孟凡宇 陳興華 張磊 劉華江 俞婷 謝珉寧

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院中醫(yī)肛腸科,上海 201508)

痔是肛墊組織，是血管增生性疾病，癥狀包括出血、疼痛、脫垂和肛周瘙癢，人群中患病率高達(dá)39%[1-2]。有研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，痔組織中雌激素異常表達(dá)與疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。因此，我們希望通過觀察痔病患者術(shù)前術(shù)后組織中ER表達(dá)情況，探討ER與痔術(shù)后組織水腫的關(guān)系。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 2018.12月至2019.6月我科痔手術(shù)患者共185例，平均年齡(45.29±13.97)歲，男性77例，女性108例，并發(fā)術(shù)后肛緣水腫患者14例，水腫發(fā)生率7.57%，男性水腫2例(2.60%)，女性水腫12例(11.1%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2=4.658，P<0.031，年齡在31～70歲之間，平均年齡(45.29±13.97)歲。選取2018年12月至2019年6月于我科行混合痔(Miligan-Morgan術(shù))手術(shù)切除，出現(xiàn)術(shù)后水腫且行水腫組織切除術(shù)的患者14例。手術(shù)均由一名有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師完成。參照痔臨床診療指南[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)： (1)符合混合痔臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。(2)年齡在18周歲以上，性別不限。(3)在我科行混合痔(Miligan-Morgan)手術(shù)切除，且術(shù)后出現(xiàn)肛緣水腫。(4)自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他肛腸科疾病患者(如肛門直腸腫瘤、潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn病、肛周皮膚病等)。(2)患有重大內(nèi)科疾病。(3)近期服用各類藥物，長期臥床等嚴(yán)重影響觀察的患者。(4)妊娠及哺乳期婦女。

1.2方法 (1)臨床資料采集：包括姓名、性別、年齡。共收集術(shù)后水腫患者14例，收集到11例時行IHC檢測，行Western blot檢測時，有6例患者因組織已全部做IHC，故無組織作為檢測。其余 5例已行IHC檢測的患者加上新收集3例術(shù)后水腫患者，共8例行Western blot檢測。(2)免疫組化檢測(IHC)：石蠟切片，脫蠟，水合，將切片用二甲苯浸泡5 min，更換二甲苯后再浸泡5 min。分別用無水乙醇中浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min；85%乙醇中浸泡5 min；70%乙醇中浸泡5 min，PBS浸洗3 min×3次?？乖迯?fù)：將放有切片染色架放入盛有抗原修復(fù)緩沖液的染色盒內(nèi)，放至微波爐中，加熱10 min，將染色盒取出浸入流水中，自然冷卻后用PBS浸洗3次。滅活酶：每張切片滴加2滴3%H2O2-甲醇溶液，室溫(15～25℃)封閉10 min。PBS浸洗3 min×3次。封閉:滴加1%BSA50-100ul,室溫孵育20 min。甩去，不洗?？乖?抗體反應(yīng)：滴加一抗50～100 uL，4℃過夜。PBS浸洗3 min×3次；一抗二抗反應(yīng)：滴加羊抗兔聚合物50ul，，室溫濕盒孵育20 min。PBS浸洗3 min×3次；顯色：每張片子加2滴新鮮配制的DAB溶液(中國 福州邁新生物科技有限公司DAB-1031)；終止顯色：鏡下觀察染色深淺，染好立即終止,用自來水輕柔沖洗15 min用蒸餾水終止顯色反應(yīng)；復(fù)染：將切片放入蘇木素染液(中國 南京建成公司 D005)，染色10 min ，用蒸餾水沖洗干凈。如染色過深，可用0.1%HCl分化，自來水沖洗后返藍(lán)；脫水封片：分別用70%乙醇中浸泡5 min；85%乙醇中浸泡5 min；95%乙醇中浸泡5 min；無水乙醇中浸泡5 min。用二甲苯浸泡10 min，更換二甲苯后再浸泡10 min。在切片上加中性樹膠(中國 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司10004160)，加蓋玻片；觀察：光學(xué)顯微鏡(日本Olympus BX43)下觀察組織細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況，取3個高表達(dá)區(qū)域拍照保存(所有圖片均200x拍攝)。(3)Western blot：提取痔組織的蛋白。用二辛可寧酸方法測量裂解物的蛋白質(zhì)濃度。 用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離裂解物，并電泳轉(zhuǎn)移到聚二氟乙烯二氟化物膜上。用5%牛血清白蛋白封閉膜，然后在4℃下與一抗(1：1 000)孵育過夜。 將膜用TBS / T洗滌3次，并在室溫下與合適的第二抗體(1：2 000)一起溫育1 h。 然后洗滌膜，用ECL顯色免疫反應(yīng)條帶，并通過放射自顯影觀察。使用GAPDH抗體為標(biāo)準(zhǔn)化蛋白。使用G:BOX chemiXR5成像，使用Gel-Pro32軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1ER的IHC結(jié)果 通過對11個痔患者術(shù)前痔組織和術(shù)后水腫組織中ER表達(dá)對比，觀察到術(shù)后水腫組織中ER表達(dá)明顯高于術(shù)前組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：圖a和圖b為病例5、6、9、10患者術(shù)前術(shù)后組織ER表達(dá)對比，圖c顯示術(shù)后水腫組織中ER表達(dá)高于術(shù)前組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t=-2.248，P<0.05。(共11例患者)圖1

2.2ER的Western blot結(jié)果 通過對8個痔患者術(shù)前痔組織和術(shù)后水腫組織中ER表達(dá)對比，觀察到術(shù)后水腫組織中ER表達(dá)明顯高于術(shù)前組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：圖a和圖b為8例患者術(shù)前術(shù)后組織(10,10’分別為同一患者術(shù)前術(shù)后組織表達(dá)情況，依次類推)行western blot中ER表達(dá)情況，圖c中顯示術(shù)后水腫組織ER表達(dá)高于術(shù)前組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，t=-2.872，P<0.05。圖2

3 討 論

有研究表明ER與痔的發(fā)生發(fā)展存在一定的關(guān)系[4,5]。我們研究發(fā)現(xiàn)女性痔水腫術(shù)后發(fā)生率高于男性，這與陳富軍等[3]研究結(jié)果一致，提示雌激素表達(dá)水平可能與痔術(shù)后水腫相關(guān)。Parés D等[7]對切除的痔組織樣本研究，檢測女性的肛管中的雌激素和孕激素受體的表達(dá)，研究其與絕經(jīng)狀態(tài)和年齡的關(guān)系，被證實(shí)無顯著差異，這也為我們的研究提供一定的研究基礎(chǔ)。

因此本次研究著重從ER與痔瘡術(shù)后水腫的關(guān)系出發(fā)，經(jīng)對同一患者的術(shù)前組織與術(shù)后水腫組織進(jìn)行IHC與Western blot的雙重對比研究，發(fā)現(xiàn)痔瘡術(shù)后水腫組織中ER表達(dá)的確較術(shù)前組織明顯增高，因此我們推測ER的表達(dá)很有可能是參與痔瘡術(shù)后水腫的重要影響因素。研究中出現(xiàn)一例特殊的患者，第8例患者術(shù)后水腫組織中雌激素表達(dá)低于術(shù)前痔組織，本例患者為一名年輕男性患者，年齡31歲，這僅僅是個例？還是由于男性中雌激素水平和女性不同而出現(xiàn)的結(jié)果？由于水腫男性患者僅有2例，目前還很難解釋。雌激素是人體內(nèi)重要的類固醇激素，可調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)生理功能[8]，通過與雌激素受體(Estrogenreceptor,ER)結(jié)合發(fā)揮作用。有研究顯示雌激素存在一定的抗炎作用和促炎作用[9]。我們的研究觀察到水腫痔瘡中存在有ER增高表達(dá)的現(xiàn)象，因此我們推斷雌激素參與了痔瘡術(shù)后水腫的發(fā)生，并有可能是通過促進(jìn)血管新生，增加了局部組織體積，從而引起了痔組織的水腫。當(dāng)然以上結(jié)果還需要更大樣本的檢測來證實(shí)。血清中雌二醇含量、生物可利用雌二醇閾值和術(shù)后水腫是否存在一定的聯(lián)系？老年男性患者中血清雌二醇水平高于絕經(jīng)后女性，是否意味著老年男性術(shù)后痔水腫發(fā)生率更高？由于經(jīng)費(fèi)及時間所限，上述問題未能有滿意的答案。有待于我們進(jìn)一步研究。

總之對ER在痔組織中的表達(dá)情況的研究，為進(jìn)一步研究痔術(shù)后水腫原因提供了新的思路，減少ER在局部組織中的表達(dá)也許會成為臨床預(yù)防痔術(shù)后水腫的新方向。ER如何影響痔的發(fā)展及痔中血管的增生的機(jī)制仍不清楚，進(jìn)一步研究痔的微觀結(jié)構(gòu)及血管變化，血清中雌二醇的變化也將是我們進(jìn)一步研究的方向。