嵇如月，于 新，趙晨蕊，何成彥，方 玲

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130033)

結(jié)直腸癌是世界第三大最常見癌癥[1]。其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)不斷增加，僅2020年全球結(jié)直腸癌新發(fā)病例為193.16萬，死亡病例93.52萬,因此迫切需要降低發(fā)病率和死亡率[2]。本實驗通過二維色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)及免疫印跡探究TOMM40在結(jié)直腸癌組織及癌旁組織的表達及意義，為結(jié)直腸癌的篩查和診斷提供一個新的方向。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究所選用的結(jié)直腸癌及配對癌旁組織標本經(jīng)病理醫(yī)師確認均為DukesB期腺癌，共16對，來源于胃腸外科手術(shù)切除，標本采集時間段為2018年1月到2020年12月，所有患者均簽署了知情同意書，且保證術(shù)前沒有經(jīng)過任何方式治療。組織獲取后用事先預(yù)冷的PBS沖洗干凈，去除壞死組織及血液，迅速進行液氮速凍，然后放在-80℃冰箱保存，以備后續(xù)實驗使用。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀，TPCK修飾的測序級胰酶，NH4HNO3，DTT，LTQXL 離子阱質(zhì)譜儀、反向毛細管色譜分析柱，TOMM40單抗，GAPDH多抗，PMSF，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒，碘代乙酰胺，DNA酶，RNA酶。

1.3 方法

1.3.1樣品總蛋白的提取及測定 將組織樣本從-80℃冰箱取出，充分研磨后加入裂解液冰上裂解30 min。加入適量DNA酶和RNA酶去除組織中殘留DNA和RNA，12 000 rpm(4℃)離心10 min，即得到總蛋白。蛋白濃度測定用BCA蛋白定量試劑盒，按說明書要求，將96孔板加好，測定其在562 nm處的吸光度，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制蛋白質(zhì)濃度標準曲線。

1.3.2蛋白質(zhì)多肽混合物的制備 室溫下自然融化樣品，把各樣品終濃度調(diào)至20 mmol/L，此過程可用適當體積及濃度的NH4HNO3和DTT幫助稀釋，56℃，避光，充分反應(yīng)1 h。冷卻至25℃左右后后再調(diào)整終濃度為50 mmol/L,此過程需補充一定量的1 mol/L的IAM，避光，充分反應(yīng)半小時。加入適量胰酶，保證蛋白和胰酶的比例為50∶1，在37℃水浴箱中培養(yǎng)過夜，把得到的蛋白質(zhì)多肽混合物分裝并保存在-80℃冰箱里，以備后續(xù)實驗使用。

1.3.3二維色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析 將得到的蛋白多肽混合物用0.1%的FA溶解，每組樣品分別取50 μg用于上樣，通過強離子交換柱和反向柱洗脫分離蛋白多肽樣品，用LTQXL離子阱質(zhì)譜儀分析，獲取LC-MS圖譜。

1.3.4免疫印跡試驗 用免疫印跡實驗對結(jié)直腸癌組織的TOMM40蛋白表達量進行檢驗，驗證LC-MS的分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析結(jié)果

本實驗癌組織及癌旁組織中同一蛋白的豐度通過圖譜數(shù)來衡量，差異蛋白的滿足條件為兩個樣品中蛋白圖譜數(shù)比值 ≥1且蛋白圖譜數(shù)差值 ≥72 ?；谝陨蠘藴?，本研究檢測到Ca199、Ca153、FGB、POSTN、MUC2等21個上調(diào)蛋白，MYL9、CNN1、CKB、HSPB1、FLNA等11個下調(diào)蛋白。TOMM40為其中一個上調(diào)蛋白，質(zhì)譜圖結(jié)果見圖1。

2.2 免疫印跡試驗結(jié)果

對16對組織的TOMM40表達量檢測后結(jié)果如圖2所示。TOMM40在癌組織中的表達量明顯增高(P<0.05)。

3 討論

近年來，結(jié)直腸癌因早期診斷率低和治療效果差已成為人們關(guān)注的問題[3]。其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)急劇上升，尤其在50歲以下的人群中，因此需要新的診斷和治療選擇[4]。

圖1 TOMM40 質(zhì)譜圖結(jié)果

圖2 TOMM40 免疫印跡結(jié)果

線粒體是必不可少的細胞器，通過調(diào)節(jié)細胞和組織之間的通信來影響生物體的生理功能，因此線粒體功能障礙已成為包括衰老、癌癥和代謝紊亂等疾病的關(guān)鍵影響因素[5]。線粒體由兩個獨立的膜組成：外膜包圍可溶性膜間隙，內(nèi)膜包圍蛋白質(zhì)密集的基質(zhì)空間[6]。TOMM40又叫線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶40，對于蛋白質(zhì)進入線粒體至關(guān)重要，與TOM20、TOM22共同組成線粒體外膜蛋白Tom復(fù)合體[7]。TOMM40位于TOM復(fù)合體的中心，通道由TOM40的β-桶狀核心組成，并由其他亞基起穩(wěn)定作用[8]。TOMM40復(fù)合體核心的直徑至少能容得下兩個多肽的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在動物和真菌中，TOMM40復(fù)合體的起始受體亞基包括TOM20和TOM70，TOM20在N端具有一個跨膜組分定位于外膜，C端受體區(qū)域朝向胞質(zhì)溶膠一側(cè)。Gottschalk等人發(fā)現(xiàn)TOMM40與遲發(fā)型阿爾茨海默病的風(fēng)險和發(fā)病年齡相關(guān)，并且是迄今為止遺傳研究中確定的唯一可能導(dǎo)致遲發(fā)型阿爾茨海默病相關(guān)線粒體功能障礙的核編碼基因[9]。也有文獻研究表明TOMM40與癌細胞中的線粒體密切相關(guān)，并調(diào)節(jié)ATP的產(chǎn)生和癌細胞的生長[10-11]。Yang研究發(fā)現(xiàn)TOMM40在卵巢癌細胞中的表達高于正常卵巢上皮細胞，TOMM40基因敲除降低了卵巢癌細胞系的增殖，并降低了腫瘤負擔，且高表達TOMM40的上皮性卵巢癌患者的預(yù)后比低表達TOMM40的患者更差[12]。鄭永昌[13]通過免疫印跡、RT-PCR、免疫組化實驗表明，TOMM40在胰腺癌組織及細胞中都有高表達趨勢，TOMM40是胰腺癌新的候選免疫原性膜抗原，有望用于胰腺癌的早期診斷。

本實驗通過LC-MS和免疫印跡兩種技術(shù)對結(jié)直腸癌及癌旁組織進行了分析和驗證，確定TOMM40在結(jié)直腸癌組織中高表達，這對解決當前結(jié)直腸癌篩查和診斷的局限性提供了一個新的潛在策略，但TOMM40在結(jié)直腸癌里升高的機制還不清楚，需要下一步實驗探究發(fā)掘。