錄億隆 劉星 張宇豪 劉開(kāi)業(yè) 唐朝榮

摘? 要：橡膠延伸因子（REFs）是橡膠粒子上的一種主要膜蛋白，在橡膠生物合成途徑中具有延伸橡膠烴和穩(wěn)定橡膠粒子等重要作用。對(duì)橡膠樹(shù)不同組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在膠乳中具有特異性的高表達(dá)，且其在HbREFs基因家族中表達(dá)水平也相對(duì)較高，僅次于表達(dá)豐度最高的。的開(kāi)放閱讀框?yàn)?28 bp，編碼175個(gè)氨基酸，對(duì)應(yīng)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為19.62 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為5.28。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，HbREF3與橡膠樹(shù)其他HbREFs雖均屬于分組Ⅰ，但與HbREF1明顯屬于不同分支。HbREFs均含有REF保守結(jié)構(gòu)域，但在保守motif的分布上，不同HbREFs蛋白含有保守motif數(shù)量不等，HbREF3比HbREF1多了一個(gè)motif。生信預(yù)測(cè)分析表明，該蛋白屬于親水性蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，具有14個(gè)磷酸化位點(diǎn)。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)HbREF3蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，推測(cè)其可能參與橡膠粒子的形成和膠乳的再生。本研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明基因在橡膠樹(shù)膠乳再生中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：橡膠樹(shù);橡膠延伸因子HbREF3;生物信息學(xué)分析;亞細(xì)胞定位中圖分類號(hào)：S794.1 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Cloning and Primary Functional Analysis of Gene from

LU Yilong， LIU Xing， ZHANG Yuhao， LIU Kaiye， TANG Chaorong

College of Tropical Crops， Hainan University / Natural Rubber Cooperative Innovation Center of Hainan Province & Minstry of Education of PRC， Haikou， Hainan 570228， China

Natural rubber （NR） is an important strategic material related to national economy， livelihood and national security. It is of great significance to increase the production of natural rubber by focusing on the biosynthesis process of natural rubber. Rubber elongation factors （REFs） are mainly membrane proteins on rubber particles， which play an important role in extending rubber hydrocarbon and stable rubber particles during natural rubber biosynthesis process. It is an important approach for high-yield molecular marker-assisted selection breeding of rubber trees by identifying the key REFs gene that affects natural rubber yield. We found was highly and specifically expressed in latex， and its expression level was just less than that of which is the highest expression in latex in HbREFs gene family. The open reading frame of was 528 bp， encoding 175 amino acids. The molecular weight and theoretical isoelectric point of HbREF3 was 19.62 kDa and 5.28， respectively. Phylogenetic tree analysis showed that HbREF3 and HbREF1 belonged to different branches. All HbREFs proteins contain REF domain， and HbREF3 had one more motif than HbREF1. In silico studies showed that HbREF3 protein was a hydrophilic protein， without transmembrane domain， had 14 phosphorylation sites. The results indicated that HbREF3 may not be attached to the surface of rubber particles in a mosaic form， but directly or indirectly interacted with other proteins which embedded in the lipid monolayer membrane to form a complex attached on the surface of the rubber particles. The predicted localization result is different with HbREF1 which is embedded in the rubber particle monolayer membrane. The surface of rubber particles is composed of a monolayer of phospholipid membrane， the formation and development of rubber particles may be related to lipid synthesis. Subcellular localization analysis revealed that HbREF3 was localized in endoplasmic reticulum， we speculate that HbREF3 might be directly involved in rubber particle formation and latex regeneration by participating in lipid synthesis. Moreover， overexpression of REF/SRPPs family genes in nonrubber-producing plants （Arabidopsis and Capsicum） can significantly improve the drought resistance and accumulate a large number of lipid droplets. Therefore， we speculate that HbREF3 have a similar function to REF/SRPPs family proteins of nonrubber-producing plants in responding to drought in nature rubber harvesting process. We clarified the HbREF3 expression pattern and protein characteristics which would build a foundation for elucidating the molecular mechanism of in latex regeneration in rubber trees.

; rubber elongation factor HbREF3; bioinformatics analysis; subcellular localization

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.007

天然橡膠（NR）因其具有較強(qiáng)的彈性、可塑性和良好的絕緣性，有效的散熱性和低溫下的延展性等獨(dú)特性能，除了用于生產(chǎn)人們?nèi)粘Ｉ畈豢苫蛉钡娜沼谩⑨t(yī)用等輕工業(yè)橡膠產(chǎn)品之外，主要作為戰(zhàn)略物質(zhì)用于生產(chǎn)軍工和航空航天等國(guó)防器械，所以其經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，應(yīng)用前景廣泛。近些年，雖然已有人工合成橡膠制品流向市場(chǎng)，但其性能不及天然橡膠，用途范圍有限，所以天然橡膠的重要地位仍未被取代，尤其是在高精尖領(lǐng)域所用的橡膠制品仍以天然橡膠為原料，而且隨著經(jīng)濟(jì)和科技的發(fā)展，人類在高精尖領(lǐng)域?qū)μ烊幌鹉z的利用大大提高，需求量也不斷增加。因此，研究天然橡膠的生物合成、提高天然橡膠產(chǎn)量具有重要意義。

橡膠樹(shù)是大戟科橡膠樹(shù)屬植物，其膠乳的品質(zhì)好、產(chǎn)膠量高，是全球天然橡膠的主要來(lái)源。橡膠樹(shù)的膠乳來(lái)源于特化的乳管細(xì)胞，乳管細(xì)胞中有種特殊的細(xì)胞器負(fù)責(zé)膠乳主要成分橡膠烴的生物合成。這種特殊的細(xì)胞器被稱為橡膠粒子，其形態(tài)主要呈球形和梨形，直徑大小不一，據(jù)推測(cè)大橡膠粒子是由小橡膠粒子發(fā)育而來(lái)。橡膠粒子表面是附有多種膜蛋白的磷脂單層膜，它包裹著疏水性的聚異戊二烯，這些膜蛋白協(xié)同作用負(fù)責(zé)催化和調(diào)控天然橡膠分子鏈的合成與延伸。橡膠延伸因子（HbREFs）和小橡膠粒子蛋白（HbSRPPs）是橡膠樹(shù)膠乳中豐度最高的蛋白，同屬REF/SRPPs蛋白家族，它們與順式異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（HbCPTs）和CPT結(jié)合蛋白（一種人Nogo B受體類似蛋白、也稱HbCPTL）形成復(fù)合體定位在橡膠粒子上，是橡膠粒子膜蛋白的主要成分。

巴西橡膠樹(shù)基因組顯示，橡膠樹(shù)中分別存在8個(gè)HbREFs和10個(gè)HbSRPPs。在非產(chǎn)膠植物中也有含REF結(jié)構(gòu)域的蛋白，被稱為REF/RPPs樣蛋白，這些REF/SRPPs樣蛋白是同源蛋白，均屬于一個(gè)更大的植物脅迫相關(guān)蛋白家族。在橡膠樹(shù)膠乳中，橡膠延伸因子占橡膠粒子膜蛋白的10%～60%，占膠乳總蛋白的6%～10%，在橡膠生物合成途徑中具有十分重要的作用。在橡膠樹(shù)膠乳中特異超高表達(dá)，是在膠乳中表達(dá)量最高的HbREFs家族基因，發(fā)現(xiàn)它的蛋白序列類似于羧基端被截?cái)嗟腍bSRPP1，推測(cè)其可能是由表達(dá)量較低的基因逐步進(jìn)化而來(lái)。

本研究基于已發(fā)表的橡膠樹(shù)基因組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆了在橡膠樹(shù)膠乳中特異高表達(dá)的新的橡膠延伸因子基因（GeneID：110644926，與孫麗娜等報(bào)道的非同一個(gè)基因）。利用橡膠樹(shù)、橡膠草、萵苣和擬南芥中REF/SRPPs的蛋白質(zhì)序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，分析發(fā)現(xiàn)HbREF3可能是橡膠樹(shù)物種中特異的一類橡膠粒子蛋白。并對(duì)其進(jìn)行了蛋白質(zhì)分子量、理論等電點(diǎn)、親/疏水性、可能的磷酸化位點(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)域以及保守結(jié)構(gòu)域等生物信息學(xué)分析。為進(jìn)一步研究HbREF3蛋白在橡膠樹(shù)中的作用，本課題組還預(yù)測(cè)了HbREF3蛋白的結(jié)構(gòu)，并采用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)分析其在細(xì)胞中的定位。本研究為深入闡明基因在橡膠烴生物合成中的作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

?材料與方法

材料

1.1.1 ?植物材料 ?煙草使用的是本氏煙（種子為本實(shí)驗(yàn)室留存），在人工氣候室（溫度25℃、空氣濕度60%，光照16 h/黑暗8 h）種植，選取生長(zhǎng)約25 d的煙草葉片進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2? 質(zhì)粒及菌株? pCAMBIA1300-35S-EGFP購(gòu)自淼靈質(zhì)粒平臺(tái)（http：//www.miaolingbio.com/），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）定位Marker和細(xì)胞核定位Marker的表達(dá)質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，pEASY-Blunt Zero克隆載體、大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌GV3101購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3? 試劑? 植物總RNA提取試劑盒（離心柱型Cat.RP55012）購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Revert Aid First Strand cDNA Synthesis kit（Cat.K1612）和限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Thermo Fisher Scientific（中國(guó)），高保真DNA聚合酶試劑盒Prime STAR HS DNA Polymerase（Cat.R040A）購(gòu)自TaKaRa公司，通用型DNA純化回收試劑盒（Cat.DP204）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒（Cat. C201-01）、同源重組試劑盒ClonExpress II One Step Cloning Kit（Cat.C112-01）購(gòu)自諾維贊（南京）生物技術(shù)有限公司。

方法

1.2.1? 橡膠樹(shù)膠乳總RNA的提取和cDNA合成? 膠乳總RNA的提取參照TANG等的方法，提取的總RNA使用InfiniteM200 Pro多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其濃度及質(zhì)量，并使用2%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA的質(zhì)量進(jìn)一步確認(rèn)。取1 μg RNA用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA置于–80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 基因的克隆及載體構(gòu)建? 利用本實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的橡膠樹(shù)基因組數(shù)據(jù)及注釋文件查找基因的完整序列，運(yùn)用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增引物HbREF3-F/HbREF3-R（表1）。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸50 s，32次循環(huán)后，72℃再延伸10 min，16℃待機(jī)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將含有目的基因的條帶用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化。將回收產(chǎn)物與pEASY-Blunt Zero克隆載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行Sanger測(cè)序。使用限制性內(nèi)切酶 Ⅰ和H Ⅰ對(duì)pCAMBIA1300-GFP載體進(jìn)行雙酶切，設(shè)計(jì)引物GFP-HbREF3-F/GFP-HbREF3-R（表1），擴(kuò)增基因，通過(guò)同源重組構(gòu)建pCAMBIA1300-載體。

1.2.3 ?生物信息學(xué)分析 ?使用在線網(wǎng)站（https：// ww.novopro.cn/tools/translate.html）將基因序列翻譯為蛋白質(zhì)序列，使用Prot Param （https：//web.expasy.org/protparam/）在線軟件預(yù)測(cè)HbREF3蛋白的理化性質(zhì)。使用Prot Scale （https：// web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）在線軟件預(yù)測(cè)該蛋白親/疏水性。使用TMHMM Server 2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在線軟件預(yù)測(cè)該蛋白是否有跨膜結(jié)構(gòu)域。使用NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/Net）在線軟件分析HbREF3蛋白中可能的磷酸化位點(diǎn)。使用SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr）和SWISS- MODEL （http：//www.swissmodel.expasy.org）在線軟件預(yù)測(cè)HbREF3蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。使用Pfam （https：//pfam.xfam.org/）和MEME （https：// meme-suite.org/meme/）在線軟件對(duì)HbREF3蛋白的結(jié)構(gòu)域和保守序列進(jìn)行分析。橡膠樹(shù)、橡膠草、萵苣和擬南芥中REF/SRPPs家族氨基酸序列均參照已發(fā)表文章中提供的序列號(hào)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載，使用MEGA 7.0.26軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4? HbREF3蛋白的亞細(xì)胞定位分析? 將測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤的表達(dá)載體pCAMBIA1300-利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，挑取的陽(yáng)性單克隆用帶篩選抗性的LB培養(yǎng)基搖至=0.4，然后在室溫下5000 g離心10 min，收集菌棄上清，用SPARKES等的方法配置的侵染液重懸2次，調(diào)至=0.4，加入乙酰丁香酮至終濃度為100 μmol/L繼續(xù)16℃、80 r/min避光搖2?h。用1?mL一次性無(wú)菌注射器注射生長(zhǎng)約25?d的煙草葉片，避光處理30 h后，使用共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào)。

2  結(jié)果與分析

2.1? 在橡膠樹(shù)中的表達(dá)分析

利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的橡膠樹(shù)RNAseq數(shù)據(jù)，對(duì)在橡膠樹(shù)中的表達(dá)進(jìn)行可視化分析。數(shù)據(jù)表明，在HbREFs家族中除了基因之外，在橡膠樹(shù)膠乳中的表達(dá)水平也比較高（圖1A）;而且在橡膠樹(shù)不同組織中，在橡膠樹(shù)膠乳中特異性表達(dá)（圖1B）。

因此，本課題組對(duì)其在橡膠樹(shù)膠乳中特異高表達(dá)的，且表達(dá)水平僅次于的進(jìn)行進(jìn)一步研究。

橡膠樹(shù)基因的克隆與鑒定

本研究以橡膠樹(shù)膠乳cDNA為模板，用引物HbREF3F/HbREF3R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約500 bp的片段（圖2A）。通過(guò)Sanger測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物與基因組注釋的基因開(kāi)放閱讀框序列完全一致，其全長(zhǎng)528 bp，編碼175個(gè)氨基酸（圖2B）。

序列進(jìn)化分析及蛋白保守結(jié)構(gòu)域鑒定

為了研究與其他REF/SRPPs家族基因的親緣關(guān)系，根據(jù)已發(fā)表的橡膠樹(shù)、橡膠草基因組文章，分別收集了18個(gè)橡膠樹(shù)REF/SRPPs家族基因和10個(gè)橡膠草REF/SRPPs家族基因。此外，根據(jù)CHAKRABARTY報(bào)道的萵苣REF/SRPPs基因家族和KIM等報(bào)道的擬南芥REF/SRPPs基因家族，分別收集了8個(gè)萵苣REF/SRPPs家族基因和3個(gè)擬南芥REF/SRPPs家族基因。利用MEGA軟件對(duì)上述39個(gè)REF/SRPPs家族基因的蛋白質(zhì)序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明：HbREF3與橡膠樹(shù)其他HbREFs家族蛋白都屬于分組Ⅰ（Clade I），屬于橡膠樹(shù)特異的一類REFs基因，而橡膠草的TkSRPPs家族蛋白和大多數(shù)萵苣的LsSRPPs家族蛋白屬于分組Ⅱ（Clade II），其余的分布在分組Ⅲ中（Clade III）（圖3）。與在膠乳中特異高表達(dá)的雖然都屬于分組Ⅰ，但明顯屬于不同分支（圖3）。對(duì)橡膠樹(shù)HbREFs基因家族氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域和保守序列預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們均含有典型的REF結(jié)構(gòu)域（圖4A），但在保守motif的分布上，不同HbREFs蛋白含有保守motif數(shù)量不等（圖4B）。因此推測(cè)不同基因之間可能存在功能上的分化。HbREF3有5個(gè)不同的motif片段，比HbREF1多一種motif片段（圖4B），預(yù)示其功能與HbREF1可能有差異。

蛋白理化性質(zhì)和生物信息學(xué)分析

對(duì)HbREF3蛋白序列及其理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為19.62 kDa，理論等電點(diǎn)（pI）為5.28，氨基酸組成中含量最高的是谷氨酸，占12.6%，不含半胱氨酸和色氨酸。對(duì)該蛋白的親/疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，HbREF3蛋白親水區(qū)域分布明顯多于疏水區(qū)域，屬于親水性蛋白（圖5A），無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖5B），推測(cè)該蛋白可能僅位于膜的外表面。磷酸化水平預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白有14個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別是6個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、4個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和4個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，其中第99位氨基酸位點(diǎn)發(fā)生磷酸化修飾的可能性最高（圖5C）。

HbREF3蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占68%，無(wú)規(guī)則卷曲占25.14%，延伸鏈占6.86%（圖5D）。通過(guò)SWISS-MOLD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步對(duì)HbREF3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果一致（圖5E）。

蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上

為進(jìn)一步了解HbREF3蛋白在橡膠樹(shù)中的功能，本課題組構(gòu)建了pCAMBIA1300-H融合表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌注射煙草葉片的瞬時(shí)表達(dá)方法，對(duì)HbREF3蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位（圖6）。以35S：：GFP作為對(duì)照，將HbREF3分別與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位Marker和細(xì)胞核定位Marker共同轉(zhuǎn)染，研究結(jié)果表明HbREF3蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，且不定位于細(xì)胞核中。因此本課題組推測(cè)，HbREF3可能在橡膠粒子的形成和橡膠樹(shù)膠乳的再生過(guò)程中起重要作用。

討論

橡膠粒子作為聚合和貯存橡膠烴的特殊細(xì)胞器，對(duì)橡膠產(chǎn)量和膠乳的質(zhì)量有很大影響;而橡膠延伸因子HbREFs是橡膠粒子中最豐富的蛋白質(zhì)，在橡膠（順式-1，4-聚異戊二烯）聚合延伸中起重要作用。前人研究表明基因在橡膠樹(shù)膠乳中特異高表達(dá)，割膠和乙烯利處理均可以誘導(dǎo)其在膠乳中的上調(diào)表達(dá)，且基因在膠乳中的表達(dá)水平與膠乳產(chǎn)量呈正相關(guān)。本研究中的也是一個(gè)在橡膠樹(shù)膠乳中特異性高表達(dá)的HbREFs家族基因，在橡膠樹(shù)膠乳中的表達(dá)水平僅次于。編碼175個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)該蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為19.62?kDa、理論pI為5.28。系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析表明HbREF3雖然與基因表達(dá)水平在膠乳中特異最高表達(dá)的HbREF1屬于一個(gè)大的分組，但它們?cè)诮MⅠ中明顯不屬于一個(gè)分支，并且在motif片段分布上，橡膠樹(shù)HbREFs家族中HbREF3有5個(gè)不同的motif片段，比HbREF1多一種motif片段，這也許會(huì)讓它在蛋白質(zhì)功能上與HbREF1有些許差異。因此，對(duì)HbREF3的研究或許會(huì)對(duì)分析HbREFs在產(chǎn)膠生物合成中的功能提供新的見(jiàn)解。

前人研究表明，天然橡膠被脂質(zhì)單層膜包裹形成橡膠粒子，內(nèi)部是疏水區(qū)，外部親水區(qū)，而HbREFs與HbSRPPs、HbCPTLs和HbCPTs形成復(fù)合物附著在橡膠粒子表面的脂質(zhì)單層膜上。在以往的HbREFs相關(guān)研究中，研究對(duì)象主要是HbREF1。本研究中，生信分析的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示HbREF3蛋白屬于親水性蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，這說(shuō)明HbREF3蛋白可能不是以鑲嵌的形式附著在橡膠粒子表面，而是與鑲嵌在膜上的其他蛋白直接或間接互作形成復(fù)合體附著在橡膠粒子表面的脂質(zhì)單層膜上，這同HbREF1鑲嵌在橡膠粒子膜中的報(bào)道明顯不同。

橡膠粒子的形成和發(fā)育與天然橡膠的生物合成密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，橡膠粒子表面是一層磷脂單層膜，橡膠粒子的形成和發(fā)育可能與脂質(zhì)合成有關(guān)。YOKOTA等在釀酒酵母中過(guò)表達(dá)REF/SRPPs（、和）基因，發(fā)現(xiàn)這些蛋白質(zhì)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂滴中，它們的表達(dá)誘導(dǎo)了酵母中甾醇酯和三酰甘油的積累，并影響了脂滴的形態(tài)，表明REF/SRPPs影響脂質(zhì)代謝。REF/SRPPs樣蛋白在其他非產(chǎn)膠植物中也稱脅迫相關(guān)蛋白，過(guò)表達(dá)的擬南芥植物表現(xiàn)出更旺盛的營(yíng)養(yǎng)和生殖生長(zhǎng)并顯著增加了對(duì)干旱脅迫的耐受性。此外，發(fā)現(xiàn)萌發(fā)后的幼苗中有大量脂滴的積累。在擬南芥中過(guò)表達(dá)辣椒中的REF/SRPPs家族基因，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植株的根和莖生長(zhǎng)以及抽薹提前，并且過(guò)表達(dá)也能增強(qiáng)擬南芥對(duì)干旱脅迫的耐受性。以上結(jié)果表明，REF/SRPPs蛋白可能在脂質(zhì)的合成、組織的生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)干旱脅迫等方面發(fā)揮重要作用。本研究利用煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)HbREF3蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，其定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，推測(cè)HbREF3可能參與了脂質(zhì)的合成，進(jìn)而影響了橡膠粒子的形成和膠乳再生，并且該蛋白可能有類似于擬南芥中REF/SRPPs家族蛋白響應(yīng)干旱脅迫的功能，在橡膠樹(shù)中響應(yīng)割膠脅迫，促進(jìn)膠乳的再生。

綜上，本研究對(duì)橡膠樹(shù)基因進(jìn)行克隆、生物信息學(xué)分析以及亞細(xì)胞定位，為進(jìn)一步探究HbREF3蛋白在橡膠樹(shù)中的功能奠定了基礎(chǔ)。

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