李文君，裴少非，鄒其虎，何 旎，婁嘉豪，曾廣智

(云南民族大學(xué) 民族醫(yī)藥學(xué)院，民族藥資源化學(xué)國(guó)家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500)

肝細(xì)胞癌(HCC)是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，在全球癌癥致死原因上男性排名第2，女性排名第6.過(guò)去的30年中，中國(guó)貢獻(xiàn)了超過(guò)一半的全球肝癌的新病例和死亡患者[1].了解肝癌的發(fā)病過(guò)程，建立與人類(lèi)肝癌發(fā)生機(jī)制相似的動(dòng)物模型意義重大，且能為肝癌的預(yù)防和治療提供重要的依據(jù)和策略[2-3].目前原位肝癌動(dòng)物模型主要采用化學(xué)誘導(dǎo)法，因其操作簡(jiǎn)單、成癌率高以及對(duì)肝臟專(zhuān)一等原因應(yīng)用較為廣泛，其中又以二乙基亞硝胺(DEN)為化學(xué)誘導(dǎo)劑最為常見(jiàn).DEN誘導(dǎo)原位肝癌效果較好，誘變經(jīng)歷了肝臟的中毒性炎癥-纖維化-硬化-癌變過(guò)程，與人類(lèi)發(fā)病十分相似，被廣泛用于構(gòu)建原位肝癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[3-6].DEN誘導(dǎo)發(fā)生肝癌與劑量及給藥時(shí)間關(guān)系密切，可通過(guò)多次給藥SD大鼠或C57BL/6小鼠而造成動(dòng)物肝癌模型.在此過(guò)程中大劑量給DEN能縮短造模時(shí)間，但容易造成中途動(dòng)物死亡率增加；小劑量給藥雖然降低了死亡率，但造模時(shí)間過(guò)長(zhǎng)且成瘤率降低，所以適合的給藥劑量是造成動(dòng)物原位肝癌模型的重要因素.

JAK2/STAT3信號(hào)通路是一條與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡、免疫調(diào)節(jié)等功能密切相關(guān)的信號(hào)途徑，在多種生理及病理過(guò)程中扮演了重要角色[7-10].JAK2與STAT3蛋白正常情況下都定位于細(xì)胞質(zhì)中，信號(hào)通路接受到外界應(yīng)激信號(hào)后，JAK2蛋白被激活，進(jìn)而激活STAT3蛋白，使其轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與特定的DNA序列結(jié)合，從而調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，引起多種生物學(xué)效應(yīng)[11].研究發(fā)現(xiàn)，JAK2/STAT3信號(hào)通路的持續(xù)性激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，JAK2和STAT3蛋白在多種癌細(xì)胞中異常表達(dá)，該通路的異?；罨芗铀倌[瘤細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)新生血管生成，并抑制癌細(xì)胞凋亡[12].為了建立適用于本實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物肝癌模型，文中采用DEN誘導(dǎo)C57BL/6小鼠，通過(guò)優(yōu)化給藥劑量，在20周內(nèi)造成了小鼠原位肝癌，并通過(guò)免疫組化技術(shù)探討了JAK2/STAT3通路在DEN誘導(dǎo)的小鼠原位肝癌過(guò)程中的變化情況，為我們后續(xù)關(guān)于JAK2/STAT3通路抑制劑對(duì)小鼠原位肝癌的治療作用研究打下了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

C57BL/6小鼠44只，年齡6～7周，體重(18±1)g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0004).將小鼠4只一籠，隨機(jī)分為給藥組(32只)和對(duì)照組(12只)，飼養(yǎng)于恒溫(22～23)℃、12 h明/12 h暗的SPF級(jí)動(dòng)物房，飼料為北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)，自由飲食，所有實(shí)驗(yàn)程序均符合云南民族大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的要求許可.

1.2 主要儀器及試劑

微孔板檢測(cè)器SpectraMax i3x型(Molecular Devices，美國(guó))；萊卡病理切片系統(tǒng)(Leica，德國(guó))；倒置顯微鏡DMi8型(Leica，德國(guó))；4 ℃ 冰箱(美菱，中國(guó))；低溫高速離心機(jī)5424R型(Eppendorff，德國(guó))；純水機(jī)(Millipore，美國(guó)).二乙基亞硝胺(TCI，日本)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)微板法測(cè)試盒(南京建成)；蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(索萊寶)；JAK2和STAT3一抗(Proteintech，美國(guó))；小鼠/兔聚合物法檢測(cè)系統(tǒng)通用試劑盒、DAB顯色試劑盒(中杉金橋).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 7 d 后，給藥組腹腔注射 50 mg/kg 的DEN對(duì)照組注射等量生理鹽水，2次/周(即1次/84 h)連續(xù)4周，4周后1次/周連續(xù)給藥16周，共計(jì)20周.期間密切觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物精神狀態(tài)、飲食狀況、被毛變化，同時(shí)記錄動(dòng)物體重?cái)?shù)據(jù).

1.4 樣本收集及病理檢測(cè)

分別在第2、4、6、8、10、12、14、16、18和20周處死給藥組小鼠2只和對(duì)照組小鼠1只，收集樣本.眼眶靜脈叢采血，室溫靜置 2 h，1 500 r/min 離心 20 min，吸取上清用于生化指標(biāo)檢測(cè).小鼠頸椎脫臼處死，解剖觀察肝臟大體形態(tài)并拍照，之后取小鼠肝臟于10%中性甲醛中固定，用于組織病理學(xué)檢查.組織固定后、脫水、常規(guī)石蠟包埋 4 μm 連續(xù)切片、HE染色、鏡下觀察肝臟病理改變.各組小鼠血清中ALT和AST采用微板法檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作.

1.5 免疫組化法檢測(cè)肝組織中JAK2和STAT3的表達(dá)

石蠟包埋的肝臟組織切片進(jìn)行脫蠟，水化，高溫高壓法抗原修復(fù) 2 min，過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，10%山羊血清封閉 1 h，JAK2及STAT3一抗(分別1∶2 000、1∶100稀釋)4 ℃ 孵育過(guò)夜，二抗室溫 20 min 孵育，DAB顯色 5 min，蘇木素染核 3 min，脫水，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡拍照分析.

2 結(jié)果

2.1 小鼠生理狀態(tài)觀察

44只小鼠在20周實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組無(wú)死亡，給藥組死亡8只，死亡時(shí)間主要發(fā)生在第12周后(第12周死亡1只，第15～16周每周1只，第17周2只，第18～20周每周1只).DEN給藥過(guò)程中給藥組小鼠隨著造模時(shí)間的增加出現(xiàn)不同程度的食欲和飲水下降，與對(duì)照組相比精神狀態(tài)差、對(duì)外部刺激不敏感、反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)雜亂無(wú)光澤且脫毛、體重增長(zhǎng)緩慢，后期出現(xiàn)體重下降等現(xiàn)象，而對(duì)照組生長(zhǎng)良好、無(wú)死亡情況、精神狀態(tài)佳、毛發(fā)光澤，體重增長(zhǎng)較快.

2.2 小鼠體重及血清生化指標(biāo)變化

DEN給藥前小鼠體重在(18±1)g，從第4周開(kāi)始，與對(duì)照組小鼠相比較，給藥組小鼠體重增長(zhǎng)緩慢且始終低于對(duì)照組，指標(biāo)如圖1所示.從第11周開(kāi)始，給藥組小鼠體重逐漸下降，在第12周到第16周下降較多.給藥組小鼠的ALT和AST酶活性相比于對(duì)照組顯著升高，從第10周開(kāi)始升高明顯，最高高于對(duì)照組20倍，表明給藥組小鼠肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷，從10周起具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P，<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.000 1).

圖1 對(duì)照組和給藥組小鼠20內(nèi)周體重變化情況及小鼠血清ALT和AST活力變化圖

2.3 小鼠肝臟形態(tài)及病理組織學(xué)變化

肉眼觀察可見(jiàn)：對(duì)照組小鼠給藥期間肝臟形態(tài)正常，顏色鮮紅，質(zhì)地柔軟表面光滑無(wú)異常.給藥組小鼠2～4周肝組織形狀、顏色、質(zhì)地正常，與對(duì)照組相比未見(jiàn)明顯異常表現(xiàn)；6～8周肝組織表面比較光滑(磨砂狀)，顏色變?yōu)榘导t，質(zhì)地較軟；10～12周肝組織表面逐漸變粗糙，出現(xiàn)粟粒狀小結(jié)節(jié)改變，質(zhì)地變硬；14～16周肝組織邊緣有小凸起物，表面粗糙且有少量出血點(diǎn)，顏色變?yōu)樽攸S色，質(zhì)地略硬，出現(xiàn)少量的透亮結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)呈顆粒狀(目測(cè)直徑小于 1 mm)；18～20周肝組織表面凹凸不平，較粗糙，有血斑和大小不等的多個(gè)白色結(jié)節(jié)結(jié)節(jié)大約 2 mm，質(zhì)地硬，切面可見(jiàn)出血壞死.

病理切片觀察可見(jiàn)：對(duì)照組小鼠2～20周肝組織中細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核明顯，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索由中央靜脈向四周整齊排列，肝血竇間隙正常，肝小葉及匯管區(qū)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)水腫或腫脹的肝細(xì)胞，未見(jiàn)壞死的肝細(xì)胞，無(wú)明顯纖維組織增生或纖維化.給藥組小鼠肝組織2～4周形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，與對(duì)照組相比差異不大.而第6周后給藥組小鼠肝組織出現(xiàn)明顯病變，其肝組織病理改變大概經(jīng)歷3個(gè)階段：(1)肝細(xì)胞損傷期，6～10周，局部肝細(xì)胞壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞腫大，并逐漸出現(xiàn)纖維組織增生，但肝小葉結(jié)構(gòu)仍完整；(2)肝細(xì)胞增生硬化期：12～16周，肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核都擠向細(xì)胞一側(cè).膽管和門(mén)管區(qū)有明顯的纖維組織增生，肝小葉包繞著肝細(xì)胞結(jié)節(jié)，形成典型的假小葉，中央靜脈缺失或偏離原來(lái)位置，肝索結(jié)構(gòu)變亂，并出現(xiàn)大量壞死的肝細(xì)胞和空泡狀的變化；(3)肝細(xì)胞成癌期：18～20周，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常，有明顯不典型增生，肝癌細(xì)胞呈多形性，胞核增大，胞質(zhì)少，排列成條索狀或巢狀，并向周?chē)８渭?xì)胞浸潤(rùn)生長(zhǎng)，部分區(qū)域可見(jiàn)出血壞死及炎細(xì)胞浸潤(rùn)，組織學(xué)類(lèi)型為肝細(xì)胞癌(見(jiàn)圖2).

圖2 小鼠肝臟HE染色結(jié)果圖(放大倍數(shù)200×)

2.4 JAK2蛋白和STAT3蛋白在肝組織中的表達(dá)的相關(guān)性

JAK2蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi).免疫組化染色結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠組織內(nèi)JAK2蛋白表達(dá)較弱，細(xì)胞質(zhì)著色淺(棕色)，20周內(nèi)幾乎無(wú)明顯變化；而DEN給藥組小鼠從第6周起，胞質(zhì)內(nèi)JAK2著色逐漸變深，表明隨著DEN給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠肝臟中JAK2蛋白表達(dá)水平逐漸增高，呈現(xiàn)明顯的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系.JAK2/STAT3信號(hào)通路的激活會(huì)導(dǎo)致STAT3蛋白的磷酸化并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，STAT3免疫組化染色會(huì)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核陽(yáng)性染色結(jié)果.結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肝臟組織內(nèi)STAT3蛋白表達(dá)在20周內(nèi)無(wú)明顯變化，而給藥組小鼠從第10周起開(kāi)始出現(xiàn)表達(dá)增加并呈現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)位入核，且隨著DEN給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，STAT3蛋白入核效應(yīng)增強(qiáng)，第20周時(shí)STAT3蛋白陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞核數(shù)量最明顯(見(jiàn)圖3).

圖3 免疫組化檢測(cè)JAK2和STAT3蛋白在肝細(xì)胞中的表達(dá)情況(放大倍數(shù)200×)(藍(lán)色標(biāo)記的是細(xì)胞核，棕色標(biāo)記的是目的蛋白)

3 討論

C57BL/6小鼠與人類(lèi)的遺傳物質(zhì)具有較高相似度，是研究多種人類(lèi)疾病的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物.考慮到小鼠成本較低、體重小、后期給藥量少，因此我們選用C57BL/6小鼠作為DEN誘導(dǎo)原位肝癌研究的模型動(dòng)物[13].合適的給藥劑量對(duì)造模時(shí)間及成癌率都至關(guān)重要，文獻(xiàn)報(bào)道，DEN腹腔注射造成小鼠原位肝癌的給藥劑量在20～90 mg/kg 不等，成瘤時(shí)間在16～42周不等[14-16]，考慮到劑量過(guò)大造容易成動(dòng)物中途死亡等因素，采用劑量為 50 mg/kg 的DEN腹腔注射C57BL/6小鼠，在第16周時(shí)小鼠出現(xiàn)癌前病變，第20周時(shí)形成肝癌.從病理切片觀察可見(jiàn)，應(yīng)用 50 mg/kg 的DEN對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行肝癌誘導(dǎo)，小鼠肝臟經(jīng)歷了肝炎、肝纖維化、肝硬化階段進(jìn)而形成肝癌，其癌變過(guò)程與人類(lèi)肝癌發(fā)生過(guò)程一致.期間給藥組小鼠共死亡8只，死亡率25%，在可接受范圍內(nèi).考慮到DEN作為一種N-亞硝基類(lèi)物質(zhì)，是遺傳毒性致癌物，其毒性較大，后期若用于作為抗肝癌藥物的活性評(píng)價(jià)模型時(shí)，給藥劑量可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求作微量調(diào)整.

ALT和AST存在于機(jī)體多種細(xì)胞中，其中肝細(xì)胞含量最多.當(dāng)肝細(xì)胞受損時(shí)，ALT和AST被大量釋放入血，導(dǎo)致血清中水平升高，故血清AST和ALT含量或酶活性變化對(duì)肝細(xì)胞損傷程度有一定的參考價(jià)值[17].小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，DEN給藥小鼠ALT和AST酶活性從第10周起呈現(xiàn)明顯升高(P<0.05)，表明隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，DEN導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)越來(lái)越嚴(yán)重的損害，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[18].JAK2是Janus激酶家族成員，參與JAK2-STAT3信號(hào)通路，介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的信號(hào)傳導(dǎo)，在細(xì)胞增殖、分化等活動(dòng)中起重要作用.正常細(xì)胞中JAK2/STAT3通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)快速且短暫，但在受損和病變的細(xì)胞中該通路會(huì)呈持續(xù)過(guò)度的激活狀態(tài)[19].小鼠肝臟組織中JAK2和STAT3蛋白的免疫組化研究結(jié)果表明，DEN給藥造成了小鼠肝臟中JAK2和STAT3蛋白表達(dá)量的顯著增高，且隨著給藥時(shí)間的增加表達(dá)量也逐漸增多，且STAT3出現(xiàn)明顯的核轉(zhuǎn)位表達(dá)，表明隨著肝細(xì)胞的病變，JAK2/STAT3信號(hào)通路逐漸被激活，參與并促進(jìn)了小鼠肝臟炎癥和腫瘤的發(fā)生.由于JAK2/STAT3信號(hào)在DEN誘導(dǎo)小鼠肝癌中的重要作用，其信號(hào)的異常表達(dá)有助于將其作為生物標(biāo)志物對(duì)肝細(xì)胞癌的病程及進(jìn)展進(jìn)行判斷.本研究為DEN誘導(dǎo)的小鼠原位肝癌模型研究提供了理論支持，也能為后續(xù)關(guān)于JAK2/STAT3信號(hào)通路抑制劑對(duì)小鼠原位肝癌的治療作用研究提供指導(dǎo).