胞瘤存在間變性或漿母細胞樣特征時，需考慮EBV感染的可能性，同時還要充分的詢問患者是否存在免疫抑制治療、器官或組織移植等病史[4]。

7例患者6例獲得隨訪資料，1例失訪，隨訪時間2.7～40個月，至今均存活，其中4例術(shù)后進行了放療，1例進行細胞免疫治療，1例未進行治療。有研究報道，EBER陽性患者預(yù)后良好，無侵襲性臨床病程，但與EBER陰性患者相比，EBER陽性患者更容易出現(xiàn)疾病進展(復(fù)發(fā)/進展為多發(fā)性骨髓瘤)[5]，由于目前所觀察的樣本較小，該結(jié)論仍需進一步探討。

EBV的存在對腫瘤的形態(tài)和增殖活性具有一定的影響，但對該疾病發(fā)病機制和發(fā)展的影響仍需進一步觀察，有待大樣本數(shù)據(jù)的薈萃分析，建議病理醫(yī)師在今后的外檢工作中增加漿細胞腫瘤EBV的檢測，為進一步認識該腫瘤的生物學(xué)行為儲備病例資料。