張曉林，張若晰，曾莞棋，孫宏濤，郝 昕，雷鳴雷，陸秀君

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)a.林學(xué)院,b.設(shè)施園藝教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,沈陽(yáng) 110161；2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所,北京 100091；3.朝陽(yáng)市森林病蟲害防治檢疫站,遼寧 朝陽(yáng) 122000）

天女木蘭（Magnolia sieboldiiK.Koch）木材可制作家具，花可提取芳香油，亦可入藥。花色美麗，具長(zhǎng)花梗，隨風(fēng)招展，為著名的庭園觀賞樹種，然而天女木蘭種子具有深度休眠的特性，為育苗工作帶來了較大困難。光是影響種子休眠與萌發(fā)的重要環(huán)境因子。按吸收光譜成分的不同可以將植物光受體分為5類：光敏色素（phytochrome）、向光素（phototropin）、[ZTL（zeitlupe）、FK-F1（flavin binding kelch repeat fbox 1）和LKP2（lov kelch protein 2）]基因家族、隱花色素（cryptochrome）和UVR8（UV resistance locus 8）。在這些光受體中，光敏色素主要調(diào)控種子萌發(fā)、幼苗光形態(tài)建成、避蔭性反應(yīng)、開花誘導(dǎo)和某些抗逆性反應(yīng)[1]。

光敏色素A（PHYA）是植物中唯一的遠(yuǎn)紅光受體，在種子萌發(fā)中起主要作用[2]，其蛋白具有兩種構(gòu)象，PHYA 經(jīng)過紅光照射后會(huì)由PHYA-Pr 形態(tài)（無生物活性）轉(zhuǎn)變成PHYA-Pfr 形態(tài)（有生物活性），遠(yuǎn)紅光照射后又會(huì)由PHYA-Pfr 形態(tài)變回PHYA-Pr 形態(tài)[3]。在細(xì)胞中，與PHYA 相互作用的蛋白有很多，屬于bHLH 家族轉(zhuǎn)錄因子的光敏色素互作因子PIFs（phytochromeinteracting factors）是其中之一[4]。在擬南芥中已經(jīng)鑒定出6 個(gè)bHLH 家族成員，分別編碼蛋白PIF1 和PIF3 到PIF7[5]，PHYA-Pfr 與PIF3 可以直接相互作用，促進(jìn)PIF3 磷酸化和泛素化降解，解除對(duì)光形態(tài)建成的抑制作用，參與調(diào)控種子萌發(fā)[6-9]。

目前紅光、遠(yuǎn)紅光對(duì)種子萌發(fā)的影響結(jié)論不一。禾本科植物如水稻[10]、小麥[11]的種子經(jīng)遠(yuǎn)紅光LED輻照后發(fā)芽率增長(zhǎng)。木本植物如杉木[12]，其種子為光不敏感種子，黑暗處理下萌發(fā)率最高，遠(yuǎn)紅光間斷處理（R-FRR）能夠相對(duì)促進(jìn)其萌發(fā)；色木槭、水曲柳萌發(fā)率在R-FR-R照射下達(dá)到最高[13]；紅松種子萌發(fā)率隨R/FR下降而明顯下降；在一定范圍內(nèi)低R/FR 抑制葉榕和雞嗉子榕的種子萌發(fā)[14]。本研究為探究紅光、遠(yuǎn)紅光對(duì)天女木蘭種子萌發(fā)的影響，從天女木蘭轉(zhuǎn)錄組中篩選到MsPHYA候選基因，分析其對(duì)光條件的響應(yīng)模式，初步預(yù)測(cè)其功能，完成MsPHYA蛋白的原核表達(dá)、純化及抗體制備，為天女木蘭種子休眠解除的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年10月在沈陽(yáng)市植物園（123.61E，41.77N）收集自然成熟落下的天女木蘭（Magnolia sieboldiiK.Koch）種子，選取飽滿的天女木蘭種子進(jìn)行浸泡，去除假種皮，用5‰的高錳酸鉀分別對(duì)種子和沙子消毒20min，邊消毒邊攪拌，用無菌水投洗至無色，并將浮在水面上劣質(zhì)種子濾掉，消毒好的種子在0℃環(huán)境下進(jìn)行沙藏，層積56d 后將沙藏后的種子分別平鋪于3 個(gè)墊有6 層無菌水潤(rùn)濕紗布的培養(yǎng)皿中，放于22℃無菌組培室中，分別在持續(xù)黑暗（對(duì)照）、遠(yuǎn)紅光（16h 光照/8h 黑暗）、紅光（16h 光照/8h 黑暗）條件下進(jìn)行萌發(fā)處理，并測(cè)定萌發(fā)率，在處理后7，11，16，32d 取樣，剝離種皮，液氮速凍后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。將取樣后剩余的萌發(fā)種子種植于基質(zhì)中，待其長(zhǎng)成小苗取其幼根、芽、第1真葉、幼莖、子葉、長(zhǎng)枝（成年樹枝，與種子同株）和第6真葉，用鋁箔紙包好，液氮速凍后-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 天女木蘭MsPHYA基因全長(zhǎng)cDNA的克隆 采用植物總RNA 提取試劑盒（天根）提取天女木蘭的總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，再用Nandrop 2000 進(jìn)一步檢測(cè)RNA 的濃度和純度。利用GoS‐criptTMReverse Transcription System 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以提取到的總RNA 為模板，Oligo（dT）15 為引物，合成第一鏈cDNA。在NCBI 網(wǎng)站上查找擬南芥AtPHYA基因序列，結(jié)合天女木蘭轉(zhuǎn)錄組信息數(shù)據(jù)（BioProjectNo.PRJNA545617 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/biopr oject/PRJNA545617），用Primer Premier 5軟件對(duì)MsPHYA基因ORF序列的特異性引物MsPHYA-F1、MsPHYA-R1（表1）進(jìn)行設(shè)計(jì)。

以天女木蘭種子cDNA 為模板，使用高保真酶Primer Star?HS（TaKaRa）對(duì)MsPHYA的ORF 序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：Primer Star?HS 25μL，cDNA 1μL，正、反向引物各1μL，ddH2O 22μL。擴(kuò)增程序：98℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，52～62℃退火15s（52～62℃是為摸索退火溫度而設(shè)計(jì)的溫度梯度，每2℃為1 個(gè)梯度，梯度溫度分別為52，54，56，58，60，62℃，72℃）延伸30s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。利用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0（TaKaRa）對(duì)目的基因條帶進(jìn)行回收與純化。在加A尾反應(yīng)后將回收純化的目的片段與克隆載體pMD 18-T（TaKaRa）連接，再通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（TaKa-Ra）。將轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布在（含50mg·L-1Amp）的LB固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落，利用引物Ms-PHYA-F2、MsPHYA-R2（表1）進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將陽(yáng)性克隆子送往Invitrogen公司測(cè)序進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

表1 試驗(yàn)所需引物序列Table 1 Primer sequences required for the experiment

1.2.2 天女木蘭MsPHYA蛋白的氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析 通過NCBI 基因庫(kù)下載MsPHYA 蛋白的同源氨基酸序列，DNAMAN進(jìn)行同源序列比對(duì)，分析天女木蘭MsPHYA蛋白保守區(qū)結(jié)構(gòu)域。

1.2.3 天女木蘭MsPHYA基因的表達(dá)分析 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)。用不同組織和不同時(shí)間點(diǎn)、不同光照處理下種子的cDNA 作為qRT-PCR 模板，60S rRNA 為內(nèi)參基因，每個(gè)處理樣品重復(fù)3次，使用儀器為德國(guó)耶拿QTOWER3G。反應(yīng)體系（20μL）：TB Green Premix Ex Taq II（Takara）10μL，MsPHYAF3、MsPHYA-R3（表1）各0.8μL，cDNA 2μL（使用前按1∶5 稀釋），滅菌水6.4μL。兩步法PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30s，1 個(gè)循環(huán)；95℃變性5s，60℃退火20s，40 個(gè)循環(huán)，溶解曲線程序（95℃0s，65℃15s，95℃0s）。采用2-△△Ct法對(duì)基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。MsPHYA在不同組織中的差異表達(dá)分析以干種子的Ct值的平均數(shù)設(shè)為1，光照差異表達(dá)以未做光照處理的干種子的Ct值平均數(shù)設(shè)為1。

1.2.4 不同光照處理下天女木蘭種子萌發(fā)率測(cè)定 以種子種皮裂開，胚根突破種皮作為判斷萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)。每個(gè)光照條件下各取100 粒天女木蘭種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，每天觀察種子的萌發(fā)情況。當(dāng)各光照處理下種子萌發(fā)率均超過50%時(shí)結(jié)束萌發(fā)觀測(cè)，計(jì)算萌發(fā)率。萌發(fā)率（%）=(n/N)×100（n為觀測(cè)結(jié)束時(shí)的最終萌發(fā)數(shù)，N為處理下的供萌發(fā)試驗(yàn)種子的總個(gè)數(shù)）。

1.2.5 天女木蘭MsPHYA基因的原核表達(dá)載體pGS-21T-MsPHYA構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá) 依據(jù)前期pGS-21T-Ms-PHYA測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的引物：MsPHYA-21T-F 和MsPHYA-28a-R（表1）。用BamHI，Bam和XhoI，Xho分別對(duì)pMD18-T-MsPHYA質(zhì)粒和pGS-21T 載體進(jìn)行雙酶切，切膠回收后的目的基因片段和載體片段經(jīng)T4 DNA Ligase（ProbeGene）22℃連接1h，得到重組質(zhì)粒，然后將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa）中，將轉(zhuǎn)化菌液均勻涂布在LB 固體培養(yǎng)基（含有0.1g·L-1Amp）上，37℃恒溫過夜培養(yǎng)，次日挑單菌落進(jìn)行菌落PCR和雙酶切驗(yàn)證，陽(yáng)性克隆送往上海生工公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序正確的重組載體命名為pGS-21T-MsPHYA。

將重組質(zhì)粒pGS-21T-MsPHYA轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)，接種LB液體培養(yǎng)基（含50mg·L-1Amp）中，37℃培養(yǎng)約4h，至OD600為0.6。取3個(gè)無菌離心管分別編號(hào)為0號(hào)、1號(hào)、2號(hào)。0號(hào)為對(duì)照，不加IPTG；1號(hào)、2號(hào)分別加入終濃度為5×10-3mmol·L-1的IPTG（Amersco），37℃誘導(dǎo)表達(dá)2h，將處理后的菌體蛋白樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。取1號(hào)菌800mL菌液培養(yǎng)，15℃誘導(dǎo)15h，用35mL冰浴的Buffer D（0.2mmol·L-1Tris-HCl，pH8.0；0.5mmol·L-1NaCl；0.1%Triton-100）重懸菌體細(xì)胞后超聲裂解（600～800W，30min），最后1000r·min-1離心15min，分別取上清和沉淀進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白表達(dá)形式。

1.2.6 天女木蘭MsPHYA重組蛋白的純化、復(fù)性與定量 將上述裂解后的菌液取上清過GST柱，用200mL Buffer E（0.2mmol·L-1Tris-HCl，pH8.0；2nol·L-1NaCl；0.1%TritonX-100）和15mLBuffer D（0.2mmol·L-1Tris-HCl，pH8.0；0.5mmol·L-1NaCl；0.1%Triton-100）洗滌GST柱，取適量Buffer C（0.5mmol·L-1Tris-HCl，pH8.0；0.1mmol·L-1GSH）過GST柱洗脫，獲得純化后的重組蛋白。將上述裂解后的沉淀用Buffer B（0.5mmol·L-1Tris，pH8.0；5mmol·L-1NaCl；2%TritonX-100；0.05mmol·L-1DTT）重懸，超聲洗滌3 遍，再用Buffer C（0.5mmol·L-1Tris，pH8.0；5mmol·L-1NaCl；0.05mmol·L-1DTT；0.02nol·L-1尿素）洗滌1遍，最后用Buffer D（0.5mmol·L-1Tris，pH8.0；5mmol·L-1NaCl；0.05mmol·L-1DTT；0.08nol·L-1尿素）溶解包涵體，離心取上清。將上清用稀釋復(fù)性Buffer（0.5mmol·L-1Tris；0.5mmol·L-1Na-Cl；5mmol·L-1L-Arginine；0.03mmol·L-1GSSG；0.01mmol·L-1GSH；0.01mmol·L-1DTT，pH8.0）稀釋復(fù)性48h。稀釋復(fù)性結(jié)束后透析至0.2mmol·L-1Tris 和0.5mmol·L-1NaCl（pH=8.0）中，16h 透析結(jié)束，離心取上清，濃縮后上清用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.2.7 抗體制備和Western blot分析 以處理好的蛋白PHYA 進(jìn)行BCA 蛋白濃度測(cè)定后，免疫2 只新西蘭白兔（2.0～2.5kg），皮下免疫每次400μg，10d 免疫1 次，免疫4 次。采血檢測(cè)，通過間接ELISA 方法確定抗血清針對(duì)PHYA 的效價(jià)，待效價(jià)大于1∶50000 進(jìn)行最終采血制備抗血清。Western blot 分析參照Z(yǔ)HANG 等的方法采用bio-radMini-PROTEAN?Tetra 電泳系統(tǒng)行聚丙烯酰氨凝膠電泳，分離膠濃度12.5%。一抗Anti-PHYA 抗體（1∶500），二抗anti-rabbit IgG（1∶5000）[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 天女木蘭MsPHYA基因克隆分析

以天女木蘭種子的cDNA 為模板，選用MsPHYA全長(zhǎng)引物，在退火溫度分別為52，54，56，58，60，62℃下進(jìn)行PCR 擴(kuò)增基因全長(zhǎng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明，退火溫度為52，54，56，58，60℃，在3000～5000bp 之間獲得條帶，轉(zhuǎn)錄組預(yù)測(cè)該基因全長(zhǎng)3393bp，初步判斷擴(kuò)增出的條帶為目的條帶，其中最佳退火溫度是56℃（圖1）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收與純化、克隆后進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。測(cè)序結(jié)果顯示該基因包含一個(gè)完整的ORF，長(zhǎng)度為3393bp，編碼1130個(gè)氨基酸。

圖1 MsPHYA基因全長(zhǎng)擴(kuò)增凝膠電泳檢測(cè)Figure 1 Full-length amplification of MsPHYA gene was detected by gel electrophoresis

2.2 天女木蘭MsPHYA蛋白的氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析

將天女木蘭（Magnolia sieboldii）與沉水樟（Cinnamomum micranthum）、番茄（Solanum lycopersicum）、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、可可樹（Theobroma cacao）、三葉通木（Akebia trifoliata）7 個(gè)物種氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)所有序列均具有PAS 結(jié)構(gòu)域、GAF 結(jié)構(gòu)域、Phytochrome Region 和His kinase結(jié)構(gòu)域，說明植物光敏色素蛋白的氨基酸序列具有較高保守性（圖2）。

2.3 天女木蘭MsPHYA及MsPIF3的表達(dá)模式

利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）的方法對(duì)MsPHYA基因、MsPIF3基因在不同光質(zhì)處理下的天女木蘭種子以及各組織器官中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，種子在響應(yīng)不同光質(zhì)的過程中MsPHYA基因的表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且在處理第7 天時(shí)，各光質(zhì)條件下MsPHYA表達(dá)量就已顯著增加，所有光質(zhì)條件下該基因相對(duì)表達(dá)量均在第11 天達(dá)到最高（p＜0.05）（圖3A、B 和C）。在天女木蘭幼根、芽、第1 真葉、幼莖中MsPHYA基因幾乎不表達(dá)，在種子、子葉、第6 真葉中表達(dá)量顯著高于其他組織，在長(zhǎng)枝中表達(dá)量最高（p＜0.05）（圖3D）。對(duì)MsPIF3進(jìn)行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)種子在響應(yīng)不同光質(zhì)的過程中MsPIF3基因的表達(dá)量也均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且第7天時(shí)，各光質(zhì)條件下MsPIF3表達(dá)量顯著增加，不論何種光質(zhì)條件下該基因相對(duì)表達(dá)量均在第11天時(shí)達(dá)到最高（p＜0.05）（圖3A、B和C），MsPIF3與MsPHYA表達(dá)趨勢(shì)一致。

圖2 不同物種PHYA氨基酸序列比對(duì)及功能結(jié)構(gòu)域分析Figure 2 Amino acid sequence alignment and functional domain analysis of PHYA in different species

2.4 不同光照處理對(duì)天女木蘭種子萌發(fā)的影響

天女木蘭種子光照處理6d后，種子迅速萌發(fā)，進(jìn)入萌發(fā)高峰期。6d后D（黑暗）和R（紅光）處理下的天女木蘭種子萌發(fā)率高于FR（遠(yuǎn)紅光）處理。在處理后第13天，R和FR處理下的天女木蘭種子萌發(fā)率趨于平穩(wěn)，D處理下的種子的萌發(fā)率明顯上升，到達(dá)第17天，各處理下的天女木蘭種子萌發(fā)率均到達(dá)50%。R和D處理下天女木蘭種子的萌發(fā)率非常相近且高于FR處理下的天女木蘭種子萌發(fā)率（圖4）。

2.5 天女木蘭MsPHYA重組質(zhì)粒pGS-21T-MsPHYA的誘導(dǎo)表達(dá)

獲得pGS-21T-MsPHYA重組載體后經(jīng)1.0%凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)條帶（圖5A），說明重組原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。加入終濃度為5×10-4mol·L-1的IPTG 誘導(dǎo)，37℃誘導(dǎo)2h后，經(jīng)12%SDS-PAGE 電泳檢測(cè)，其結(jié)果與未誘導(dǎo)的pGS-21T-MsPHYA重組菌相比，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的pGS-21T-MsPHYA重組菌蛋白分子量和理論分子量相當(dāng)（約125kDa）（圖5B）。

圖3 MsPHYA、MsPIF3基因相對(duì)表達(dá)量Figure 3 Relative expression levels of MsPHYA and MsPIF3 genes

圖4 不同光質(zhì)處理下天女木蘭種子的累計(jì)萌發(fā)率Figure 4 Cumulative germination rate of Magnolia sieboldii K. Koch seeds under different light quality treatments

圖5 MsPHYA菌檢陽(yáng)性PCR檢驗(yàn)（A）和pGS-21T-MsPHYA的SDS-PAGE電泳分析（B）Figure 5 PCR test for positive detection of amplified Ms-PHYA bacteria (A) and analysis of pGS-21T-MsPHYA fusion protein expression by SDS-PAGE (B)

2.6 天女木蘭MsPHYA重組蛋白的純化與抗體驗(yàn)證

將重組pGS-21T-MsPHYA放大培養(yǎng)15℃誘導(dǎo)15h，超聲波破碎細(xì)胞，SDS-PAGE電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MsPHYA重組蛋白主要以包涵體形式存在于沉淀中（圖6A），將沉淀溶解離心取上清，將上清用稀釋復(fù)性Buffer 對(duì)其進(jìn)行復(fù)性（圖6B），復(fù)性后目的蛋白處條帶清晰且無雜帶。純化后的蛋白可用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

利用重組MsPHYA 免疫兔，獲得MsPHYA 抗體。以天女木蘭種子為材料，利用MsPHYA 特異性抗體進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示在90kDa存在目標(biāo)條帶（圖7），Western blot檢測(cè)目標(biāo)條帶分子量與預(yù)測(cè)的分子量存在偏差，可能是由于預(yù)染marker是由標(biāo)準(zhǔn)蛋白與有色染料偶聯(lián)而成的，偶聯(lián)后的蛋白由于表面結(jié)構(gòu)的改變，影響其在SDS-PAGE中分離的線性，在ADAMS的研究中也有相似結(jié)果[15]。結(jié)果表明，抗體具有良好的特異性且制備成功，可用于天女木蘭種子中PHYA蛋白豐度的檢測(cè)，為揭示MsPHYA蛋白在種子休眠解除中的作用打下基礎(chǔ)。

圖6 SDS-PAGE電泳檢測(cè)超聲波破碎細(xì)胞（A）和MsPHYA重組蛋白的復(fù)性與定量（B）Figure 6 SDS-PAGE detection of ultrasonic-broken cells(A) and Renaturation and quantification of recombinant MsPHYA protein (B)

圖7 內(nèi)源MsPHYA蛋白抗體驗(yàn)證Figure 7 Verification of endogenous MsPHYA protein antibodies

3 討論與結(jié)論

光受體蛋白PHYA 屬于I 型光不穩(wěn)定型光敏色素，其表達(dá)直接影響光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，PHYA 在光信號(hào)介導(dǎo)種子休眠途徑中起主要調(diào)控的作用[16]。氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果顯示MsPHYA 蛋白具有PAS結(jié)構(gòu)域。PAS結(jié)構(gòu)域包含在許多信號(hào)蛋白中，其作用是信號(hào)傳導(dǎo)器，該結(jié)構(gòu)域由3 個(gè)包含該結(jié)構(gòu)域的蛋白命名：Per，周期晝夜蛋白；Arnt，芳基烴受體核運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白；Sim，專一蛋白[17]。PAS結(jié)構(gòu)域參與調(diào)控晝夜節(jié)律[18-19]，可以推測(cè)MsPHYA受光調(diào)控而參與節(jié)律調(diào)節(jié)，并被運(yùn)轉(zhuǎn)到細(xì)胞核中發(fā)揮功能。

不同植物種子的萌發(fā)對(duì)光質(zhì)的響應(yīng)不同。研究表明香果樹（Emmenopterys henryi）940nm 及850nm（遠(yuǎn)紅光）下無種子萌發(fā)[20]；波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光對(duì)紫莖澤蘭（Eupatorium adeuophorum）種子萌發(fā)有明顯促進(jìn)作用[21]；紅光能促進(jìn)麗江山慈菇（Iphigenia indices）種子[22]和毛菍（Melastoma sanguineum）種子[23]萌發(fā)而被遠(yuǎn)紅光抑制。本研究中萌發(fā)率測(cè)定結(jié)果表明遠(yuǎn)紅光處理下天女木蘭種子萌發(fā)率最低，與香果樹、紫莖澤蘭種子萌發(fā)規(guī)律相似。

為了探究MsPHYA在種子萌發(fā)時(shí)的作用，本研究對(duì)MsPHYA進(jìn)行了qRT-PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示遠(yuǎn)紅光處理7d 時(shí)MsPHYA表達(dá)量開始顯著增高（p＜0.05），說明遠(yuǎn)紅光能夠激活MsPHYA表達(dá)，但天女木蘭種子在遠(yuǎn)紅光下萌發(fā)率最低，說明休眠未被解除。推測(cè)MsPHYA下游應(yīng)有其他調(diào)控因子發(fā)揮作用。證據(jù)表明MsPIF3 恰能與MsPHYA-Pfr直接互作，故本研究繼續(xù)探討了MsPIF3基因與MsPHYA基因在同一時(shí)空下的表達(dá)模式，結(jié)果顯示MsPIF3表達(dá)量低于同時(shí)期MsPHYA表達(dá)量，MsPIF3表達(dá)量遲于MsPHYA表達(dá)量開始下降。紅光、遠(yuǎn)紅光和藍(lán)光均能誘導(dǎo)PHYA 進(jìn)入細(xì)胞核且過量PHYA 抑制FHY1/FHL 運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致PHYA 無法繼續(xù)進(jìn)入細(xì)胞核[2]。本研究發(fā)現(xiàn)MsPHYA接收遠(yuǎn)紅光后表達(dá)量先上升后下降，可以推測(cè)逐漸積累的MsPHYA-Pfr 抑制了FHY1/FHL運(yùn)轉(zhuǎn)蛋白的轉(zhuǎn)錄，MsPHYA-Pfr無法繼續(xù)進(jìn)入細(xì)胞核特異性結(jié)合MsPIF3，不能解除MsPIF3對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用[6,24-25]，導(dǎo)致遠(yuǎn)紅光種子的萌發(fā)率低于黑暗和紅光處理的種子萌發(fā)率的結(jié)果。綜上推測(cè)遠(yuǎn)紅光能夠激發(fā)MsPHYA表達(dá)，但不足以解除天女木蘭種子休眠，休眠解除至少部分受MsPIF3調(diào)控，且MsPIF3可能在MsPHYA下游對(duì)種子萌發(fā)起負(fù)調(diào)控作用。

綜上可知，MsPHYA 是天女木蘭種子萌發(fā)過程中重要的調(diào)控因子。本研究在克隆出MsPHYA基因并對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)的生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上初步探索了該基因的功能，獲得了純度較高的MsPHYA 蛋白并制備抗體，抗體特異性較好，可用于后續(xù)MsPHYA 蛋白豐度分析，同時(shí)推測(cè)MsPIF3在MsPHYA下游參與調(diào)控天女木蘭種子萌發(fā)。本研究有助于進(jìn)一步探究天女木蘭光受體蛋白MsPHYA 的功能，為揭示解除天女木蘭種子休眠分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。