錢云峰，梁恭博，李 靜，劉姍姍，王卓才，閆廣寧

經(jīng)典型骨肉瘤(conventional osteosarcoma, COS)是一種高度惡性骨腫瘤，位居原發(fā)性骨肉瘤的首位，進展迅速，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率高，預(yù)后差，患者生活質(zhì)量差[1]。骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)分子機制急需深入探究，為開發(fā)新的治療靶點、預(yù)后判斷提供參考依據(jù)。T淋巴細胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T lymphocyte immunoglobulin mucin molecule-3, TIM-3)是一種新的免疫檢查點分子，表達于多種免疫細胞[2]。TIM-3作為膜表面抑制性受體，在免疫細胞中主要介導(dǎo)腫瘤免疫抑制。目前，TIM-3在骨肉瘤中的研究鮮有報道[3]。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，觀察COS中TIM-3蛋白表達，分析其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系及與預(yù)后的相關(guān)性，以期為免疫治療及相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2007～2016年中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院診治的50例COS。診斷結(jié)果由兩名資深病理醫(yī)師再次核對。收集的臨床資料和病理特征包括患者性別、年齡、發(fā)病部位、切除方式、術(shù)前化療與否、腫瘤最大直徑、Ennecking分期及組織學(xué)分型等。

1.2 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋后常規(guī)切片。免疫組化染色采用EnVision法。一抗TIM-3(稀釋比1 ∶100，克隆號EPR22241，兔抗人)購自Abcam公司。二抗、抗體稀釋劑及DAB顯色劑均購自DAKO公司。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。實驗操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。

1.3 結(jié)果判讀TIM-3多數(shù)表達于腫瘤浸潤性免疫細胞，如淋巴細胞及單核巨噬細胞。細胞膜出現(xiàn)明顯棕黃色染色者為陽性，每例切片隨機選取10個高倍視野(400×)陽性細胞計數(shù)。評分標(biāo)準(zhǔn)：(1)按陽性細胞百分比計分：<3%為0分，3%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分；(2)按細胞著色深淺計分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項得分結(jié)果相乘：0～3分為低表達，4～9分為高表達。由兩位資深病理醫(yī)師采用雙盲法閱片。

1.4 隨訪查閱患者門診、住院記錄或進行電話追蹤隨訪?？偵嫫?overall survival, OS)是指術(shù)后第1天至此次腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的死亡時間，無瘤生存期(disease-free survival, DFS)是指從腫瘤切除后到腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。單因素生存分析采用Kaplan-Meier檢驗法，Log-rank檢驗生存曲線差異。定性資料的組間分析采用列聯(lián)表χ2檢驗或Fisher精確檢驗。兩變量均值比較采用兩獨立樣本t檢驗。多因素分析采用Cox比例風(fēng)險模型分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征50例COS患者，男性31例(62%)，女性19例(38%)；年齡7～68歲，平均24歲，中位年齡20歲；發(fā)病部位：股骨29例(58%)，脛骨9例(18%)，肱骨5例(10%)，骨盆3例(6%)，腓骨2例(4%)，鎖骨、骨外各1例(2%)；接受新輔助化療37例(74%)，未接受新輔助化療13例(26%)；患者接受腫瘤根治術(shù)41例(82%)，截肢術(shù)9例(18%)；Ennecking臨床分期：ⅡA期12例(24%)，ⅡB期33例(66%)，Ⅲ期5例(10%)；腫瘤最大徑1.4～18 cm，平均8.23 cm；組織學(xué)類型：骨母細胞型30例(60%)，軟骨母細胞型6例(12%)，纖維母細胞型14例(28%)。

2.2 TIM-3表達與COS臨床病理特征的關(guān)系50例COS中TIM-3低表達37例(74%)，高表達13例(26%)(圖1)。TIM-3高表達組的腫瘤平均直徑為10.04 cm，TIM-3低表達組的腫瘤平均直徑為7.61 cm，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.024)。有完整隨訪資料的患者中，TIM-3高表達患者腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)比例為53.8%(7/13)，低表達患者為22.6%(7/31)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.042)；TIM-3高表達患者腫瘤轉(zhuǎn)移比例為61.5%(8/13)，低表達患者為54.8%(17/31)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.682)。TIM-3表達與患者性別、年齡、發(fā)病部位、接受新輔助化療、手術(shù)方式、Ennecking分期及組織學(xué)分型均無關(guān)(表1)。

圖1 COS中TIM-3的表達，EnVision法：A.陰性；B.弱陽性；C.中等陽性；D.強陽性

表1 TIM-3表達與COS臨床病理特征的關(guān)系

2.3 TIM-3表達與COS患者預(yù)后的關(guān)系50例患者隨訪13～60個月，中位隨訪時間為35個月。其中死亡21例，失訪6例。Kaplan-Meier生存分析顯示，TIM-3低表達和高表達患者病死率分別為37.8%和53.8%，平均OS為38.4個月和38.6個月(P>0.05)，平均DFS為28.5個月和28個月(P>0.05)，兩組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。Cox多因素分析顯示，TIM-3的表達水平不是COS患者OS及DFS的獨立影響因素(P>0.05)。

圖2 A.TIM-3表達與COS患者OS的關(guān)系；B.TIM-3表達與COS患者DFS的關(guān)系

3 討論

COS是青少年常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，位居青少年惡性腫瘤的第5位[4]。骨肉瘤約占原發(fā)骨腫瘤的16%，其中90%為COS，惡性程度高，預(yù)后差[5]。近年來隨著輔助化療及手術(shù)方式的改善，患者預(yù)后有了明顯的改善，但患者遠期生存率和生活質(zhì)量仍不理想。COS發(fā)病機制復(fù)雜，化療抵抗比例較高，進展快，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險高，患者生活質(zhì)量差，急需深入研究以尋找更好的治療方法[6]。

T細胞是抗腫瘤免疫反應(yīng)過程中的核心參與者，而免疫檢查點(immune checkpoints, ICs)是表達于免疫細胞且能調(diào)節(jié)免疫激活程度的一系列分子(如PD-1/PD-L1、CTLA-4/B7)，在維持免疫耐受和機體免疫穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用，并負向調(diào)控T細胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)[7]。TIM-3屬于免疫球蛋白超家族，胞內(nèi)區(qū)含有酪氨酸殘基，可與Src家族的磷酸酶相互作用，啟動下游信號通路[3]。TIM-3表達見于多種免疫相關(guān)細胞及多種腫瘤細胞，常與PD-1分子共同表達于T細胞，是T細胞功能耗竭的重要標(biāo)志。TIM-3的配體包括半乳凝素-9(Galectin-9)、高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1 protein, HMGB1)、癌胚抗原相關(guān)細胞黏附分子1(carcino-embryonic antigen related cellular adhesion molecule 1, CEACAM1)等[2]。本課題組前期研制并驗證了一組TIM-3單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)TIM-3蛋白有兩種分子量，高分子量的TIM-3表達于腫瘤相關(guān)巨噬細胞及T細胞膜[8]，為免疫組化檢測TIM-3表達提供了良好手段。

在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)TIM-3參與調(diào)控腫瘤生長。在食管癌中，TIM-3表達與PD-1表達及CD8+的腫瘤浸潤淋巴細胞數(shù)量呈正相關(guān)，TIM-3是患者預(yù)后的獨立影響因素[9]。在非小細胞肺癌中，TIM-3表達于腫瘤浸潤性T淋巴細胞，并與細胞免疫功能相關(guān)[10]。TIM-3/Galectin-9參與慢性淋巴細胞白血病患者T細胞的負性調(diào)控[11]；TIM-3在肝癌中抑制NK細胞功能從而促進肝癌細胞增殖[12-13]。TIM-3可以下調(diào)T細胞穿孔素和粒酶B的表達從而降低結(jié)腸癌中T細胞的殺傷能力[14]。TIM-3甚至可以通過NF-κB/STAT3通路直接促進乳腺癌的侵襲能力[15]。有關(guān)TIM-3在骨肉瘤中的作用研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，骨肉瘤中TIM-3陽性T細胞和單核細胞通過結(jié)合表達Galectin-9的CD4+/CD25+調(diào)節(jié)性T細胞進而發(fā)揮其免疫抑制作用[16]。骨肉瘤患者血清中可溶性TIM-3量高于良性骨腫瘤及正常骨組織，且血清中TIM-3的表達量與腫瘤體積、組織學(xué)分級、臨床分期及遠處轉(zhuǎn)移均有關(guān)，在區(qū)分骨肉瘤與良性骨腫瘤和骨組織時有較好的特異性[17]。患者外周血CD4+及CD8+T細胞上TIM-3表達異常升高，且與腫瘤分期、遠處轉(zhuǎn)移、病理性骨折以及總生存期相關(guān)[18]。TIM-3在骨肉瘤組織中的表達顯著高于周圍正常組織，TIM-3高表達與患者較短的總生存期有關(guān)[19]。TIM-3除了表達于免疫細胞膜，也表達于骨肉瘤細胞和細胞系[20]。骨肉瘤細胞中TIM-3的表達可增強細胞增殖和遷移能力并通過NF-κB通路增強細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[21]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，COS中TIM-3表達水平高低不一。TIM-3高表達組的腫瘤平均直徑高于低表達組(P=0.024)，提示TIM-3高表達的腫瘤生長速度更快，惡性程度更高，可能與TIM-3抑制腫瘤浸潤淋巴細胞的免疫功能有關(guān)，也可能與TIM-3對腫瘤細胞的直接作用有關(guān)，與以往研究結(jié)果一致。TIM-3高表達患者腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)比例明顯高于低表達患者(P=0.042)，TIM-3高表達患者更易復(fù)發(fā)，在既往研究中未見相關(guān)報道，可能與腫瘤免疫微環(huán)境被抑制或TIM-3直接激活腫瘤細胞相關(guān)分子通路、激活腫瘤干細胞特性或增強化療抵抗能力相關(guān)。另外，本組結(jié)果中TIM-3表達與患者遠處轉(zhuǎn)移及生存期無相關(guān)性，多因素分析結(jié)果未發(fā)現(xiàn)TIM-3表達對COS患者預(yù)后的獨立影響。本組結(jié)果中TIM-3對患者預(yù)后的影響趨勢不明顯，可能與納入樣本量有關(guān)，也可能與免疫組化檢測TIM-3表達的半定量評價相較流式細胞術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附法檢測TIM-3定量分析不準(zhǔn)確有關(guān)。后續(xù)仍需擴大樣本量，更換檢測方法進一步驗證實驗結(jié)果。

綜上所述，本實驗發(fā)現(xiàn)COS中TIM-3表達水平與COS的瘤體體積及腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險相關(guān)，提示TIM-3對COS的促腫瘤作用。腫瘤免疫檢查點抑制劑的研究和應(yīng)用正在飛速進展，敏感患者的療效與傳統(tǒng)療法相比，其具有明顯優(yōu)勢。骨肉瘤高度惡性，遠期生存率低，免疫檢查點抑制劑的治療應(yīng)用可能為骨肉瘤患者帶來臨床獲益和更好的生存質(zhì)量。本實驗通過探究TIM-3在COS中的表達以及臨床病理意義，有望為骨肉瘤免疫治療研究和靶點選擇提供實驗依據(jù)和思路。