劉明強，張廣智，陳海偉，康學文

(1.蘭州大學臨床醫(yī)學院,甘肅蘭州 730030;2.甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點實驗室, 甘肅蘭州 730030；3.蘭州大學第一醫(yī)院，甘肅蘭州 730001)

椎間盤退變(intervertebral disc degeneration, IVDD)是脊柱退行性疾病的病理基礎(chǔ)，是由多種因素(非生理性壓力載荷、炎癥反應(yīng)、營養(yǎng)供應(yīng)障礙和遺傳)引起的一種慢性復雜的病理狀態(tài)。在日常活動中，椎間盤(intervertebral disc, IVD)受到各種類型[拉伸力、壓力、流體剪切力(fluid shear stress,FSS)]、作用強度及作用時間的壓力載荷，不同的壓力載荷對IVD組織有不同的影響。生理條件下，IVD承受軸向壓力載荷并將壓應(yīng)力擴散，軟骨終板(cartilage endplate, CEP)緩沖壓應(yīng)力并使其均勻分布至髓核(nucleus pulposus, NP)，NP受到壓縮應(yīng)力后，通過其形變能力各向分散到纖維環(huán)(annulus fibrosus, AF)，AF通過拉伸力控制NP形變，以此發(fā)揮IVD對壓力載荷的吸收和傳遞作用，不僅滿足了脊柱活動對IVD的力學要求，而且有助于改善IVD的微環(huán)境，提高NP細胞的活性[1]。Wang等[2]研究表明，循環(huán)機械拉力(cyclic mechanical tension,CMT)可以減輕NP細胞的退變。然而，異常力學載荷與IVDD同樣具有明顯相關(guān)性，脊柱的各種急慢性機械損傷產(chǎn)生強烈的應(yīng)力作用于具有減震功能的IVD，使得IVD細胞暴露于異常壓力載荷下，NP細胞發(fā)生衰老、凋亡和壞死，使其活性降低、數(shù)目減少，細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)由合成代謝向分解代謝轉(zhuǎn)變，這些改變均是IVDD的主要病理過程[3-5]；另外，臨床證據(jù)也表明，有下腰痛的體力勞動者的脊柱壓力載荷明顯高于無癥狀者[6]。然而，力學載荷對IVD細胞，尤其是NP細胞影響的具體機制仍不清楚。為此，本文主要總結(jié)異常力學載荷對IVD細胞，尤其是NP細胞的影響及其作用機制，以期為延緩甚至逆轉(zhuǎn)IVDD提供新的方向。

1 壓力載荷與IVD營養(yǎng)代謝障礙

IVD細胞營養(yǎng)供應(yīng)和乳酸等代謝副產(chǎn)物的清除，主要是通過CEP滲透途徑及外層AF周圍的血管途徑，研究表明，IVD依靠間斷性壓力載荷使?jié)B透壓發(fā)生變化，為生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸提供“泵送”效應(yīng)[7]。然而，異常壓力載荷可加速CEP發(fā)生鈣化、血管退化萎縮，導致滲透系數(shù)及轉(zhuǎn)運速率明顯下降，使得IVD細胞尤其是NP細胞及內(nèi)層AF細胞代謝所需的糖、氧氣，以及其他大分子營養(yǎng)物質(zhì)和乳酸等代謝產(chǎn)物的擴散或排出途徑受阻。NP細胞在酸性低氧微環(huán)境下細胞活性降低、功能細胞數(shù)目減少，ECM合成代謝能力減弱，最終促進IVDD的進展[8,9]。

2 壓力載荷與ECM重塑

在生理條件下，NP細胞可以合成和分泌蛋白聚糖及Ⅱ型膠原分子來維持ECM的平衡及NP組織的含水量以保持IVD組織的正常結(jié)構(gòu)和力學特性；因此，ECM的代謝平衡對延緩IVDD的發(fā)生至關(guān)重要。ECM的降解過程受基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑及解聚蛋白樣金屬蛋白酶(a disintegrins and metalloproteinases with thrombospondin motifs,ADAMTS)的調(diào)控，MMPs、ADAMTS是介導ECM退變的主要蛋白水解酶，當前參與退變的亞型主要是MMP3、MMP13和ADAMTS4、ADAMTS5[10, 11]。ECM合成與分解代謝的平衡與壓力載荷有密切關(guān)系，不同類型及載荷強度的壓力載荷可以通過調(diào)節(jié)MMPs、ADAMTS基因的表達影響ECM的穩(wěn)態(tài)。異常力學載荷使MMPs、ADAMTS基因表達增加，ECM分解代謝超過合成代謝，Ⅱ型膠原、蛋白聚糖含量明顯下降，導致NP組織脫水和纖維化，椎間隙高度下降，IVD結(jié)構(gòu)失穩(wěn)，加速IVDD發(fā)生進程[12]。

3 壓力載荷對NP細胞活性的影響

3.1 調(diào)節(jié)細胞自噬反應(yīng)

自噬是一種高度保守的溶酶體降解途徑，通過選擇性地清除錯誤折疊的蛋白質(zhì)和受損的細胞器，維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。生理條件下，細胞的自噬反應(yīng)處于基礎(chǔ)水平；但在外界不利條件刺激下，自噬反應(yīng)明顯增強[13]。研究表明，自噬功能障礙與骨關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)退行性病變、IVDD等疾病有關(guān)[14-16]。適當水平的自噬反應(yīng)可提供足夠的代謝底物和能量，進而促進壓力載荷作用下NP細胞損傷成分的降解，這可能是一種重要的生存反應(yīng)；而過度的自噬反應(yīng)，可能會引發(fā)自噬性細胞死亡。

壓力載荷可以激活NP細胞自噬反應(yīng)。Ma等[17]研究不同時間靜態(tài)壓力載荷對NP細胞自噬反應(yīng)的影響，通過對1 MPa的靜態(tài)壓力載荷作用下大鼠NP細胞自噬小體及自噬相關(guān)蛋白及細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)的檢測發(fā)現(xiàn)：在36 h之內(nèi)，自噬小體、自噬流、自噬相關(guān)蛋白的表達及ROS的生成隨壓力載荷作用時間延長而增加，但用ROS清除劑預處理之后，NP細胞自噬能力反而下降；然而，使用自噬抑制劑之后，在壓力載荷刺激36 h內(nèi)，NP細胞活性明顯下降，當延長壓力載荷作用時間至48 h以上，細胞活性較未使用自噬抑制劑組升高；上述結(jié)果提示，適當作用時間的靜態(tài)壓力載荷可增加ROS的生成、參與激活自噬反應(yīng)，從而發(fā)揮對細胞的保護作用，然而過長時間的壓力載荷可引起自噬性細胞死亡，減少功能性細胞數(shù)量，降低細胞活性。Li等[3]建立靜態(tài)壓力載荷模型發(fā)現(xiàn)，1 MPa的載荷強度持續(xù)刺激48 h之內(nèi)，可以通過激活Ras/MEK/ERK/NRF1/Atg7信號通路來激活細胞自噬反應(yīng)，減輕壓力載荷誘導的細胞凋亡，從而提高異常壓力載荷下細胞的活性。Chen等[18]研究不同強度FSS對大鼠NP細胞自噬反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)適當?shù)腇SS處理組(12 dyne/cm2,2 h)與空白對照組相比：血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、自噬小體及自噬相關(guān)蛋白明顯增加，說明適當強度的FSS可以通過上調(diào)HO-1來激活細胞自噬反應(yīng)，從而發(fā)揮對細胞的保護作用；然而，載荷過度的FSS(24 dyne/cm2,2 h)可以促進自噬性細胞死亡。上述研究結(jié)果均提示，NP細胞自噬反應(yīng)的適當激活有利于減輕壓力載荷對細胞的損傷，增加細胞的活性，延緩IVDD的進程；而當壓力載荷過強或作用時間過久可引起自噬性細胞死亡，明顯降低NP細胞活性，加速IVDD的進展。

3.2 壓力載荷與細胞凋亡和壞死

細胞凋亡是受高度調(diào)控的細胞死亡形式，主要特征是凋亡小體形成、DNA斷裂、染色質(zhì)濃縮、核碎裂及凋亡蛋白酶的激活。壓力載荷誘導NP細胞的凋亡減少了功能性細胞的數(shù)量，是IVDD中最重要的病理過程之一[19]。Huang等[20]研究人NP間充質(zhì)干細胞在1.0 MPa的靜態(tài)載荷持續(xù)作用下凋亡相關(guān)蛋白的表達及凋亡率的變化，發(fā)現(xiàn)NP細胞凋亡蛋白的表達隨壓力載荷作用時間的延長而增加。Zhao等[21]通過建立體外IVD受力刺激模型，觀察靜態(tài)壓力載荷對NP細胞凋亡的影響，同樣發(fā)現(xiàn)細胞凋亡隨壓力載荷作用時間的延長而增加，通過WB檢測說明，細胞凋亡的發(fā)生與壓力載荷激活Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)。Zhang等[22]研究不同動態(tài)壓力載荷對人NP細胞凋亡反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)壓力過載荷組(0.8 MPa 0.5 Hz作用20 h之后，0.1 MPa 0.5 Hz作用4 h)與其它兩組[壓力載荷組(0.8 MPa 0.5 Hz作用4 h之后，0.1 MPa 0.5 Hz作用20 h)、空白對照組]相比：凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白的表達明顯上升，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達降低，表明壓力過載荷促進NP細胞凋亡；細胞活性在壓力過載荷組下降，在壓力載荷組增加。上述研究提示，異常作用強度及作用時間的壓力載荷促進細胞凋亡反應(yīng)，降低細胞活性，而適當強度的壓力載荷有助于提高細胞活性。

既往研究認為，細胞壞死是由急性損傷導致的被動、非生理性和不可調(diào)節(jié)的細胞死亡形式；但最新研究發(fā)現(xiàn)，壞死是在基因控制下受到高度調(diào)節(jié)的一種死亡形式，壞死性凋亡是依賴受體相關(guān)蛋白激酶(receptor-interacing protein kinase,RIPK)的一種壞死類型。Chen等[23]對大鼠NP細胞施加1.0 MPa的靜態(tài)壓力載荷24 h或36 h后，可發(fā)現(xiàn)NP細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)的破壞及線粒體和細胞內(nèi)ROS的含量增加，RIPK的表達增加，提示NP細胞發(fā)生壞死性凋亡，且與壓力載荷作用時間成正比；抑制RIPK的表達之后，上述改變可減輕，提示壓力載荷可通過增加RIPK的表達誘導線粒體功能障礙和氧化壓力途徑，促進大鼠NP細胞的壞死性凋亡。Chen等[24]將大鼠NP細胞暴露于1 MPa壓力載荷下12 h～48 h，通過觀察細胞形態(tài)、檢測凋亡率、RIPK的變化，發(fā)現(xiàn)隨壓力載荷作用時間延長，細胞發(fā)生皺縮，凋亡蛋白及RIPK表達明顯增加；其結(jié)果同樣提示，RIPK、混合譜系激酶類結(jié)構(gòu)域軸調(diào)節(jié)的壞死性凋亡在壓力載荷誘導的大鼠NP細胞死亡中發(fā)揮重要作用。

總體而言，由壓力載荷誘導NP細胞的死亡具有壓力載荷類型、作用時間的依賴性，非生理性壓力載荷通過調(diào)節(jié)NP細胞的相關(guān)分子和信號通路的表達來調(diào)控其壞死和凋亡，最終加速IVDD的發(fā)生。然而，非生理性壓力載荷誘導IVD細胞死亡的具體機制仍有待進一步研究。

3.3 壓力載荷與細胞衰老

NP細胞的衰老被認為是IVDD的一個新標志。NP細胞的衰老可引起促炎因子、ECM分解代謝酶及趨化因子的分泌增多，促進ECM的退變，誘導IVD微環(huán)境中炎癥因子風暴，最終加速IVDD的進程[25]。相關(guān)研究表明，非生理性壓力載荷可以加速IVD組織中NP細胞的衰老反應(yīng)，并啟動IVDD的發(fā)生[26]。

Wang等[27]將人NP細胞收集并培養(yǎng)在體外壓力模型裝置中，通過設(shè)立空白對照組和高強度壓力載荷組發(fā)現(xiàn)，高強度壓力載荷組細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生明顯增加，線粒體膜電位減少，與線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1的表達減少，SA-β-gal染色呈陽性的細胞數(shù)量顯著增多，衰老相關(guān)蛋白p53、p21和p16的表達增多，提示過高的壓力載荷可通過抑制線粒體功能和線粒體自噬反應(yīng)、促進氧化應(yīng)激途徑來誘導NP細胞發(fā)生衰老。Feng等[28]研究不同強度及作用時間的CMT對大鼠NP細胞衰老的影響，分為拉伸長度5%及20%組，發(fā)現(xiàn)拉伸長度5%時，作用48 h才能增加細胞衰老相關(guān)蛋白的表達，而拉伸20%則顯著增加細胞的衰老且具有時間依懶性；通過細胞免疫熒光、qRT-PCR和WB檢測發(fā)現(xiàn)，20%CMT可通過增加DNA損傷、激活p53-p21-Rb信號通路誘導大鼠NP細胞衰老反應(yīng)，加速IVDD的進程。上述研究均說明，作用于IVD組織的非生理性壓力載荷可通過多種途徑誘導NP細胞的衰老反應(yīng)，促進IVDD的發(fā)生發(fā)展。

4 小結(jié)與展望

IVDD是一種多因素介導的脊柱退行性疾病，IVD細胞尤其是NP細胞發(fā)生衰老、凋亡、壞死及ECM代謝異常，是IVDD的重要特征。研究表明，非生理性壓力載荷是導致IVDD發(fā)生發(fā)展的重要因素。然而，異常壓力載荷誘導IVDD的具體病理機制仍不十分明確，許多研究均停留在細胞水平或動物模型上，且多為大鼠和兔的IVDD模型，無法完全模擬人體IVD內(nèi)生物力學特性及其具體變化；并且，當前異常力學載荷在IVDD中的研究主要集中在NP細胞中，AF及CEP作為IVD中的重要組成部分，與IVDD的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)，但異常力學載荷與AF和CEP的研究仍然十分匱乏。雖然有相關(guān)研究表明，適當壓力載荷可以提高NP細胞活性，延緩IVDD的進展，但同樣無法模擬人體IVD所對應(yīng)的生理性壓力載荷。因此，對NP細胞受到異常力學載荷后，引起生物活性降低、最終導致IVDD的機制研究，異常力學載荷對AF及CEP的研究，及如何設(shè)計構(gòu)建符合人體生物力學特性的IVDD模型，可能是一個重要的方向。筆者相信，今后對生物力學與IVD組織穩(wěn)態(tài)之間的研究將為延緩或逆轉(zhuǎn)IVDD的發(fā)生提供新的理念。