耿沙 張建禹 王曉彤 任思楊 毋志浩 姚遠(yuǎn) 李瑞梅

，

郭建春，劉? 姣，羅麗娟

1. 海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南海口? 570228;2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院，海南海口? 571101

摘? 要：木薯（ Crantz）是一種熱帶、亞熱帶重要的糧食與能源作物，提高木薯的產(chǎn)量對木薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展至關(guān)重要。木薯塊根的發(fā)育直接影響其產(chǎn)量情況，而不同逆境脅迫會(huì)影響木薯塊根的發(fā)育情況。因此解析木薯塊根的發(fā)育機(jī)制有助于通過分子育種手段實(shí)現(xiàn)木薯高產(chǎn)，以及獲得具備一定抗逆品質(zhì)的優(yōu)良種質(zhì)，增強(qiáng)木薯的適應(yīng)性，從而擴(kuò)大木薯種植的推廣面積。己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（STPs）是一類MSTs亞家族蛋白，通過轉(zhuǎn)運(yùn)糖類物質(zhì)調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育及非生物脅迫。本實(shí)驗(yàn)室前期鑒定出和基因在塊根發(fā)育時(shí)期的糖分累積、應(yīng)對非生物脅迫過程中起到重要作用，因此獲得木薯和雙突變體將有助于解析木薯塊根發(fā)育機(jī)制及創(chuàng)制抗逆新種質(zhì)。為了得到和木薯雙突變體，利用在線軟件CRISPR-P v2.0同時(shí)設(shè)計(jì)靶標(biāo)基因和的sgRNA，成功構(gòu)建了和的CRISPR/Cas9雙基因編輯載體。將編輯載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404后，侵染‘華南8號(hào)’（SC8）木薯脆性胚性愈傷組織，經(jīng)過Sanger測序分析和成功發(fā)生編輯，而潛在的脫靶位點(diǎn)未發(fā)生編輯，說明雙編輯載體可對和基因進(jìn)行編輯，且不造成脫靶現(xiàn)象，然后將侵染后的脆性胚性愈傷組織誘導(dǎo)出子葉，經(jīng)過15?mmol/L的潮霉素B篩選出生根植株，生根植株再經(jīng)過分子檢測，成功獲得帶有雙編輯載體表達(dá)框的轉(zhuǎn)基因陽性植株。以陽性植株的基因組作為模板，分別用PCR擴(kuò)增2個(gè)基因的靶位點(diǎn)前后各100 bp核苷酸序列，經(jīng)過Hi-TOM測序后，結(jié)果顯示有26個(gè)株系發(fā)生突變，其中雙基因突變體有23個(gè)，單基因突變體2個(gè)，單基因突變體1個(gè)，編輯類型多為單堿基缺失或插入，大片段堿基的缺失所占比率小。初步在組培瓶中觀察突變體的變型，發(fā)現(xiàn)單突變體和雙突變體的根系生長均受抑制，植株矮小，且和雙突變體受損更嚴(yán)重。該研究結(jié)果不僅為進(jìn)一步解析木薯塊根發(fā)育機(jī)制奠定基礎(chǔ)，還為獲得木薯抗病、抗逆新種質(zhì)提供材料。

關(guān)鍵詞：木薯;己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;CRISPR/Cas9;雙基因編輯

中圖分類號(hào)：S330 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Construction of and Double Mutants in Cassava Based on CRISPR/Cas9 Technology

GENG Sha， ZHANG Jianyu， WANG Xiaotong， REN Siyang， WU Zhihao， YAO Yuan， LI Ruimei， GUO Jianchun， LIU Jiao， LUO Lijuan

1. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Institute for Tropical Agricultural Resources， Haikou， Hainan 571101， China

Cassava （ Crantz） is an important food and energy crop in the tropics and subtropics， and improving cassava production is essential for the development of the cassava industry. The development of cassava storage root directly affects its yield， and different adversity stresses can affect the development of cassava storage root. Therefore， the analysis of cassava storage root development mechanism can help to achieve high cassava yield through molecular breeding， as well as to obtain excellent germplasm with certain resistance quality and enhance the adaptability of cassava， so as to expand the extension of cassava cultivation. Hexose transport proteins （STPs） are a subfamily of MSTs that regulate plant growth and development as well as abiotic stresses by transporting sugars. The and genes have been identified to play an important role in sugar accumulation during tuber development and in response to abiotic stresses. To obtain cassava double mutants， CRISPR/Cas9 double gene editing vectors for and were successfully constructed by designing the sgRNAs of both target genes， and 5， using the online software CRISPR-P v2.0. After transformation of the editing vector into LBA4404， ‘SC8’ cassava brittle embryonic healing tissues were infiltrated， and and were successfully edited by Sanger sequencing analysis， while the potential off-target sites were not edited， indicating that the dual editing vector could edit both and genes without causing off-target phenomenon. The rooted seedlings were then screened with 15 mmol/L Hygromycin B to produce rooted seedlings， which were then characterized detection to obtain positive transgenic cassavaplantswith the expression frame of the double-edited vector. The genomes of positive plants were used as the templates for PCR amplification of 100 bp nucleotide sequences before and after each target site of the two genes， and after Hi-TOM sequencing， the results showed that there were 26 strains with mutations， including 23 double mutants， 2 single mutants and 1 single mutant， and the editing types were mostly single. The types of editing were mostly single base deletions or insertions， with a small percentage of deletions of large segments of bases. Our preliminary observations of the mutant variants in histoponic flasks revealed that root growth was inhibited and plants were dwarfed in both the single and double mutants， and that the and double mutants were more severely damaged. These results not only lay the foundation for further analysis of the mechanism of cassava tuber development， but also provide material for obtaining new germplasm for cassava disease and stress resistance.

cassava; hexose transport proteins; CRISPR/Cas9; double gene editing

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.03.004

木薯（ Crantz）是一種熱帶、亞熱帶重要的糧食與能源作物。木薯產(chǎn)量與其塊根發(fā)育和逆境適應(yīng)密切相關(guān)。在植物中，單糖可作為植物生命活動(dòng)的能量供給，還可作為信號(hào)分子與激素協(xié)同作用、滲透保護(hù)劑、抗氧化劑等影響植物的生長發(fā)育。而糖類物質(zhì)的運(yùn)輸由糖外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SWEETs）、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SUTs）、單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MSTs）三類蛋白負(fù)責(zé)運(yùn)輸。己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（STPs）屬于MSTs亞家族，具有典型的12次跨膜結(jié)構(gòu)域，是質(zhì)膜上H/糖共轉(zhuǎn)體，不同的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白STPs具有的氨基端和羧基端跨膜蛋白序列有很高的同源性，但在一些結(jié)構(gòu)域有保守的氨基酸序列，其功能并不一致。研究表明STPs主要參與植物庫器官的發(fā)育和庫強(qiáng)的構(gòu)建，還參與植物的開花結(jié)果、信號(hào)傳導(dǎo)、生物和非生物脅迫等多種生理過程。為研究在木薯塊根發(fā)育和非生物脅迫中的作用，本實(shí)驗(yàn)室前期在木薯中成功鑒定出20個(gè)己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。對其組織特異性和木薯塊根發(fā)育過程中的表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)其中（Manes.03G180400）和（Manes. 15G027300）在早期貯藏根的根尖中高表達(dá)，且受干旱脅迫和低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)最高，推測和基因參與塊根發(fā)育時(shí)期的糖分累積和應(yīng)對非生物脅迫過程中起到重要作用。此外，和有相似的糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能，對葡萄糖、戊糖、木糖、核糖、半乳糖、果糖和甘露糖這7種己糖都有轉(zhuǎn)運(yùn)特性。

和的蛋白序列相近，功能可能存在冗余，為更好地解析這2個(gè)基因功能，對其同時(shí)進(jìn)行基因編輯，創(chuàng)制和MeSTP15雙突變體。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)不僅編輯效率高、穩(wěn)定和特異性強(qiáng)，還能同時(shí)編輯多個(gè)基因，被廣泛地應(yīng)用到醫(yī)學(xué)研究和生命科學(xué)領(lǐng)域，目前用于提高作物的抗性及營養(yǎng)價(jià)值，已在玉米、水稻、木薯等植物中應(yīng)用。在木薯中，利用CRISPR/Cas9雙基因編輯技術(shù)同時(shí)介導(dǎo)編輯木薯eIF4E異構(gòu)體nCBP-1和nCBP-2，可降低木薯褐條病癥狀嚴(yán)重程度和發(fā)病率，為本研究提供了設(shè)計(jì)提供了思路。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建木薯和雙基因編輯載體，轉(zhuǎn)化‘華南8號(hào)’（SC8）木薯脆性胚性愈傷，驗(yàn)證載體的編輯效果，獲得了和雙基因突變體，有助于后續(xù)深入解析在木薯塊根發(fā)育過程中的作用。

?材料與方法

? 材料

本研究選用具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗風(fēng)性強(qiáng)、出苗率高的木薯品種‘華南8號(hào)’（SC8），種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院木-薯種質(zhì)資源圃。菌株LBA4404根癌農(nóng)桿菌菌株、DH5α大腸桿菌菌株購于上海唯地生物技術(shù)有限公司，載體質(zhì)粒pCAMBIA1301-Cas9-sgRNA為本實(shí)驗(yàn)室所保存。

? 方法

1.2.1? 靶點(diǎn)引物的設(shè)計(jì)及基因編輯載體構(gòu)建根據(jù)（Manes.03G180400）和（Manes.15G027300）基因的CDS序列，利用CRISPR-P v2.0在線軟件（http：//crispr.hzau.edu. cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR）分析CDS區(qū)靶點(diǎn)及潛在脫靶位點(diǎn)，選擇滿足以下條件的靶點(diǎn)：靶點(diǎn)得分高于0.6，相對應(yīng)脫靶位點(diǎn)得分低;靶點(diǎn)GC含量為50%～70%;sgRNA中至少含有完整的莖環(huán)RAR、莖環(huán)2、莖環(huán)3。合成靶點(diǎn)退火引物（表1），參照李嶄等的方法構(gòu)建和雙基因編輯載體。根據(jù)載體序列，在AtU6-26啟動(dòng)子前設(shè)計(jì)陽性克隆F，在gRNA2后設(shè)計(jì)陽性克隆R，通過菌液PCR擴(kuò)增目的片段（538 bp），將測序正確的質(zhì)粒命名為pCAMBIAP1301-Cas9- -sgRNA，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LBA4404農(nóng)桿菌，菌液PCR驗(yàn)證正確后備用。

1.2.2木薯脆性胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及侵染轉(zhuǎn)化? 將鑒定正確的pCAMBIAP1301-Cas9-- sgRNA質(zhì)粒的LBA4404農(nóng)桿菌侵染木薯的脆性愈傷組織，將農(nóng)桿菌搖菌至對數(shù)，調(diào)整侵染濃度為為0.65，乙酰丁香酮濃度為250 mmol/L，侵染時(shí)間為40?min。侵染后的脆性胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移至GD固體培養(yǎng)基上，在22℃黑暗條件培養(yǎng)3?d后洗菌。然后移至GD固體培養(yǎng)基上，第1周不加潮霉素篩選，從第2周開始每周更換一次潮霉素篩選壓（5、8、15?mg/L潮霉素），培養(yǎng)4周后，移至培養(yǎng)基（MS+1?mg/L?NAA）誘導(dǎo)子葉，子葉在生根（MS+15?mg/L潮霉素）篩選后再經(jīng)過DNA鑒定，確定陽性植株。

1.2.3? 編輯效果檢測及脫靶分析 ?根據(jù)張彤等的方法，設(shè)計(jì)和 ?CDS區(qū)編輯靶點(diǎn)和4個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)區(qū)域的PCR擴(kuò)增引物（表1）。提取未侵染的木薯脆性胚性愈傷組織DNA和含有pCAMBIAP1301-Cas9--sgRNA質(zhì)粒農(nóng)桿菌侵染后的木薯脆性胚性愈傷組織DNA，用靶點(diǎn)引物（target-1）和靶點(diǎn)引物（target-2）PCR擴(kuò)增獲得目的片段并測序?；赟anger測序峰值圖，分析編輯效果及驗(yàn)證是否存在脫靶情況。

1.2.4? 陽性苗的鑒定及突變體的鑒定? 提取經(jīng)過潮霉素生根篩選的再生植株葉片的DNA，用陽性克隆篩選引物，PCR擴(kuò)增包含AtU6-26、靶點(diǎn)1、gRNA1、靶點(diǎn)2、gRNA2載體片段，凝膠電泳片段大小為538 bp的則為轉(zhuǎn)基因苗。提取陽性苗的DNA，用靶點(diǎn)引物（target-1）和 靶點(diǎn)引物（target-2）PCR擴(kuò)增基因靶點(diǎn)前后100?bp，送高通量測序（Hi-TOM測序），檢測靶點(diǎn)是否發(fā)生插入或缺失，分析是否導(dǎo)致基因突變。

? 結(jié)果與分析

2.1 ?雙基因編輯靶點(diǎn)的設(shè)計(jì)及潛在脫靶位點(diǎn)分析

利用木薯基因和的DNA序列，通過在線設(shè)計(jì)軟件CRISPR-P2.0，獲得，基因編輯靶點(diǎn)位于該基因的第3個(gè)外顯子，命名靶點(diǎn)1（圖1），GC含量為60%，有1個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)，位于10號(hào)染色體Manes. 10G030300基因的CDS區(qū)，脫靶分值為0.106，命名為Off-target-1;基因編輯靶點(diǎn)位于該基因的第2個(gè)外顯子，命名靶點(diǎn)2（圖1），GC含量為48%，有3個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)，Off-target-2位于10號(hào)染色體Manes.10G105000基因的內(nèi)含子，脫靶分值為0.312，Off-target-3位于號(hào)染色體Manes.08-G047800基因的內(nèi)含子，脫靶分值為0.115，Off-target-4位于1號(hào)染色體Manes. 01G204800基因的內(nèi)含子，脫靶分值為0.092。潛在脫靶位點(diǎn)只有Off-target-1位于CDS區(qū)且得分較低，其余脫靶位點(diǎn)位于內(nèi)含子，表明即使脫靶也不會(huì)造成基因功能的缺失（表2）。對靶點(diǎn)1和靶點(diǎn)2的sgRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果顯示，靶點(diǎn)序列二級(jí)結(jié)構(gòu)較為松散，含有完整的莖環(huán)RAR、莖環(huán)2、莖環(huán)3，利于結(jié)合靶位點(diǎn)（圖2）。

?基因編輯載體構(gòu)建

本研究所采用的基因編輯載體為pCAMBIA-1301-Cas9-sgRNA。利用限制性內(nèi)切酶Ⅰ酶切將載體線性化，再將線性化的質(zhì)粒與退火后的靶點(diǎn)引物連接，得到AtU6-26--sgRNA表達(dá)盒（圖3）。通過菌液PCR擴(kuò)增目的條帶，經(jīng)測序分析，長約538?bp，進(jìn)一步證明載體pCAMBIA-1301-Cas9--sgRNA已構(gòu)建成功。最后提取陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)LBA4404農(nóng)桿菌，備用。

?木薯脆性胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及轉(zhuǎn)化

將培養(yǎng)2個(gè)月的‘SC8’無菌苗切莖段，誘導(dǎo)側(cè)芽膨大，挑取側(cè)芽誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)得到脆性胚性愈傷組織（圖4A、圖4B、圖4C）。將攜帶編輯質(zhì)粒pCAMBIA1301-Cas9- -sgRNA的LBA4404農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化木薯脆性胚性愈傷組織，轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)脆性胚性愈傷組織4周，再誘導(dǎo)出子葉，誘導(dǎo)子葉分化形成植株，在MS+15?mg/L潮霉素的培養(yǎng)基中篩選再生根苗（圖4D、圖4E、圖4F）。

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? 編輯效果檢測及脫靶分析

以未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化4周后的脆性胚性愈傷組織

DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增和基因的編輯靶點(diǎn)上下100 bp左右的基因組片段，并測序分析該區(qū)域的序列變化情況。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)化后的樣品中，靶點(diǎn)（Target-1）的PAM區(qū)附近開始出現(xiàn)多峰，靶點(diǎn)（Target-2）的PAM區(qū)及后續(xù)片段都發(fā)生了移碼，峰值錯(cuò)亂，然而未轉(zhuǎn)化樣品中并無雜鋒出現(xiàn)（圖5），表明攜帶編輯質(zhì)粒的農(nóng)桿菌成功轉(zhuǎn)化進(jìn)入脆性胚性愈傷組織，在2個(gè)靶點(diǎn)處發(fā)生編輯。再以未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化4周后的木薯脆性胚性愈傷組織DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增和基因編輯靶點(diǎn)的4個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)區(qū)域片段，利用Sanger測序分析該靶點(diǎn)是否存在脫靶現(xiàn)象。結(jié)果表明，潛在脫靶位點(diǎn)的序列在已轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化的樣品中未發(fā)生改變（圖6）。說明本研究構(gòu)建的雙基因編輯載體pCAMBI-A1301-Cas9-- sgRNA可對和基因同時(shí)進(jìn)行編輯，均無脫靶現(xiàn)象。

?陽性苗篩選及突變體編輯分析

將鑒定發(fā)生編輯的木薯脆性胚性愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生子葉，子葉誘導(dǎo)成苗，經(jīng)過15?mg/L的潮霉素生根篩選，提取生根苗的DNA進(jìn)行PCR檢測，成功得到帶有編輯表達(dá)框的陽性植株（圖7）。陽性苗Hi-TOM測序檢測是否發(fā)生編輯，于‘SC8’比對分析，2個(gè)靶點(diǎn)的編輯類型主要是單個(gè)堿基的缺失或插入，大片段的編輯類型較少;突變類型有純和突變、雜合突變及雙等位突變的多種突變形式，編輯率比對發(fā)現(xiàn)，靶點(diǎn)Target-1<！--[if gte vml 1]> <！[endif]--><！--[if ！vml]--><！--[endif]--><！--[if gte vml 1]> <！[endif]--><！--[if ！vml]--><！--[endif]-->編輯效率明顯高于靶點(diǎn)Target-2，可能和靶點(diǎn)在載體中的前后位置有關(guān)。本研究一共篩選到26個(gè)突變體，獲得單突變體和，的單基因突變體，其余的株系為不同類型的雙基因突變體（表3）。說明本研究選擇的基因編輯靶點(diǎn)序列形成的sgRNA可引導(dǎo)Cas9蛋白對和基因CDS區(qū)進(jìn)行編輯，造成基因序列的突變，得到不同編輯類型的突變體，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了豐富了的材料。

突變體表型分析

突變體莖段培養(yǎng)一個(gè)月后，與野生型（SC8）相比，所有株系均表現(xiàn)出生長緩慢，植株矮小，根系生長受抑制。單突變體與的單基因突變體相比，株高稍高但根系發(fā)育相對緩慢;推測主要在根中發(fā)揮作用;而雙突變體、株系相比于野生型和單突變體，根系發(fā)育嚴(yán)重受損，植株低矮，葉片窄小。同時(shí)觀察到的根系受損比嚴(yán)重推測由于突變比率高于（圖8）。初步證明功能存在冗余，影響木薯根的發(fā)育。

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討論

植物進(jìn)行光合作用，在葉片中合成糖類物質(zhì)，這些糖類物質(zhì)從源葉組織經(jīng)過糖轉(zhuǎn)運(yùn)體運(yùn)輸、轉(zhuǎn)運(yùn)到下沉庫組織利用和儲(chǔ)存。這一過程對植物應(yīng)對非生物脅迫和生物脅迫至關(guān)重要。因此，了解糖分配及其遺傳調(diào)控對于實(shí)現(xiàn)突破以提高作物產(chǎn)量和非生物脅迫耐受性至關(guān)重要。KOMAITIS等在蒺藜苜蓿中研究發(fā)現(xiàn)MSTs家族通過調(diào)控糖分的運(yùn)輸，進(jìn)而影響苜蓿根瘤菌對氮的固定。董元花在蘋果中發(fā)現(xiàn)過表達(dá)后，促進(jìn)植株根的生長發(fā)育，同時(shí)抗逆性降低。擬南芥中，利用RNAi干擾沉默和后，切斷對保衛(wèi)細(xì)胞的能量供應(yīng)，抑制光合作用。定位于擬南芥?zhèn)雀Y(jié)點(diǎn)處，和側(cè)根生長相關(guān)。過表達(dá)后增加擬南芥葉片光合作用，從而提高氮的利用率，并且能抑制灰霉病。在水稻中，、、、和在鹽、滲透性和干旱脅迫下高表達(dá)。在小麥中，小麥條銹病可刺激宿主細(xì)胞中的ABA生物合成，從而上調(diào)、和的表達(dá)，從而增加真菌己糖的供應(yīng)，促進(jìn)感染，在大麥中發(fā)現(xiàn)突變體（自然突變的），削弱了己糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性，對銹病和白粉病有一定的抗性，反義沉默也能抑制條銹病的感染。

CRISPR/Cas9是一項(xiàng)特異識(shí)別編輯技術(shù)，僅需gRNA引導(dǎo)序列和Cas9核酸酶即可對靶基因DN序列進(jìn)行剪切編輯，CRISPR/Cas9雙基因編輯已經(jīng)使用于多個(gè)物種。為研究和的生物學(xué)功能，利用CRISPR/Cas9技術(shù)分別設(shè)計(jì)和的靶位點(diǎn)，將2個(gè)靶位點(diǎn)串聯(lián)，構(gòu)建雙基因編輯載體，轉(zhuǎn)化木薯胚性脆性愈傷組織，一個(gè)月后檢測靶點(diǎn)的編輯效率，證明本研究構(gòu)建的雙基因編輯載體pCAMBIA-<！--[if gte vml 1]> <！[endif]--><！--[if ！vml]--><！--[endif]-->1301-Cas9--sgRNA可對和基因同時(shí)編輯，無脫靶現(xiàn)象，說明本研究選擇的2個(gè)靶位點(diǎn)的編輯效率高。將編輯后的脆性胚性愈傷組織誘導(dǎo)成苗，經(jīng)過15 mg/L潮霉素生根篩選和DNA分子檢測得到陽性苗，再將單株陽性苗Hi-TOM測序序列比對分析，成功得到26個(gè)突變體，其中有23株雙突變體，2株突變體，1株突變體，突變體的編輯類型有純和突變、雜合突變、雙等位突變等多種編輯類型，2個(gè)靶位點(diǎn)的突變類型多為單堿基插入或缺失突變，小片段突變率較少，這與前人報(bào)道的編輯現(xiàn)象基本相似。對突變體的表型初步觀察，發(fā)現(xiàn)單突變體和雙突變體的根系生長均受抑制，植株矮小，這與前人報(bào)道的表型相似。初步確定和的功能存在冗余，和均影響木薯的根系發(fā)育，但突變體根系發(fā)育更遲緩，主要在根頂端分生組織中表達(dá)，在須根中特異表達(dá)，推測主要在根系形成發(fā)揮作用，而在根系發(fā)育中起到作用。

本研究通過構(gòu)建CRISPR/Cas9介導(dǎo)的雙基因編輯載體，對和基因同時(shí)進(jìn)行編輯。初步確定和對木薯根系發(fā)育的影響。為后續(xù)研究塊根發(fā)育機(jī)制提供了豐富的材料，而STPs家族在植物應(yīng)對非生物脅迫和抗擊病原菌中也起到關(guān)鍵作用，推測突變體在應(yīng)對非生物脅迫和抵抗病原菌起到作用。本研究對其功能分析尚淺，后續(xù)我們將在大田里篩選可穩(wěn)定遺傳的株系作為研究材料，分析不同階段的木薯根系形態(tài)及地上部分的生長情況，檢測塊根淀粉和糖類物質(zhì)含量，分析和基因其對植物生長發(fā)育的影響;對其突變體進(jìn)行干旱、鹽和低溫脅迫并分析其抗逆性，解析和基因在非生物脅迫中的作用;接種木薯的主要病原菌：細(xì)菌性枯萎病、花葉病、褐斑病、銹病和白粉病，分析突變體對這些病害是否有抗病性。

參考文獻(xiàn)

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