李芳，陳紹基，譚純，梅四鵬，賈紅菓，周榮瓊

西南大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 402460

犬弓首蛔蟲Toxocaracanis是一種寄生在犬及犬科動(dòng)物小腸內(nèi)的寄生蟲，其感染性蟲卵或幼蟲是弓首蛔蟲病(Toxocariasis)的病原體[1]．弓首蛔蟲病是一種人獸共患寄生蟲病，人和其他哺乳動(dòng)物主要通過意外攝入含有T.canis感染性幼蟲或蟲卵的食物而感染[2]．作為非特異性宿主，人感染后感染性蟲卵可以在小腸內(nèi)發(fā)育成為L(zhǎng)2幼蟲，但不能發(fā)育為成蟲，L2幼蟲穿過宿主小腸壁黏膜，通過循環(huán)系統(tǒng)移行進(jìn)入機(jī)體肺臟、肝臟、肌肉和大腦等各種器官、組織中，造成器官和組織的損傷，引發(fā)宿主的免疫和炎癥反應(yīng)[3-4]，從而出現(xiàn)不同的臨床癥狀，如隱性弓首蛔蟲病(covert toxocariasis，CT)、神經(jīng)弓首蛔蟲病(neurological toxocariasis，NT)、內(nèi)臟幼蟲移行癥(visceral larva migrans，VLM)及眼睛幼蟲移行癥(ocular larve migrans，OLM)等[5-6]，嚴(yán)重危害人類的身體健康．

磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein，PEBP)是一個(gè)高度保守的多功能堿性胞質(zhì)蛋白，其表面具有一個(gè)狹窄的空腔，是重要的配體結(jié)合位點(diǎn)，可結(jié)合膜磷脂、核苷酸、三磷酸腺苷等多種物質(zhì)，參與維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、遷移和黏附等多種生物學(xué)功能[7-9]．在寄生蟲中，磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)可參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和信號(hào)傳導(dǎo)等．如寄生惡性瘧原蟲PEBP能促進(jìn)蟲體的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖等[10-11]；肝片吸蟲磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白通過與CD14受體進(jìn)行結(jié)合來抑制p38蛋白、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和應(yīng)激活化蛋白激酶(JNK)的磷酸化，從而抑制LPS誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，具有免疫調(diào)節(jié)特性[12]．犬弓首蛔蟲磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(Tc-PEPB)的研究未見報(bào)道，本研究通過克隆、鑒定Tc-pebp全長(zhǎng)基因，采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)犬弓首蛔蟲各組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄差異水平分析，以期為探討Tc-PEBP蛋白的功能奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 犬弓首蛔蟲樣本

犬弓首蛔蟲蟲體樣本采自西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院某患病犬．蟲體用37 ℃滅菌的生理鹽水洗滌去除雜質(zhì)后，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，將成熟的T.canis雌蟲卵巢進(jìn)行解剖，收集蟲卵，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4周后，蟲卵發(fā)育為L(zhǎng)2期幼蟲[13]．

1.1.2 主要試劑

DH5α、EasyPure?膠回收試劑盒購(gòu)自TransGen Biotech(全式金)公司；T-Vector pMD19(simple)、PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq DNA聚合酶均購(gòu)自TaKaRa公司；Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen(賽默飛)公司．

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的方法對(duì)雌、雄蟲進(jìn)行鑒定，解剖和分離雌、雄蟲的腸道，肌肉，體壁，生殖道等各個(gè)組織．取出液氮提前預(yù)冷研缽，分別加入雌、雄蟲體各組織和L2幼蟲，在液氮中充分研磨成粉末．取研磨好的粉末放入無(wú)RNA酶離心管中，使用傳統(tǒng)的Trizol法分別提取犬弓首蛔蟲成蟲、L2期幼蟲及各組織的RNA；采用Eppendorf核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)得到總RNA的濃度和純度．以提取的T.canis及各組織的總RNA為模板，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書來反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存．

1.2.2Tc-pebp基因的克隆及分析

(1)引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Tc-PEBP全長(zhǎng)基因序列(GenBank No：AAC46843.1)，用Primer Premier 6.0 和Primer-BLAST軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物并克隆其完整編碼序列．引物序列信息為F：5’-TTAGGCCTGCGATCGATAGAA-3’；5’-AAGATAGCTAGCGTCCGGATT-3’．引物序列送擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司(重慶)進(jìn)行合成．

(2)Tc-pebp基因的PCR擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄合成的T.canis成蟲及L2期幼蟲的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增．?dāng)U增體系為50 μL：上、下游引物(10 μM)各1 μL；Mg2+(25 mM)5 μL；10×PCR buffer(不含Mg2+)4.0 μL；dNTPs(2.5 mM)4 μL；模板(cDNA)2 μL；r×Taq酶(5 U/μL)1 μL；dd H2O 32.0 μL[14]．

PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 3 min，94 ℃ 40 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，擴(kuò)增產(chǎn)物置于4 ℃保存．

(3)克隆及測(cè)序

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，按照EasyPure?膠回收試劑盒說明書對(duì)目的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收．將回收得到的目的基因片段與pMD19-T(simple)載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中．在37 ℃ 220 r/min的條件下震蕩培養(yǎng)60～90 min，培養(yǎng)結(jié)束后使用“L”型涂菌棒涂布于LB/Amp+固體培養(yǎng)基上(含有X-Gal和IPTG)，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置30 min后倒置，過夜培養(yǎng)12～16 h．培養(yǎng)結(jié)束后，在平板上用接種環(huán)挑取單個(gè)白色菌落于含有900 μL LB/Amp+液體培養(yǎng)基的EP管中，在37 ℃ 220 r/min的搖床中過夜培養(yǎng)14～16 h．

(4)序列分析

重組菌液經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性菌液的，將其送至擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司(重慶)進(jìn)行測(cè)序．將測(cè)序結(jié)果通過生物大分子序列比對(duì)搜索工具(BLAST)進(jìn)行同源性比對(duì)；登錄美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站查找Tc-PEBP蛋白序列，并使用MAFFT，Clustal Omega和MUSCLE等軟件對(duì)Tc-pebp基因進(jìn)行多重序列比較，通過使用MEGA 7.0軟件中的鄰接法(Neighbour-joining，NJ法)來對(duì)Tc-PEBP蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的構(gòu)建，用Bootstrap對(duì)進(jìn)化樹的可靠性進(jìn)行分析，共1 000個(gè)重復(fù)；并使用蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)SMART、PORTER和I-TASSER等軟件預(yù)測(cè)Tc-PEBP蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域．

1.2.3Tc-pebp基因的組織表達(dá)分析

根據(jù)T.canis基因組數(shù)據(jù) (GenBank：AAC46843.1 )，用Primer Premier (Version 6.0 )軟件設(shè)計(jì)特異性引物并克隆其完整編碼序列，引物序列信息為F：5’-CGCATGTCAGTTGTACACAAA-3’，R：5’-GGTTAGGCCTGCGATCGATAGAA-3’．以18S 1：5’-AAAGGGCAGGGACGTAGTCAA-3’；18S 2：5’-AATTGTTGGTCTTCAACGAGGA-3’作為內(nèi)參基因[15]．引物序列由擎科興業(yè)生物技術(shù)有限公司(重慶)合成．

以雌、雄蟲的肌肉、體壁、腸道及生殖道等各組織的cDNA為模板，分別用Tc-PEBP和18S rRNA引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR．反應(yīng)體系為50 μL：包括25 μL的SYBR Premix Ex Taq I；4 μL的 cDNA；上、下游引物各 2.0 μL；17 μL的ddH2O．PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火32 s，共40個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析．

M：2 000 bp DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1.雄蟲；2.雌蟲；3.L2期幼蟲；4.陰性對(duì)照．圖1 Tc-pebp基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 Tc-pebp基因的克隆及鑒定

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，Tc-pebp在約800 bp處可見相應(yīng)條帶，與理論大小相符；陰性對(duì)照沒有條帶出現(xiàn)(圖1)．將測(cè)序獲得的堿基序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示Tc-pebp基因的完整編碼區(qū)序列為789 bp，該序列含有一個(gè)完整編碼區(qū)，共編碼262個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為2.6×104，功能結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示1～20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，第22～58位、第59～94位為2個(gè)重復(fù)的ShKT結(jié)構(gòu)域，第123～257位有PBP保守結(jié)構(gòu)域(圖2)．

圖2 Tc-PEBP蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

2.2 多重序列比對(duì)及種系發(fā)育分析

通過WormBase ParaSite[16]和GenBank檢索，將Tc-PEBP蛋白氨基酸序列與4個(gè)線蟲的PEBP蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)．這些序列分別是豬蛔蟲Ascarissuum(GenBank No.AEUI03000057.1)、貝拉中桿線蟲Mesorhabditisbelari(GenBank No.UZWA01000301.1)、秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans(GenBank No.NP_001300105.1)、異尖線蟲Anisakissimplex(GenBank No.UYRR01001265.1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)均具有PBP保守結(jié)構(gòu)域(圖3)．

圖3 Tc-PEBP蛋白氨基酸序列多重比對(duì)

將Tc-pebp編碼的氨基酸序列與通過WormBase ParaSite[16]和GenBank收錄的十二指腸鉤蟲Ancylostomaduodenale(GenBank No.KIH55180.1)、豬蛔蟲A.suum(GenBank No.AEUI03000057.1)、秀麗隱桿線蟲C.elegans(GenBank No.NP_001300105.1)、有齒食道口線蟲Oesophagostomumdentatum(GenBank No.KHJ93726.1)、貝拉中桿線蟲M.belari(GenBank No.UZWA01000301.1)、異尖線蟲A.simplex(GenBank No.UYRR01001265.1)、中華按蚊Anophelessinensis(GenBank No.KFB38652.1)、家蠅Muscadomestica(GenBank No.AFP60570.1 )、環(huán)紋背帶線蟲Teladorsagiacircumcincta(GenBank No.PIO76166.1)、致倦庫(kù)蚊Culexquinquefasciatus(GenBank No.EDS31592.1)、錫蘭鉤蟲Ancylostomaceylanicum(GenBank No.EPB80812.1)、毛首鞭形線蟲Trichuristrichiura(GenBank No.CDW52734.1)和豬鞭蟲Trichurissuis(GenBank No.KHJ46160.1)進(jìn)行多重序列比對(duì)并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tc-PEBP與貝拉中桿線蟲M.belari(GenBank No.PRJEB30104)形成一個(gè)單獨(dú)的分支，其進(jìn)化關(guān)系較近(圖4)．

圖4 Tc-pebp編碼氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

2.3 結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)

利用I-TASSER構(gòu)建Tc-PEBP蛋白的三維空間，其TM最高值為0.69±0.12，標(biāo)準(zhǔn)差為6.3±3.8?(圖5a)．根據(jù)I-TASSER顯示的空間結(jié)構(gòu)及功能注釋，發(fā)現(xiàn)Tc-PEBP蛋白的結(jié)合位點(diǎn)為D159，F(xiàn)162，R173，H175，S198，T199，P200，H207和Y209(圖5b)．酶活性位點(diǎn)為G129，A165和T241(圖5c)．基因本體論注釋表明Tc-PEBP蛋白的分子功能為結(jié)合磷脂酰乙醇胺(GO：0008429)，生物學(xué)過程為調(diào)控有絲分裂(GO：0045840)和蛋白磷酸化(GO：0001933)，細(xì)胞組分為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的必要組分(GO：0005791)．

圖5 Tc-PEBP蛋白的結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)

2.4 Tc-pebp的組織差異表達(dá)

使用18S rRNA引物作為內(nèi)參基因，對(duì)T.canis雌、雄蟲的肌肉、體壁、腸道及生殖道等各個(gè)組織中Tc-pebp基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在雌蟲的卵巢、輸卵管、子宮、體壁、腸道和肌肉中均檢測(cè)到Tc-pebp基因的表達(dá)，其中卵巢的轉(zhuǎn)錄水平最高，其次是輸卵管，肌肉最低(圖6a)；雄蟲的Tc-pebp基因在腸道中表達(dá)量最高，在貯精囊中轉(zhuǎn)錄水平較低(圖6b)．

圖6 犬弓首蛔蟲Tc-pebp組織差異表達(dá)分析

3 結(jié)語(yǔ)

磷脂酰乙醇結(jié)合蛋白(PEBP)在許多生理和病理過程中有著重要的作用．如在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，PEBP作為一種內(nèi)源性Raf-1激酶抑制蛋白，可通過抑制細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路的激活并與核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)上游信號(hào)分子進(jìn)行結(jié)合，從而參與細(xì)胞的增殖、遷移、分化和機(jī)體的免疫防御反應(yīng)等[17-19]．在植物體內(nèi)，PEBP蛋白能夠長(zhǎng)距離運(yùn)輸，在頂端分生組織中誘導(dǎo)植物的開花并調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育[20-22]．在昆蟲體內(nèi)，PEBP可抵御外界微生物的入侵，被證明與昆蟲的先天免疫防御有關(guān)[23]．

本研究發(fā)現(xiàn)，Tc-PEBP具有ShKT結(jié)構(gòu)域(ShKT domain)和PBP結(jié)構(gòu)域(PBP domain)(圖3)．ShKT結(jié)構(gòu)域由6個(gè)保守的半胱氨基酸(SXC)組成，能夠促進(jìn)其他分泌蛋白如黏蛋白的形成和聚合，參與寄生蟲的免疫逃避[24]．多重序列比對(duì)顯示，Tc-PEBP與豬蛔蟲A.suum、秀麗隱桿線蟲C.elegans、貝拉中桿線蟲M.belari、異尖線蟲A.simplex等均具有保守的PBP結(jié)構(gòu)域，但N，C末端的保守性較差，這可能與不同物種與小分子物質(zhì)結(jié)合有關(guān)[25]．PEBP可通過與膜結(jié)合對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[26]，而T.canis中PEBP的結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)顯示Tc-PEBP在脂質(zhì)運(yùn)輸中具有一定的作用，這為今后Tc-PEBP的功能研究奠定了基礎(chǔ)．

磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白在寄生蟲的生長(zhǎng)、繁殖和胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用．在秀麗隱桿線蟲中PEBP存在于蟲體的肌肉、體壁、陰道等部位，推測(cè)其參與早期蟲體的生長(zhǎng)發(fā)育及外陰形態(tài)的發(fā)生[27]．在曼氏血吸蟲中，磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白分布于雌蟲子宮、卵巢、輸卵管等部位，表明其與蟲體的發(fā)育繁殖有關(guān)[28]；在豬蛔蟲體內(nèi)，磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白存在于雌蟲的子宮、卵巢等生殖組織中，參與維持胚胎的穩(wěn)態(tài)發(fā)育[29-31]．在本試驗(yàn)中，qRT-PCR結(jié)果顯示雌蟲體內(nèi)Tc-pebp在卵巢中高量表達(dá)，說明Tc-pebp參與了T.canis雌蟲的繁殖過程．此外，在T.canis雌、雄蟲腸道中均檢測(cè)到Tc-pebp的表達(dá)．Gobert等[32]在日本血吸蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白也存在于成蟲腸道中，主要起攝取、運(yùn)輸宿主體內(nèi)脂質(zhì)的作用，而Tc-pebp是否參與對(duì)蟲體脂質(zhì)的攝取、運(yùn)輸過程，有待后續(xù)進(jìn)一步研究．