常君，姚小華，張亞波，任華東，張瀟丹，3，張成才，萬紅衛(wèi)

1.中國林業(yè)科學研究院 亞熱帶林業(yè)研究所，浙江 富陽 311400；2.南京林業(yè)大學 研究生院，南京 210037；3.西南大學 資源環(huán)境學院，重慶 400715；4.浙江省建德市林業(yè)局，浙江 建德 311600

薄殼山核桃(Caryaillinoensis)又名美國山核桃，為胡桃科(Julandaceae)山核桃屬(Carya)落葉喬木[1-4]，原產美國，引入我國已有百年之久，當前已在我國14個省(區(qū)、市)人工栽培．近年來，隨著薄殼山核桃在我國的快速發(fā)展，其病蟲害的發(fā)生也越來越引起相關學者的關注．黑斑病是我國近年來薄殼山核桃的主要病害之一，主要危害葉片、果實和嫩梢，該病不但影響當年結果數(shù)量和干果品質，而且顯著削弱樹勢．

國內外關于薄殼山核桃黑斑病的研究主要為局部地區(qū)黑斑病發(fā)生情況和致病菌研究，戚錢錢等[5]調查了浙江省杭州市、紹興市兩地的薄殼山核桃病蟲害發(fā)生情況，陳于等[6]調查了江蘇省常州市金壇地區(qū)11個薄殼山核桃主要推廣品種果實黑斑病發(fā)病情況，Shi等[7]發(fā)現(xiàn)并分離出薄殼山核桃黑斑病病原菌小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)，Zhang等[8]發(fā)現(xiàn)并分離出了薄殼山核桃黑斑病病原菌刺盤孢屬(Colletotrichumnymphaeae)．國內一些學者對甘薯(Dioscoreaesculenta)[9]、月季(Rosachinensis)[10]抗病和感病品種感染黑斑病后保護酶活性測定結果表明，黑斑病菌侵染后，高抗品種超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)活性顯著高于感病品種，抗黑斑病能力與這些酶活性呈正相關，這些酶活性的變化均能對植物病原物的入侵起抑制作用．伍利芬等[11]、王軍節(jié)等[12]分別研究發(fā)現(xiàn)了蘋果酸對蘋果(Malusdomestica)黑斑病和Harpin對蘋果梨(Pyrusbretchneideri)黑斑病的抑制作用，與接種后果實內PAL(苯丙氨酸酶)，PPO，POD等活性及酚類物質質量分數(shù)提高密切相關．張杼潤等[13]研究發(fā)現(xiàn)水楊酸比殼寡糖誘導杏(Armeniacavulgaris)果實抗黑斑病菌侵染的能力更強，與水楊酸誘導PAL，POD基因表達量的增加和酶活性增強密切相關．楊樹(PopulusL.)葉片接種黑斑病菌后，抗性品種過氧化物酶活性較感病品種明顯升高[14]，油桐(Verniciafordii)品種抗黑斑病性能與過氧化物酶活性等呈正相關[15]．關于薄殼山核桃對黑斑病的致病機理及抗性生理研究尚未見相關報道．

本研究對薄殼山核桃高抗、高感品種經松針刺盤孢菌(Colletotrichumfioriniae)侵染后葉片中酶活性和酚類物質質量分數(shù)進行跟蹤檢測，探討黑斑病病原菌侵染對薄殼山核桃酶活性和酚類物質的響應機制，以期為薄殼山核桃抗黑斑病品種選育提供理論參考．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

作者單位研究團隊在多年研究基礎上，初步明確了薄殼山核桃黑斑病致病菌主要有小孢擬盤多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)、葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)和尖孢炭疽菌(Colletotrichumacutatum)．通過隨機抽樣并對感病葉片和果實進行分離、純化和鑒定發(fā)現(xiàn)，小孢擬盤多毛孢和葡萄座腔菌兩種病菌分離比例較低，而膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌分離比例較高，初步推測炭疽菌是薄殼山核桃林間黑斑病的主要致病菌，并進一步從10種病原菌中篩選出炭疽菌松針刺盤孢菌為高毒致病菌．本試驗所用黑斑病病原菌為作者單位從薄殼山核桃病葉中分離的炭疽菌松針刺盤孢菌 PCJD179菌株，中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所保存．薄殼山核桃品種為高抗品種“Kanza”和高感品種“Mahan”[16]．

1.2 病原菌分生孢子的培養(yǎng)和接種

將分離純化后的松針刺盤孢菌病原菌轉接在PDA平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫箱內培養(yǎng)7 d后，用無菌水沖洗出孢子，配制成濃度為1×108個/mL的孢子懸浮液．

試驗于2019年8月下旬至9月上旬在中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所后山控溫大棚內進行，以“Kanza”和“Mahan”一年生容器苗為試驗材料；選取羽狀復葉從下往上數(shù)第4，5，6對葉片，用70%的酒精進行表面消毒處理后，再用無菌水將葉片沖洗干凈，在葉片中部位置，靠近葉片主脈處用消毒針刺穿，每點刺5針，均勻分布在5 mm距離內；用移液槍將已制備好的孢子懸浮液滴在刺穿處，待晾干后用無菌水將高溫滅菌脫脂棉蘸濕敷在羽狀復葉上；最后再套上自封袋進行保濕，2 d后去除自封袋和脫脂棉．每個品種侵染15株，隨機分成3組，每組5株，分別于侵染后第0 d，3 d，6 d，9 d，12 d和18 d進行取樣，每組的混合樣作為一個處理，重復3次進行各指標的測定．

1.3 指標測定方法

過氧化氫酶(CAT)活性測定使用南京建成生物工程研究所研發(fā)的試劑盒，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)活性測定均使用上海索橋生物科技有限公司研發(fā)的試劑盒，具體測定步驟參照各試劑盒使用說明書．采用分光光度法測定黃酮質量分數(shù)[17]；采用福林酚比色法測定總多酚質量分數(shù)[18]．

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel、DPS 18.1進行統(tǒng)計分析，采用LSD法多重比較．

2 結果與分析

2.1 抗感品種侵染后葉片形態(tài)變化

松針刺盤孢菌侵染后薄殼山核桃不同抗感品種葉片形態(tài)如圖1所示，兩個品種從侵染后第3 d開始，均出現(xiàn)黑斑狀病斑，隨著侵染時間的延長，兩個品種表現(xiàn)出不同的侵染形態(tài)．“Kanza”品種從侵染后第3 d出現(xiàn)病斑，一直到侵染后第18 d，其病斑大小等未見明顯變化，“Mahan”品種侵染后第6 d，病斑周圍葉片顏色泛黃，病斑開始變大，第15 d開始病斑明顯變大，一直持續(xù)到第18 d．

圖1 松針刺盤孢菌侵染后不同時期薄殼山核桃葉片形態(tài)變化

2.2 薄殼山核桃抗感品種SOD活性變化

雙因素方差分析結果表明，SOD活性在品種間和松針刺盤孢菌侵染后的不同時期均表現(xiàn)出較強的活性．松針刺盤孢菌侵染后“Kanza”品種SOD活性表現(xiàn)出“降—升—降—升—降”的趨勢，在侵染后的第6 d SOD活性達到最高，為902.20 U/g，隨后SOD活性不斷下降，在侵染后的第15 d又出現(xiàn)一個小的峰值，SOD活性為484.56 U/g；“Mahan”品種SOD活性從0～12 d一直表現(xiàn)出降低的趨勢，第12～15 d SOD活性有小幅提升，直到第18 d又略有降低．從第0～15 d，不論酶活性變化趨勢如何，“Kanza”品種SOD活性遠高于“Mahan”品種，直至第18 d兩個品種SOD活性相近(表1)．

表1 松針刺盤孢菌侵染對薄殼山核桃葉片不同指標的影響 U/g

2.3 薄殼山核桃抗感品種CAT活性變化

雙因素方差分析結果表明，品種間CAT活性差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)．松針刺盤孢菌侵染后葉片CAT活性在抗感品種間表現(xiàn)出不同的變化趨勢．高抗品種“Kanza”在黑斑病病原菌侵染后的第0～9 d CAT活性不斷降低，隨后的3 d有較大幅度提升，第12～15 d CAT活性又降低，從第15～18 d又大幅度提升至最高，表現(xiàn)為先降后升再降再升的變化過程；易感品種“Mahan”在侵染后從第0～6 d CAT活性不斷降低，第6～18 d表現(xiàn)出升降交替出現(xiàn)的規(guī)律，第18 d CAT活性降至最低(表1)．

2.4 薄殼山核桃抗感品種POD活性變化

雙因素方差分析結果表明，品種間POD活性差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)．松針刺盤孢菌侵染后兩個品種POD活性先是都表現(xiàn)出降低的趨勢，隨后又表現(xiàn)出升高的趨勢，“Kanza”品種POD活性從第3 d開始就表現(xiàn)出升高趨勢，并在第9 d POD活性超過“Mahan”品種，一直持續(xù)到第18 d，其活性一直遠高于“Mahan”品種，“Mahan”品種POD活性從第12 d開始表現(xiàn)出升高趨勢．松針刺盤孢菌侵染后“Kanza”品種POD活性具體表現(xiàn)出“降—升—降”的趨勢，從第0～3 d POD活性從19.43 U/g下降至10.88 U/g，第3～15 d POD活性不斷上升，第15 d達最高，為47.72 U/g，之后POD活性又有所降低，第18 d降至32.11 U/g；“Mahan”品種POD活性第0～12 d表現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，由32.03 U/g降至19.91 U/g，第12～18 d POD活性又略有升高，第18 d POD活性為23.70 U/g(表1)．

2.5 薄殼山核桃抗感品種PPO活性變化

雙因素方差分析結果表明，PPO活性在品種間表現(xiàn)出差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)．不同抗性薄殼山核桃品種PPO活性表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律．松針刺盤孢菌侵染后第3 d開始，“Kanza”品種PPO活性超過“Mahan”品種，并持續(xù)保持至第12 d，PPO活性始終高于“Mahan”品種，第15～18 d“Kanza”品種PPO活性又開始低于“Mahan”品種(表1)．

2.6 薄殼山核桃抗感品種總酚、黃酮質量分數(shù)變化

雙因素方差分析結果表明，總酚、黃酮質量分數(shù)在品種間和松針刺盤孢菌侵染后的不同時期均表現(xiàn)出差異．松針刺盤孢菌侵染后第0～15 d兩個品種黃酮質量分數(shù)均表現(xiàn)為“升—降—升”的變化規(guī)律，第15～18 d“Kanza”品種黃酮質量分數(shù)降低，而“Mahan”品種質量分數(shù)表現(xiàn)出微升的趨勢．總酚質量分數(shù)變化規(guī)律則不同，第0～3 d“Kanza”品種總酚質量分數(shù)略有下降，第3～6 d總酚質量分數(shù)顯著上升并出現(xiàn)第一個峰值，隨后第6～9 d總酚質量分數(shù)又表現(xiàn)為下降的趨勢，第9～15 d總酚質量分數(shù)又持續(xù)上升，并在第15 d出現(xiàn)第二個峰值，第15～18 d總酚質量分數(shù)又有所降低；第0～3 d“Mahan”品種總酚質量分數(shù)呈上升趨勢，并出現(xiàn)第一個峰值，第3～12 d總酚質量分數(shù)持續(xù)降低至最低，第12～15 d總酚質量分數(shù)又表現(xiàn)出顯著上升的趨勢，并在第15 d出現(xiàn)第二個峰值，第15～18 d總酚質量分數(shù)又有所降低．整個侵染期內，除第3 d“Mahan”品種總酚和黃酮質量分數(shù)高于“Kanza”品種外，其他時段“Kanza”品種總酚和黃酮質量分數(shù)不論表現(xiàn)出上升還是下降趨勢，均遠高于“Mahan”品種(表1)．

3 討論

SOD，POD和 CAT等共同組成植物體內的有效活性氧清除系統(tǒng)，在植物體內非生物脅迫抗氧化防御系統(tǒng)中起著重要作用[19-20]，它們在清除自由基過程中綜合作用，使植物能在非生物脅迫下減輕活性氧對植物自身的氧化傷害[19]．本試驗研究結果表明，松針刺盤孢菌侵染后SOD均快速應答，高抗品種“Kanza”SOD活性極顯著高于高感品種“Mahan”，其活性氧清除能力顯著高于高感品種，這也與楊漢波等[21]研究核桃(Juglansspp.)抗炭疽病菌和李芳樂等[22]研究東方百合(LiliumorientalHybrid)抗百合灰霉病的結果一致．對香蕉(MusananaLour.)[23]抗枯萎病、甘蔗(Saccharumspp．)[24]抗黑穗病和芒果(MangiferaindicaL.)[25]抗蒂腐病的研究中發(fā)現(xiàn)，病原菌的侵染，能夠不同程度地誘導過氧化物酶相關基因的表達，過氧化物酶活性升高，進而起到抵御病原菌侵染的作用．在對玉米(ZeamaysL.)[26]苯丙氨酸解氨酶家族基因(PAL)與抗紋枯病相關性研究中發(fā)現(xiàn)，在強致病力紋枯病菌誘導后，10個PAL基因的表達量均為高表達，以應對紋枯病菌的侵染，本試驗中高抗品種SOD活性高于高感品種，且差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)，是否像以上研究一樣與SOD相關基因高表達相關，值得繼續(xù)深入研究．松針刺盤孢菌侵染后POD和CAT活性在品種間未表現(xiàn)出差異有統(tǒng)計學意義，在侵染后不同時期表現(xiàn)出不同的差異，特別是侵染后的最后時期，高抗“Kanza”品種POD和CAT活性高于高感品種“Mahan”，且差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)，由此說明POD和CAT活性在不同抗性薄殼山核桃品種中存在不同程度的生理響應，以應對松針刺盤孢菌的侵染．PPO是一類與植物抗病性相關的末端氧化酶，可氧化酚類化合物，形成對病菌有更強毒性的醌類化合物[27-29]．本試驗研究結果表明，高抗“Kanza”品種PPO活性在侵染后前期不斷升高并超過高感“Mahan”品種，后期其活性又逐步降低，甚至低于高感“Mahan”品種；原因可能是“Kanza”品種高抗黑斑病的能力使得早期就抵御了松針刺盤孢菌的侵染，而“Mahan”品種因抗病能力弱，需保持較長時間的PPO活性增強體內酚類物質的氧化作用來進一步抑制病原菌的致病作用，這也佐證了“Kanza”品種較“Mahan”品種更抗?。?/p>

酚類和黃酮類物質作為非酶類化合物，在植物抗逆過程中同樣發(fā)揮著重要作用，酚類物質除以植保素的形式對植物起保護作用外，還表現(xiàn)為對病原物的毒害作用[29-31]，黃酮類化合物可以抑制多酚氧化酶、細胞色素氧化酶等的活性，進而影響植物的抗病性[31]．本文研究結果表明，整個侵染期內，除第6 d高抗品種“Kanza”總酚和黃酮質量分數(shù)略低于高感品種“Mahan”外，其他侵染期內不論其質量分數(shù)變化規(guī)律如何，高抗品種“Kanza”總酚和黃酮質量分數(shù)均遠高出高感品種“Mahan”．對甘薯[30]、短枝木麻黃[31]、大豆[32-33]等研究結果表明，總酚和黃酮質量分數(shù)可以作為鑒定高抗與否的指標之一．綜合本試驗總酚和黃酮研究結果，本研究認為總酚和黃酮質量分數(shù)也可以作為早期初步鑒定和選育抗黑斑病薄殼山核桃品種的參考指標之一，下一步應結合分子生物學手段，進行更加深入的研究．

4 結論

薄殼山核桃抵御黑斑病病原菌侵染是一個復雜的過程，有多種酶和非酶類化合物共同參與．黑斑病高毒致病菌松針刺盤孢菌侵染后不同抗性薄殼山核桃品種葉片的過氧化物酶活性及非酶類化合物質量分數(shù)變化均有不同程度的響應，以應對松針刺盤孢菌的侵染，其中SOD活性響應最為迅速，可能是最關鍵的防御松針刺盤孢菌侵染的活性氧清除物質．