王 娜，戴伶俐，烏云塔娜，秀 春，趙世華，達(dá)來(lái)寶力格

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.呼倫貝爾市新巴爾虎右旗動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 新巴爾虎右旗 021300；3.呼倫貝爾市新巴爾虎右旗農(nóng)牧業(yè)事業(yè)發(fā)展中心，內(nèi)蒙古 新巴爾虎右旗 021300）

羊口瘡（orf）是由羊口瘡病毒（orf virus，ORFV）引起的一種急性接觸性人畜共患傳染病，主要感染綿羊和山羊，羔羊的發(fā)病率可達(dá)到90%以上，且極易引起繼發(fā)感染或混合感染， 致使羔羊的死亡率升高，給養(yǎng)殖場(chǎng)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。 我國(guó)將該病列為三類動(dòng)物疫病之一［3］。 該病呈地區(qū)性流行，我國(guó)黑龍江、新疆、陜西、云南、江蘇、安徽等地均有羊口瘡疫情的報(bào)道［4-9］。

ORFV 屬于痘病毒科副痘病毒屬， 病毒粒子約為280 nm×170 nm， 常呈橢圓形， 偶呈球形、錐形，表面有囊膜包被。該病毒為DNA 雙鏈病毒，長(zhǎng)約140 kb，G+C 含量約64%， 包括16 個(gè)開放閱讀框，由130 個(gè)編碼基因組成。 在ORFV 基因組中，BamHⅠ酶切片段的B2L 基因是一個(gè)完整的閱讀框，全長(zhǎng)為1 137 bp，編碼42 kDa 蛋白，該蛋白是病毒囊膜的重要成分，能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，且是ORFV 的優(yōu)勢(shì)抗原之一， 可作為ORFV 分子生物學(xué)鑒定的靶基因。 為確定引起內(nèi)蒙古地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生疑似羊口瘡的病原， 筆者采集發(fā)病羊只的口鼻痂病料，采用常規(guī)病毒分離方法、電鏡觀察方法及分子生物學(xué)方法對(duì)分離到的疑似ORFV毒株進(jìn)行鑒定， 以期為該地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)控制羊口瘡的發(fā)生及流行提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 待檢病料

從內(nèi)蒙古呼和浩特市某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)采集疑似羊口瘡病羊的口鼻痂病料3 份， 從呼倫貝爾市某規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)采集疑似羊口瘡病羊的口鼻痂病料4 份，共7 份待檢病料。

1.1.2 細(xì)胞及疫苗

山羊皮膚成纖維細(xì)胞 （goat skin fibroblasts，GSFs）， 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫(kù)；羊口瘡弱病毒細(xì)胞凍干活疫苗， 購(gòu)自新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.3 主要試劑

DMEM 低糖培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、雙抗、DMSO，購(gòu)自北京索萊寶科技有限責(zé)任公司；病毒DNA 提取試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

高速離心機(jī)（型號(hào)：pico 17）、CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)：Thermo311），賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限責(zé)任公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋（型號(hào)：SH-WB-6GDN3），韓國(guó)三興有限責(zé)任公司產(chǎn)品；PCR 儀 （型號(hào)：ABI9902）、電泳儀（型號(hào)：HE99X）、全自動(dòng)凝膠成像儀（型號(hào)：Type T2A），美國(guó)伯樂有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病料樣本滅活

將采集的病料樣品置于56 ℃的恒溫水浴鍋中熱滅活30 min。

1.2.2 病毒分離

1.2.2.1 病料處理

采集病羊口鼻結(jié)痂并剪碎、研磨，加入5 倍體積的0.01 mol/L PBS 緩沖液， 加2 000 IU/mL 青鏈霉素，制成懸液。4 ℃過夜，3 000 r/min 離心10 min，上清液用0.45 μm 濾器過濾備用。

1.2.2.2 病毒分離培養(yǎng)

取病料上清液200 μL 接種于含有生長(zhǎng)良好GSFs 的96 孔板，37 ℃吸附2 h，期間搖動(dòng)3～6 次，吸附完畢棄去上清液， 每孔加入2 mL 的維持液，37 ℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 每天觀察細(xì)胞病變，當(dāng)80%細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，將細(xì)胞經(jīng)-80 ℃反復(fù)凍融3次，連續(xù)傳代3 次。

1.2.3 病毒鑒定

1.2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定

取分離毒株懸液3 000 r/min 離心20 min，取上清液，用1%磷鎢酸溶液進(jìn)行電鏡負(fù)染，觀察形態(tài)學(xué)特征。

1.2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

使用病毒DNA 提取試劑盒提取病毒基因組DNA， 操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。 根據(jù)NCBI 上ORFV 的免疫囊膜蛋白基因B2L 的編碼序列（登錄號(hào)：GU320351）， 利用Premier 5.0 生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物。 上游引物B2L（F）序列：5′-CGGGATCCATGTGGCCGTTCTCCTC-3′， 下游引物B2L（R）序列：5′-CCAAGCTTTTAATTTATTGGTTTGCAGAACT-3′，預(yù)期目的片段大小為1 137 bp。 PCR 擴(kuò)增體系為50 μL：mix 酶25 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，無(wú)酶水21 μL。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃70 s，30 次循環(huán)；72 ℃10 min。 陰性對(duì)照為正常GSFs 培養(yǎng)液， 陽(yáng)性對(duì)照為羊口瘡弱病毒細(xì)胞凍干活疫苗。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定后，低溫寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。 利用NCBI 的BLAST 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，利用MegAlign 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒分離結(jié)果

7 份病料接種于GSFs， 僅有3 份在培養(yǎng)2 d時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞病變，培養(yǎng)至4.5 d 時(shí)80%左右的細(xì)胞出現(xiàn)病變。接種陽(yáng)性病料的GSFs 出現(xiàn)圓縮、團(tuán)聚、間隙變大，最后拉網(wǎng)脫落（見圖1b），正常GSFs 未出現(xiàn)病變（見圖1a）。共分離到3 株疑似ORFV，分別命名為NM-ORFV-1 株、NM-ORFV-2 株、NMORFV-3 株。

圖1 正常GSFs 和接種陽(yáng)性病料后病變GSFs 形態(tài)

2.2 病毒電鏡觀察結(jié)果

病毒經(jīng)負(fù)染后在電鏡下觀察呈卵圓形 （見圖2a、圖2b），病毒粒子長(zhǎng)220～250 nm，寬125～200 nm， 符合ORFV 粒子的形態(tài)特征且與文獻(xiàn)描述的大小形態(tài)一致，因此，將其初步確定為ORFV。

圖2 NM-ORFV-1 株病毒粒子電鏡下形態(tài)

2.3 病毒分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

以病毒基因組DNA 為模板進(jìn)行B2L 基因PCR 擴(kuò)增，獲得1 137 bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物（見圖3），與預(yù)期大小一致。 陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，通過NCBI的BLAST 比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖4），并進(jìn)行同源性分析（見圖5）。 結(jié)果顯示，NM-ORFV-2 株與NM-ORFV-3 株遺傳關(guān)系密切，處于同一分支，且與ORFV KP336704（中國(guó)）分離株的親緣關(guān)系最近，同源性達(dá)到99.4%；NM-ORFV-1 株與NMORFV-3 株及NM-ORFV-2 株處于不同分支，NM-ORFV-1 株與NM-ORFV-3 株的同源性為99.0%，NM-ORFV-1 株與NM-ORFV-2 株的同源性為99.1%， 且NM-ORFV-1 株與JQ904789 （中國(guó)）疫苗株親緣關(guān)系最近，同源性為99.6%。

圖3 ORFV 分離株B2L 基因PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增電泳圖

圖4 基于B2L 基因序列的ORFV 分離株系統(tǒng)發(fā)育樹分析

圖5 基于B2L 基因序列的ORFV 分離株同源性分析

3 討論

羊口瘡在全球盛行，常呈群發(fā)性流行。該病雖然死亡率不高，但導(dǎo)致羊只生產(chǎn)性能降低，出欄減緩，給養(yǎng)羊業(yè)造成了一定經(jīng)濟(jì)損失。 同時(shí)，該病是人畜共患病，可以感染養(yǎng)殖人員，對(duì)人類健康造成危害。 目前該病尚無(wú)有效的治療藥物，因此，預(yù)防和早期診斷是至關(guān)重要的。

為了深入研究ORFV， 研究者選擇不同種類的原代細(xì)胞及細(xì)胞系分離ORFV。 最早發(fā)現(xiàn)原代羔羊睪丸細(xì)胞及羔羊腎細(xì)胞可用于ORFV 的增殖，之后發(fā)現(xiàn)犢牛睪丸原代細(xì)胞、羔羊真皮細(xì)胞及胎牛腎細(xì)胞等細(xì)胞系均可用于ORFV 的增殖［10-12］。多名學(xué)者使用HELA 細(xì)胞［13］、MDBK 細(xì)胞［14-16］、羊胚胎鼻上皮細(xì)胞［17-18］、羊睪丸細(xì)胞［19-21］、VERO 細(xì)胞［5，22］等成功分離到了ORFV。該研究使用VERO、MDBK、BHK21 細(xì)胞在前5 代盲傳中均未觀察到明顯病變， 在使用GSFs 接種后48 h 出現(xiàn)明顯病變，通過測(cè)序確認(rèn)了引起GSFs 病變的是目標(biāo)病毒ORFV。 這可能與不同毒株致病力的差異有關(guān)，某些樣本來(lái)源的毒株在傳代細(xì)胞上病變不明顯，不易被分離到， 而臨床樣本中的病毒更適應(yīng)羊源原代細(xì)胞［11］。

該研究分離到的3 株ORFV 病毒親緣關(guān)系密切，NM-ORFV-2 株與NM-ORFV-3 株處于同一分支， 同源性為100%；NM-ORFV-1 株與NMORFV-2 株及NM-ORFV-3 株處于不同分支，與二者的同源性大于等于99.0%。 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析提示， 該研究分離得到的ORFV 毒株可能是國(guó)內(nèi)的流行株，為ORFV 的后續(xù)研究提供了參考。