劉歡 黃小龍 劉濟明 梁格林

(貴州大學，貴陽，550025) (貴州省林業(yè)科學研究院) (貴州大學)

米槁(CinnamomummigaoH. W. Li)為樟科(Lauraceae)樟屬常綠喬木，主要分布于我國西南地區(qū)，成年樹高可達25 m，樹皮表面粗糙呈茶褐色，具有縱向裂紋[1]，葉片互生，硬紙質，果實近球形，果托似高腳杯狀，花期為4—5月份，果實發(fā)育期較長(6—11月份)[2]。米槁干燥成熟的果實又名大果木姜子，是貴州著名的藥材，因具有極高的藥用價值，被譽為“民族苗藥”。以大果木姜子為原材料開發(fā)的理氣活血滴丸、心胃止痛膠囊等為貴州民族藥用產(chǎn)業(yè)的重要產(chǎn)品[3]。

種子的發(fā)育過程是植物有機個體發(fā)育的最初階段，也是形成幼苗的重要階段，不僅影響種子本身的特性，同時也直接關系到下一代的正常生長發(fā)育[4-5]。目前針對米槁種子的研究主要集中在種子萌發(fā)率[6]、繁殖栽培[7]、營養(yǎng)成分[8]、脂肪酸質量分數(shù)[9]等方面，但是關于米槁種子發(fā)育特性的研究較少。米槁種子在自然及人工條件下存在萌發(fā)障礙，且種子產(chǎn)量具有大小年之分，小年的種子空殼率高、萌發(fā)率低，無法實現(xiàn)幼苗及時的補充，使米槁種群呈現(xiàn)出衰退趨勢[10]。已有研究表明，植物種子發(fā)育過程需要通過可溶性糖、淀粉、蛋白質等內含物質的變化以保證種子與胚胎的正常發(fā)育[11]，且激素和酶能有效調控植物種子的發(fā)育進程[12-13]。本試驗以米槁種子為材料，監(jiān)測種胚形態(tài)發(fā)育過程，分析其發(fā)育過程中的儲藏物質質量分數(shù)、酶活性及激素水平的動態(tài)變化，揭示種子發(fā)育過程中的生理特性指標的變化規(guī)律，為獲得優(yōu)質、高產(chǎn)的米槁種子提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用種子樣品于2019年6—10月份采集于貴州省望謨縣。選擇自然狀態(tài)下生長健康且無病蟲害的成年植株，進行掛牌標記。于結果之日起，在植株的中上部采集米槁果實，每個月取樣一次，每次取600顆果實，直至10月份果實成熟脫落，共取樣5次。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 種子發(fā)育形態(tài)及細胞結構測定

用游標卡尺(精確到0.01 mm)測量種子橫徑和縱徑，每個取樣期隨機測量50粒，求取平均值，并通過烘干法和稱質量法測量種子的含水率和質量。

為觀察種子發(fā)育過程細胞結構變化，采用石蠟切片方法進行。本次試驗選取6月、7月、8月、9月及10月份發(fā)育的種子作為研究對象，新鮮種子采樣后立即去殼并取出種仁，浸泡在甲醛冰醋酸酒精混合固定液(V(甲醛)∶V(冰醋酸)∶V(酒精)=5∶5∶90，其中酒精體積比為50%)，樣品經(jīng)不同濃度乙醇梯度脫水后浸蠟并包埋，制作切片后依次進行脫蠟和蕃紅-固綠染色，封片完成后置于奧林巴斯顯微鏡(CX41RF，Japan)下對種子細胞結構進行測量與拍照。

1.2.2 種子發(fā)育貯藏物質質量分數(shù)測定

種子內部可溶性糖質量分數(shù)、淀粉質量分數(shù)采用蒽酮比色法測定[14]，可溶性蛋白質量分數(shù)采用考馬斯亮藍-G250染色法測定[15]，脂肪測定儀(SZF-06C)測定脂肪質量分數(shù)。

1.2.3 種子發(fā)育酶活性測定

丙二醛(MDA)質量摩爾濃度采用硫代巴比妥酸法(TBA)測定[16]，超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍四唑法(NBT)測定[17]，過氧化物酶(POD)采用愈創(chuàng)木酚法測定[18]，過氧化氫酶(CAT)采用紫外分光光度法測定[19]。

1.2.4 種子發(fā)育激素質量分數(shù)測定

采用酶聯(lián)免疫試劑盒(ELISA kit)方法測定。稱取0.1 g米槁種子樣品，液氮中充分研磨，加入1 mL濃度為80%的甲醇提取液，于-20 ℃放置12 h；將冷藏放置后的樣品離心(4 ℃，8 000 r/min，20 min)取上清液；將上清液過C-18固相萃取柱，萃取后真空干燥保存?zhèn)溆?；上樣前的樣液加? mL的pH值7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)定容，混勻后于室溫放置30 min后，在溫度4 ℃的情況下，通過離心(8 000 r/min，15 min)分離，然后取上清液并于4 ℃暫時保存待用。試劑準備與具體操作步驟參照試劑盒使用說明進行，使用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，并根據(jù)吸光值計算樣品中脫落酸(ABA)、赤霉素(GA3)、生長素(IAA)、細胞分裂素(CTK)、乙烯(ETH)、油菜素甾醇(BR)、茉莉酸(JA)、水楊酸(SA)等內源激素的質量分數(shù)并及脫落酸與赤霉素的比值(ABA/GA3)和脫落酸與生長素的比例(ABA/IAA)。不同時期激素質量分數(shù)由生物公司協(xié)作完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，不同處理間的比較采用單因素方差分析及Duncan多重比較分析，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差(SD)表示，數(shù)據(jù)處理前先經(jīng)過反正弦轉換。圖片制作使用Origin 9.0和AI 17.0軟件進行繪制及處理。

2 結果與分析

2.1 米槁種子發(fā)育期胚形態(tài)及細胞結構變化

由圖1可知，種子發(fā)育至6月份時的種胚尚未形成，半透明的果膠狀組織被一層較薄的內果皮包裹，而內果皮木質化最先由種子尖端開始(圖1A)；7月份時，兩片白色子葉由種子尖端位置開始形成，果膠狀組織變得緊密，內果皮木質化程度增加，厚度也明顯增加(圖1B)；發(fā)育到8月份時，白色子葉占據(jù)了整個種子的約3/4，果膠狀組織結構明顯減少且更加致密，內果皮木質化程度和厚度進一步增加(圖1C)；9月份時，果膠狀組織完全消失，發(fā)育完整的子葉充滿了整個內果皮內部(圖1D)；至10月份果實成熟時(圖1F)，種子與9月相比，外部形態(tài)結構差異主要表現(xiàn)為內果皮木質化后硬度的增加和顏色的加深(由于含果實直接縱切效果不佳，種子10月份成熟結構用剝皮后的種胚代替)；此外，野外調查與種子解剖結構發(fā)現(xiàn)，發(fā)育過程中米槁種子確實存在種胚發(fā)育畸形或空殼等現(xiàn)象，如圖1E，雖然果實和種子內果皮能夠正常發(fā)育，但由于未受精，所以并未發(fā)現(xiàn)種胚的存在。

A為內果皮木質化;B、C為子葉由形成到膨大;D、E為成熟內果皮;F為種胚。

結合種子不同發(fā)育階段，對種胚形態(tài)變化進行細胞結構觀察，由圖2可以看出，6月份時胚尚未形成，細胞形態(tài)輪廓并不規(guī)則，主要由一些水分和溶解態(tài)養(yǎng)分組成(圖2A)；發(fā)育至7月份時細胞經(jīng)歷了快速分化過程，細胞開始變的緊密，種胚初步形成(圖2B)；8月份時種子經(jīng)過了快速的脫水過程，溶解態(tài)養(yǎng)分逐漸向非溶解態(tài)轉化，細胞內油體開始出現(xiàn)(圖2C)；隨著種胚的發(fā)育，細胞形態(tài)發(fā)育逐漸規(guī)則，且油體的數(shù)量迅速增加，可以明顯看到細胞充滿了密集的小油體(圖2D)；發(fā)育至10月份成熟時，種胚細胞排列變得更加緊密，隨著貯藏物質的進一步積累，細胞內較大顆粒的油體出現(xiàn)，并分布在一些小油體間(圖2E)。

A為不規(guī)則細胞;B為種胚形成;C、D、E為細胞內油體富集過程。

由表1可知，從6月份至10月份成熟階段，種子生長主要經(jīng)歷了大小變化、胚結構的形成與發(fā)育、質量的增加與脫水過程。其中，種子橫徑由最初的7.59 mm顯著增加到10.73 mm，種子縱徑由最初的7.16 mm顯著增加到9.73 mm，胚橫徑和胚縱徑分別顯著增加到10.41和9.46 mm；種子質量由197.94 mg·粒-1顯著增加到453.48 mg·粒-1。與其他指標相反，種子含水率在胚結構未形成時最高，含水率為92.35%，成熟時含水率為31.53%，而胚形成過程中也發(fā)現(xiàn)，發(fā)育至8月份時，種子含水率由7月份的86.39%迅速降至43.36%，隨后又呈現(xiàn)緩慢降低趨勢，說明8月份是種子發(fā)育過程的快速脫水階段。

表1 米槁種子發(fā)育指標動態(tài)變化

2.2 米槁種子發(fā)育過程貯藏物質的變化

由表2可知，在種子的發(fā)育過程中，貯藏物質呈現(xiàn)出一個累積狀態(tài)。6月份發(fā)育的種胚處于未成形階段，果膠狀組織含水量高，可溶性糖和淀粉質量分數(shù)較低；7月份種胚初步形成，可溶性糖與淀粉開始緩慢積累；隨著種胚逐漸發(fā)育完整，8—9月份是兩種貯藏物質的迅速積累期，發(fā)育到10月份種子成熟時，貯藏物質累積速度減緩；可溶性蛋白質量分數(shù)在6—8月發(fā)育階段迅速增加，9—10月種子發(fā)育成熟后增加幅度減小，完全成熟時，可溶性蛋白質質量分數(shù)達到4.84 mg/g；脂肪質量分數(shù)變化趨勢與可溶性糖和淀粉相似，表現(xiàn)為種胚發(fā)育初期緩慢增加，9月份發(fā)育完整時迅速積累，之后趨于平緩增加，種子成熟時脂肪質量分數(shù)由最初的0.57 mg/g增加到462.56 mg/g。

表2 米槁種子發(fā)育過程貯藏物質質量分數(shù)變化 mg·g-1

2.3 米槁種子發(fā)育過程酶活性的變化

由表3可知，在米槁種子發(fā)育過程中，MDA質量分數(shù)呈現(xiàn)出“上升-下降”的趨勢，種胚發(fā)育到8月份時，MDA質量摩爾濃度達到最高值(0.003 2 μmol/g)，在10月份種子發(fā)育成熟時MDA質量摩爾濃度降至最低(0.002 μmol/g)；當細胞脂膜結構受到傷害時，抗氧化系統(tǒng)迅速做出反應，其中SOD、CAT活性變化趨勢相同，種胚形成初期兩種酶活性迅速增加，至8月份時達到最大值，SOD、CAT活性分別為6 964.25 U/g和230.04 μ·g-1·min-1，種胚發(fā)育后期階段SOD和CAT活性持續(xù)下降；POD活性呈現(xiàn)出持續(xù)上升趨勢，在種胚形成初期(6—7月份)上升緩慢，7—8月份的上升幅度最大，在種子發(fā)育后期至成熟時POD活性均保持在較高的水平。

表3 米槁種子發(fā)育過程酶活性變化

2.4 米槁種子發(fā)育過程內源激素水平的變化

由表4可知，米槁種子發(fā)育受到了多種激素的共同調節(jié)。BR和SA質量分數(shù)呈“上升-下降-上升”的趨勢，在種子發(fā)育初期上升，種胚發(fā)育形成時其質量分數(shù)又開始下降，在8—10月份隨種子的快速發(fā)育而迅速增加，其中BR質量分數(shù)在種子成熟階段顯著高于發(fā)育初期，而SA雖然在發(fā)育后期有所增加，但成熟時SA質量分數(shù)仍低于種子發(fā)育初期；ABA、GA3、IAA、CTK、JA和ETH等6種激素質量分數(shù)隨種子發(fā)育整體呈現(xiàn)顯著增加趨勢，其中CTK質量分數(shù)在8月份時與7月份差異不顯著，ETH質量分數(shù)在種胚形成初期表現(xiàn)為緩慢增長，種子成熟時6種激素質量分數(shù)達到最大值；ABA/GA3比值隨種子發(fā)育呈現(xiàn)顯著增加趨勢，ABA/IAA比值在種子發(fā)育初期有所下降，隨后迅速增加，且ABA與GA3和IAA的比值均在種子發(fā)育成熟時達到最大值，分別是最初的1.36和1.23倍。

表4 米槁種子發(fā)育過程內源激素質量分數(shù)變化

發(fā)育階段水楊酸質量分數(shù)/ng·g-1乙烯質量分數(shù)/ng·g-1油菜素甾醇質量分數(shù)/ng·g-1ABA/GA3比值ABA/IAA比值6月份(49000.67±817.50)a(39976.95±1569.24)d(413.17±6.21)d(1.91±0.08)c (0.01900±0.00027)c7月份(50168.00±768.54)a(41710.07±667.95)d(483.08±10.88)b(2.00±1.12)bc(0.01800±0.00031)c8月份(37665.67±770.42)d(53043.97±839.59)c(459.17±6.95)c(2.13±0.06)b(0.01800±0.00048)c9月份(39127.67±367.45)c(62920.85±545.89)b(482.73±3.75)b(2.39±0.06)a(0.02000±0.00029)b10月份(42648.67±501.64)a(70466.67±1857.75)a(548.44±5.10)a(2.55±0.10)a(0.02300±0.00038)a

2.5 米槁種子發(fā)育相關性分析

由圖3可知，米槁種子及種胚發(fā)育大小、種子質量與可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白、脂肪質量分數(shù)呈極顯著正相關(P<0.01)，與含水量的變化呈現(xiàn)極顯著負相關(P<0.01)；種胚發(fā)育與抗氧化酶SOD、POD及CAT活性呈極顯著正相關(P<0.01)；種胚橫徑、縱徑、貯藏物質積累與ABA、GA3、IAA、CTK、ETH、BR、JA質量分數(shù)變化及ABA/GA3、ABA/IAA的比值呈極顯著正相關(P<0.01)，與SA呈極顯著負相關(P<0.01)。

DS為發(fā)育階段，Std為種子橫徑，Svd為種子縱徑，Etd為胚橫徑，Evd為胚縱徑，STKW為種子質量，MC為含水率，Starch為可溶性淀粉，SS為可溶性糖，SP為可溶性蛋白，Lipid為脂肪，MDA為丙二醛，SOD為超氧化物歧化酶，POD為過氧化物酶，CAT為過氧化氫酶，ABA為脫落酸，GA3為赤霉素，IAA為生長素，CTK為細胞分裂素，ETH為乙烯，BR為油菜素甾醇，JA為茉莉酸，SA為水楊酸，ABA/GA3為脫落酸與赤霉素的比值，ABA/IAA為脫落酸與生長素的比值。

3 討論與結論

種子在發(fā)育進程中，常伴隨著外形增大、質量增加、含水量下降等形態(tài)變化，研究證明米槁種子也遵循這一規(guī)律。在米槁種子發(fā)育過程中，含水量的變化明顯，在發(fā)育初期下降幅度較小，種胚形成階段快速下降。同時，種子發(fā)育需要經(jīng)歷一系列特定的生理過程，包括貯藏化合物的積累、酶類及激素的調節(jié)與代謝等[20-21]。米槁種子在整個發(fā)育過程中，貯藏化合物的質量分數(shù)整體上呈現(xiàn)出顯著增加趨勢，在種胚初步形成時期(6—7月份)，可溶性糖、淀粉和脂肪積累較慢，8—9月份種子形態(tài)逐漸形成，此時胚細胞處于快速地分裂與分化階段，可溶性糖、淀粉和脂肪的質量分數(shù)迅速增加，可溶性糖和淀粉的迅速積累為維持胚胎的正常發(fā)育提供必要的能量需求[13]，種子發(fā)育成熟階段，可溶性糖與淀粉質量分數(shù)的增加幅度變緩；可溶性蛋白質量分數(shù)在6—8月份急劇上升，這是由于種胚形成發(fā)育時內部代謝活動旺盛導致[22]，隨后一直保持在一個相對較高的水平，相關性分析也表明了貯藏物質積累與米槁種子發(fā)育呈極顯著正相關。另外，有文獻指出在種子發(fā)育過程中貯藏物質在積累的同時會被消耗，并參與種胚的生長及分化過程(例如銀杏種子(Ginkgobiloba)、扁穗雀麥種子(Bromuscartharticus)等[23-24])，而本次研究發(fā)現(xiàn)，米槁種子整個發(fā)育階段，貯藏物質均處于一個積累的過程，這可能是取樣時間點存在差異所導致，因此關于米槁種子發(fā)育過程貯藏物質在積累的同時是否也參與到種子代謝活動中，需要進行更深入的研究。

種子發(fā)育到成熟經(jīng)歷的自然脫水過程會導致細胞膜功能喪失和代謝紊亂，從而引起各種活性氧(ROS)的積累，ROS可以觸發(fā)有害的氧化過程，從而導致膜脂結構破裂和變性改變[25]，超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶是參與去除ROS的主要酶類，能夠維持細胞結構的完整，并有助于種子獲得脫水耐性[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，種子發(fā)育過程中膜脂過氧化產(chǎn)物在種胚形成初期開始上升，在8月份達到最大值，這一時期種子主要由含水量較高的果膠狀組織向胚結構發(fā)育轉變，受氧化作用的影響，SOD、POD和CAT等3種酶活性均表現(xiàn)為隨MDA質量摩爾濃度的上升而迅速增加，說明抗氧化系統(tǒng)能夠迅速做出氧化應激反應來及時清除體內的ROS，隨著種胚的不斷成熟，膜脂過氧化作用下降，MDA質量摩爾濃度逐漸減少，此時，SOD和CAT活性也有所降低，但POD一直穩(wěn)定維持在較高水平，這與桔梗(Platycodongrandiflorum)種子[4]和沙蔥(Alliummongolicum)種子[27]發(fā)育及脫水過程變化相似。另外，相關研究發(fā)現(xiàn)扇脈杓蘭(Cypripediumjaponicum)種子完全成熟時保護酶活性較低，由于細胞膜脂過氧化，直接導致種子敗育的主要原因[28]。米槁種子發(fā)育到成熟時期抗氧化酶均能夠保持相對較高的水平，且種子發(fā)育與SOD、POD和CAT活性呈極顯著正相關，這對胚胎順利完成生長發(fā)育具有重要意義，也是防止米槁種子敗育的重要保證。

內源激素作為重要的調控因子，參與調節(jié)種子整個生長發(fā)育過程。ABA能促進胚胎發(fā)育和調節(jié)種子膨大，同時參與成熟期種子脫水及貯藏蛋白合成等[29-30]。本研究結果顯示，米槁種胚發(fā)育初期，ABA質量分數(shù)開始增加并持續(xù)增加到種子發(fā)育完成，這與甘草(Glycyrrhizauralensis)種子和萵苣種子發(fā)育過程ABA變化趨勢相同，說明ABA在米槁種子胚形態(tài)的建成與胚成熟發(fā)育過程中發(fā)揮了關鍵作用[31-32]；GA3、IAA、CTK、ETH和BR質量分數(shù)整體上表現(xiàn)為上升趨勢，且各激素質量分數(shù)與種子、胚發(fā)育均呈極顯著正相關，說明種胚發(fā)育需要經(jīng)過大量的細胞分裂與增殖，而這些激素間存在協(xié)同作用，共同參與了米槁種胚形成與發(fā)育進程。早期的研究證實JA與SA主要參與植物發(fā)育和非生物脅迫下的防御響應[33]，但本研究發(fā)現(xiàn)，JA的質量分數(shù)較低，但發(fā)育過程呈現(xiàn)出持續(xù)增加趨勢，這是由兩個原因所導致：一是JA可能參與了種胚發(fā)育；二是可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白與脂肪質量分數(shù)均與JA呈極顯著正相關，說明JA質量分數(shù)的增加對于調控米槁種子內部碳水化合物的積累具有重要作用[34]；而SA質量分數(shù)在種胚發(fā)育的7月份和9—10月份增加，這是由于SA僅參與了米槁種胚初期形成與后期發(fā)育。然而，種子發(fā)育需要多種內源激素共同調節(jié)，種子早期ABA/GA3值低有利于種胚膨大生長，后期高有助于碳源積累，米槁種子ABA/GA3值的逐漸升高與激素調節(jié)種胚生長和貯藏物質的積累有關。另外，種子成熟時高濃度的ABA可能會引起種子休眠并抑制種子的萌發(fā)[35]。ABA/GA3和ABA/IAA的值隨著種子發(fā)育逐漸升高，并在成熟時達到最高值，這與扇脈杓蘭種子發(fā)育的變化相似[36]，說明成熟期較高濃度的內源ABA是引起米槁種胚初生休眠的原因之一。

綜合米槁種子發(fā)育過程中的形態(tài)和生理變化特性，種子發(fā)育與種子質量、貯藏物質(可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白、脂肪)質量分數(shù)、抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性、內源激素(ABA、GA3、IAA、CTK、ETH、BR、JA質量分數(shù)及ABA/GA3、ABA/IAA的比值)呈極顯著正相關，與含水量、SA質量分數(shù)呈極顯著負相關。