于娜，陳曉蓉，石亞亮，牛娟，陳靜，鐘意成，陳建華，孟超敏*，欒明寶*

（1.河南科技大學農(nóng)學院，河南 洛陽 471000；（2.中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部麻類生物學與加工重點實驗室，湖南 長沙 410205；（3.江西省麻類研究所，江西，宜春 336000）

驅(qū)動蛋白（Kinesin）屬于馬達蛋白的一種，參與生物體的生命活動過程［1-4］。該家族基因包含由兩個頭部構(gòu)成的馬達結(jié)構(gòu)域（motor domain），其上具有ATP結(jié)合位點和微管結(jié)合位點［5］，驅(qū)動蛋白的頭部依附在微管上，利用ATP水解釋放的能量來驅(qū)動自身及其攜帶的貨物分子運動。莖部主要由纏繞螺旋結(jié)構(gòu)（coiled coil）構(gòu)成，對驅(qū)動蛋白的運動方向或活動調(diào)節(jié)等特性至關(guān)重要［6］。尾部與包含貨物的囊泡等膜性細胞器相連接［7］。

驅(qū)動蛋白是一類蛋白質(zhì)超級家族，在動物、植物、人和真菌等生物體中普遍存在［8-10］。1985年從魷魚的軸突細胞中首次發(fā)現(xiàn)了驅(qū)動蛋白，隨后被廣泛研究［11-12］，伴隨基因組測序技術(shù)的普遍應(yīng)用，相繼從人［8］、小鼠［13］、擬南芥［14］、水稻［15］、毛果楊［16］、秀麗隱桿線蟲［16］、釀酒酵母［16］等生物體中鑒定出來。Kinesin蛋白沿微管運輸細胞貨物，并調(diào)控微管的生長和穩(wěn)定性，在細胞分裂、細胞伸長和細胞器的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運等細胞生物學過程發(fā)揮重要作用［17-18］。擬南芥AtFRA1，主要參與纖維素微纖絲的定向沉積［19］。Kinesin-like-鈣調(diào)素結(jié)合蛋白通過直接與皮質(zhì)微管相互作用，在棉纖維發(fā)育過程中對皮層微管的重組發(fā)揮作用［20］。新型驅(qū)動蛋白KCH1，在棉纖維中以點狀方式修飾皮層微管，其可能在介導棉纖維中微管和肌動蛋白微絲之間的動態(tài)相互作用中發(fā)揮作用，進而影響棉花纖維細胞的發(fā)育［21］。GhKCH2是一種植物特異性微管依賴性運動蛋白，不僅與微管相互作用，且與微絲強結(jié)合，與兩種細胞骨架元素相互作用，在棉纖維發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用［22］。

苧麻是麻類作物中纖維性狀最優(yōu)良的韌皮纖維作物之一，是重要的紡織工業(yè)原料。研究苧麻kinesin基因?qū)τ诮沂卷g皮纖維發(fā)育分子機制，提高苧麻產(chǎn)量和品質(zhì)等具有重要意義。本研究基于苧麻基因組數(shù)據(jù)，通過生物信息學方法，在苧麻中鑒定kinesin家族基因，并對其基本理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、順式作用元件和表達進行了分析，為進一步研究苧麻kinesin基因的功能和纖維發(fā)育分子機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為成熟期苧麻品種“中苧1號”，取自國家種質(zhì)麻類資源圃。參照Xie等［23］的方法并略加修改，對苧麻的頂端莖皮（TOP）、非完全伸長節(jié)間（ER）和完全伸長節(jié)間（FER）進行區(qū)分和收集。樣品立即在液氮中冷凍，并儲存在-80℃冰箱備用。

1.2 苧麻kinesin基因家族的鑒定

通過SRAtoolkit軟件下載登錄號為SRR9112643-SRR9112651的SRA數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)是包含3個生物學重復的苧麻3個不同部位RNA-seq原始數(shù)據(jù)［23］。從Pfam數(shù)據(jù)（http：//www.pfam.org/）中下載kinesin家族蛋白序列的隱馬爾科夫模型文件（HMM，PF00225），使用HMMER3.0軟件將kinesin HMM文件與本地蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對，搜索含有kinesin蛋白保守結(jié)構(gòu)域的蛋白及核酸序列，篩選出kinesin基因家族成員。利用在線網(wǎng)站ExPaSy（http：//www.expasy.org/tools/）預測苧麻kinesin蛋白的氨基酸數(shù)（aa）、分子量（MW）和等電點（PI），基于pLoc-mPlant在線預測苧麻kinesin蛋白序列的亞細胞定位。

1.3 BnKIN基因系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

從Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫下載擬南芥和水稻的kinesin家族基因蛋白質(zhì)序列，使用分析軟件MEGA7的ClustalW程序?qū)inesin蛋白進行多重序列比對，采用鄰接法（NJ，Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，校驗參數(shù)Bootstrap重復500次。

1.4 BnKIN基因的結(jié)構(gòu)及蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

通過TBtools軟件確定苧麻kinesin家族基因內(nèi)含子與外顯子的結(jié)構(gòu)，并繪制基因結(jié)構(gòu)圖。利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）軟件在線分析苧麻的 kinesin蛋白結(jié)構(gòu)域，并利用TBtools軟件可視化結(jié)果。

1.5 BnKIN家族基因啟動子區(qū)順式作用元件分析

選取BnKIN基因轉(zhuǎn)錄起始位置上游2.5 kb作為啟動子區(qū)段，利用在線分析網(wǎng)站PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析BnKIN基因啟動子順式作用元件，并利用TBtools軟件繪制啟動子中順式調(diào)控元件圖。

1.6 BnKIN家族基因GO富集分析

通過在線軟件 PANNZER（Protein ANNotation with Z-scoRE）（http：//ekhidna2.biocenter.helsinki.fi/sanspanz/）對BnKIN進行基因本體分析，利用TBtools將預測結(jié)果進行可視化。

1.7 BnKIN基因家族表達分析

利用Xie等［23］測序完成中苧1號苧麻3個不同發(fā)育部位莖皮轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，獲得BnKIN家族基因的FPKM值（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragmentsmapped），通過TBtools軟件對FPKM值進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換并制作表達熱圖。

1.8 RNA的提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄

使用艾德萊EASYspin Plus Plant RNA Kit試劑盒提取苧麻莖皮RNA，于Thermo Scientific NanoDrop 2000和瓊脂糖凝膠電泳進行RNA濃度和質(zhì)量檢測，檢測合格后儲存在 -80℃冰箱備用。利用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成cDNA第一條鏈，新合成的cDNA用ddH2O稀釋一倍，并保存于-20℃冰箱備用。

1.9 熒光定量PCR（qRT-PCR）分析

根據(jù)BnKIN家族基因序列，利用Premier 5.0軟件設(shè)計特異性結(jié)合引物（表1），以苧麻18S基因作為內(nèi)參基因，使用Vazyme公司的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑，于BIO-RAD CFX96實時熒光定量PCR儀，進行RT-qPCR擴增。反應(yīng)體系：cDNA模板0.75μL，上下游引物各0.75μL，SYBR Mix 5μL，ddH2O 3.5μL，充分混勻后瞬時離心。反應(yīng)程序：95℃ 3min；95℃ 30 s，60℃30 s，信號采集，40個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后分析熔解曲線。每個樣品設(shè)置3個重復處理，使用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量。

表1 用于RT-qPCR分析的BnKIN基因和18S基因的引物列表Table 1 The primer of BnKIN gene and 18S gene for qRT-PCR analysis

續(xù)表1

2 結(jié)果與分析

2.1 苧麻kinesin基因家族的鑒定及理化性質(zhì)與亞細胞定位分析

通過HMMER3.0程序，檢索苧麻蛋白組數(shù)據(jù)中的BnKIN基因家族成員，經(jīng)過Pfam保守結(jié)構(gòu)域檢測，共鑒定出57個基因家族成員。根據(jù)苧麻基因組蛋白數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果，對基因家族成員進行命名。對其蛋白理化性質(zhì)進行分析發(fā)現(xiàn)，苧麻kinesin蛋白的分子量分布范圍在15 893.8 Da（BnKIN-7O_2）～325 534.9 Da（BnKIN-12D），氨基酸在142～2857 aa之間，理論等電點范圍在4.79（BnKIN-12C）～10.44（BnKIN-8A），其中理論等電點小于7的蛋白占61%。亞細胞定位預測結(jié)果顯示，35個蛋白位于細胞核，3個蛋白位于細胞質(zhì)。此外，19種蛋白質(zhì)位于細胞核和細胞質(zhì)，表明他們可能具有特定的生物功能。

表2 苧麻kinesin家族蛋白理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of physicochemical properties of BnKIN family

續(xù)表2

2.2 苧麻BnKIN家族系統(tǒng)進化分析

在前人［24-26］構(gòu)建kinesin系統(tǒng)進化樹基礎(chǔ)上，根據(jù)61個擬南芥、52個水稻和57個苧麻的kinesin蛋白序列，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示，苧麻kinesin家族基因被分成13個類群，其中由于個別亞家族的親緣關(guān)系較遠，BnKIN-14亞族基因被分為3個類群，BnKIN-12亞族基因被分為2個類群，在同組內(nèi)同一個系統(tǒng)進化樹分支中的亞族成員具有高度相似的基因結(jié)構(gòu)。13個類群均包含來自擬南芥、水稻和苧麻的kinesin家族基因，且苧麻與水稻和擬南芥的kinesin家族基因大多數(shù)聚集在一起，說明該家族在進化的過程中具有一定的保守性。

圖1 苧麻、擬南芥和水稻的kinesin家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of kinesin familymembers among Boehmeria nivea，Arabidopsis thaliana，and Oryza sativa

2.3 BnKIN基因的結(jié)構(gòu)及蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)kinesin基因結(jié)構(gòu)特點，將鑒定出的57個BnKIN家族基因分為9個亞族，進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析。結(jié)果顯示，同一亞族的BnKIN基因的保守結(jié)構(gòu)域具有相似性。57個苧麻kinesin基因均具有一個高度保守的kinesin結(jié)構(gòu)域（KISC），44個苧麻kinesin基因具有α-螺旋組成的卷曲的螺旋結(jié)構(gòu)域（α-helical coiled-coil domain），8個BnKIN-14亞家族的基因（BnKIN-14L_1、BnKIN-14L_2、BnKIN-14J、BnKIN-14F、BnKIN-14I_1、BnKIN-14I_2、BnKIN-14I_3和BnKIN-14I_4）具有CH結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可能使BnKIN基因具備特殊的生物學功能［9-10］?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示：BnKIN家族基因具有3～42個外顯子，BnKIN-12E的外顯子的個數(shù)最多，且其內(nèi)含子/外顯子區(qū)與非編碼區(qū)長于其他基因；BnKIN-12D的coiled-coil蛋白保守結(jié)構(gòu)域最多，表明BnKIN-12亞家族的基因成員具有較多的結(jié)構(gòu)域，可能具有復雜的生物學功能；BnKIN-7O_2的外顯子個數(shù)最少，且其內(nèi)含子/外顯子區(qū)與非編碼區(qū)也短于其他基因。

2.4 BnKIN家族基因啟動子區(qū)順式作用元件分析

圖2 BnKIN的蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Conservative domain of BnKIN proteins

為探究苧麻kinesin家族基因功能，對BnKIN啟動子區(qū)進行順式作用元件預測。結(jié)果顯示：BnKIN基因家族成員啟動子區(qū)含有大量順式作用元件，可分為激素類、生物和非生物脅迫類和光響應(yīng)類。響應(yīng)激素信號的順式作用元件中，主要含有：茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、赤霉素（gibberellin，GA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、生長素（auxin，IAA）、水楊酸（salicylic acid，SA）。此外，還發(fā)現(xiàn)了4個與MYB轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的順式作用元件。57個BnKIN基因均含有與植物激素有關(guān)的順式作用元件，47個BnKIN家族基因具有MYB轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的順式作用元件。

2.5 BnKIN家族基因GO富集分析

對苧麻kinesin家族基因進行GO富集分析，了解其在苧麻纖維發(fā)育過程中的作用，結(jié)果顯示差異表達基因的功能包含18個生物過程（GO：0008150）、15個細胞組分（GO：0005575）和5個分子功能（GO：0003674）。在分子功能中全部kinesin基因具有催化活性和結(jié)合功能，少數(shù)具有結(jié)構(gòu)分子活性等。在生物過程類別中，kinesin基因主要參與生物調(diào)節(jié)、細胞進程、發(fā)育進程、信號轉(zhuǎn)導及運動等；部分kinesin基因還參與了代謝過程、反應(yīng)及生長等。在細胞組成類別中，全部kinesin基因是細胞、膜及細胞器等組分。

2.6 BnKINs基因家族表達分析

隨著苧麻的生長，韌皮部組織纖維也處于不同發(fā)育和成熟階段，完全伸長節(jié)間（FER）韌皮部組織的纖維發(fā)育成熟程度最高，非完全伸長節(jié)間（ER）次之，頂端莖皮部（TOP）最弱。根據(jù)Xie等獲得的［23］中苧1號苧麻3個不同部位RNA-seq原始數(shù)據(jù)，繪制kinesin家族基因表達熱圖（圖6），進而篩選與苧麻韌皮纖維伸長、增厚相關(guān)的候選基因。結(jié)果顯示：kinesin基因家族的不同成員在苧麻不同發(fā)育階段的韌皮部組織（TOP、ER和FER）中表達量存在較大差異。BnKIN-5D等44個基因在TOP中表達較高，BnKIN-14I_2和BnKIN-7H在ER中表達較高，BnKIN-UC_1和BnKIN-1在FER中表達較高。進一步篩選出｜log2｜＞1且Padj值小于0.05的基因，log2FC值大于1的基因為上調(diào)表達，小于-1的為下調(diào)表達。BnKIN-5D等29個基因在以TOP為對照的ER中下調(diào)表達，而BnKIN-14I_2、BnKIN-7H在以TOP為對照的ER中上調(diào)表達；BnKIN-12D、BnKIN-14I_3、BnKIN-14I_4、BnKIN-14F在以ER為對照的FER中上調(diào)表達（表3）。

表3 中苧一號苧麻纖維發(fā)育相關(guān)的差異表達基因Table 3 Differentially expressed genes associated with fiber development of Zhongzhu No.1

圖3 BnKIN的基因結(jié)構(gòu)Fig.3 The gene structures of BnKIN

圖4 BnKIN基因啟動子順式作用元件分布圖Fig.4 Distributionmap of promoter cis-acting element of BnKIN genes

圖5 BnKIN的GO富集分析Fig.5 The GO enrichment analysis of Kinesin proteins

圖6 中苧一號苧麻kinesin家族基因表達熱圖Fig.6 Expression profiles of kinesin family genes in different tissues of Zhongzhu No.1

2.7 熒光定量PCR分析BnKIN基因家族不同發(fā)育部位的表達量變化

為得到苧麻韌皮纖維發(fā)育的候選基因，依據(jù)篩選出的苧麻不同部位的差異表達基因，利用熒光定量PCR檢測其表達水平。結(jié)果顯示，30個基因在頂端、節(jié)間伸長區(qū)和節(jié)間完全伸長區(qū)的莖皮中的表達存在差異，其中14個基因有顯著表達。BnKIN-5D、BnKIN-14S_2、BnKIN-5B、BnKIN-14S_1、BnKIN-7N、BnKIN-12D、BnKIN-14C、BnKIN-14N、BnKIN-4A_2、BnKIN-12C、BnKINUA、BnKIN-7K_1、BnKIN-7H、BnKIN-14I_3、BnKIN-14I_4、BnKIN-12B、BnKIN-7E_1、BnKIN-4C、BnKIN-12F、BnKIN-14F和BnKIN-10C在完全伸長節(jié)間的莖皮中表達量最高，BnKIN-8A和BnKIN-6在未完全伸長節(jié)間的莖皮中表達量最高，BnKIN-5C、BnKIN-14I_2、BnKIN-UC_2、BnKIN-4A_1、BnKIN-7O_3、BnKIN-14L_2和BnKIN-14J在頂端的莖皮中表達量最高。為消除苧麻頂部其他組織對篩選韌皮纖維發(fā)育候選基因的影響，與轉(zhuǎn)錄組測序取用頂芽不同，本研究實際取樣為苧麻頂端莖皮，這可能是轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)與熒光定量PCR基因表達量不一致的原因。

3 討論

圖7 中苧一號苧麻纖維發(fā)育相關(guān)的基因表達分析Fig.7 Expression profile of genes associated with fiber development of Zhongzhu No.1

Kinesin是真核生物中普遍存在的蛋白，在植物細胞有絲分裂、信號轉(zhuǎn)導、細胞器運輸方面發(fā)揮重要作用［26-29］。Kinesin家族基因廣泛存在于生物體中，目前研究結(jié)果表明，擬南芥有61個kinesin基因家族成員［17］，毛果楊有52個［9］，水稻有 52個［8］，但尚未有對苧麻kinesin基因家族進行鑒定與分析的報道。伴隨苧麻全基因組測序的完成，本研究首次從苧麻中鑒定出57個kinesin基因家族成員，根據(jù)kinesin家族基因的同源關(guān)系，將其分為9個亞族，對其結(jié)構(gòu)域進行分析，結(jié)果顯示，9個亞族的所有成員均包含一個高度保守的KISC結(jié)構(gòu)域，44個BnKIN家族成員具有α-helical coiled-coil結(jié)構(gòu)域，部分BnKIN-14亞家族成員具有CH結(jié)構(gòu)域。CH結(jié)構(gòu)域與微絲和細胞骨架結(jié)合，和發(fā)育中的棉纖維中的肌動蛋白絲相互作用［14-15］，表明具有CH結(jié)構(gòu)域的部分BnKIN-14亞族成員可能在韌皮纖維發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。進化樹分析表明，每一組均含有苧麻、擬南芥和水稻家族基因，表明這三種作物的親緣關(guān)系較近。每一組均包含來自單子葉和雙子葉植物的kinesin蛋白，表明該家族基因基本特征在單、雙子葉植物分化之前已經(jīng)形成。

前人［30-31］認為生長素、茉莉酸甲酯、赤霉素對纖維發(fā)育起積極作用，而脫落酸抑制纖維生長。有學者發(fā)現(xiàn)，MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)一系列下游基因，從而激活次生壁生物合成，進而影響纖維發(fā)育［32-33］。通過苧麻BnKIN基因家族成員的順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)BnKIN基因家族成員啟動子區(qū)含有許多響應(yīng)激素信號、光和轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)的元件，包括茉莉酸甲酯、赤霉素、脫落酸、生長素、水楊酸和MYB轉(zhuǎn)錄因子等。表明BnKIN的上游啟動子可能受到植物激素和MYB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，從而在纖維生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)顯示kinesin基因家族的不同成員在苧麻不同發(fā)育階段的韌皮部組織中表達量存在較大差異。本研究采用qRT-PCR技術(shù)對中苧一號苧麻不同部位的kinesin家族基因成員表達變化進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同BnKIN家族成員在苧麻不同組織中的表達量存在差異，大多數(shù)基因在成熟程度較高的莖皮中表達量較高，揭示這些基因可能參與次生細胞壁生物合成，在苧麻韌皮纖維的生長發(fā)育過程中起重要的作用，后續(xù)有待于進一步對這些基因的功能進行驗證。對苧麻kinesin家族的鑒定及分析，可為進一步研究BnKIN的生物學功能和韌皮纖維發(fā)育的分子機制奠定基礎(chǔ)［34-36］。

4 結(jié)果

苧麻是我國重要的韌皮纖維作物，苧麻纖維及其織物、織品是我國重要工業(yè)原料和傳統(tǒng)的出口創(chuàng)匯產(chǎn)品，纖維品質(zhì)的優(yōu)劣決定著纖維的可紡性能和織物的使用性能。分子生物學技術(shù)的完善，使得在常規(guī)育種的基礎(chǔ)上，研究纖維相關(guān)基因是培育新品種及創(chuàng)制優(yōu)異種質(zhì)資源的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對纖維作物而言，這些基因的研究對改良纖維品質(zhì)具有重要意義。因此，培育纖維發(fā)育優(yōu)異品質(zhì)苧麻種質(zhì)資源迫在眉睫，這既滿足日常人們生活需要，又對農(nóng)業(yè)工業(yè)生產(chǎn)都具有重要意義。本研究通過對苧麻kinesin基因家族全基因組鑒定及表達分析，篩選到苧麻纖維發(fā)育的候選基因BnKIN-5D、BnKIN-14S_2、BnKIN-5B、BnKIN-14S_1、BnKIN-7N、BnKIN-12D、BnKIN-14C、BnKIN-14N、BnKIN-4A_2、BnKIN-12C、BnKIN-UA、BnKIN-7K_1、BnKIN-7H、BnKIN-14I_3、BnKIN-14I_4、BnKIN-12B、BnKIN-7E_1、BnKIN-4C、BnKIN-12F、BnKIN-14F和BnKIN-10C，為后續(xù)苧麻 kinesin家族的功能驗證奠定基礎(chǔ)，并為篩選苧麻纖維發(fā)育候選基因提供依據(jù)。