何超平　彭莎　陳博威　李力松　廖端芳

〔摘要〕 目的 探討玉竹多糖對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)衰老小鼠認(rèn)知功能保護(hù)作用的分子機(jī)制。方法 采用水提醇沉法提取玉竹總多糖組分并進(jìn)行含量測(cè)定;將30只昆明小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、玉竹多糖組（2 g/kg）。模型組及玉竹多糖組小鼠每日皮下注射D-半乳糖（150 mg/kg），正常組及模型組每日灌胃等體積生理鹽水，同時(shí)玉竹多糖組小鼠灌胃等體積相應(yīng)劑量的藥物。給藥8周后處死老鼠并收集海馬組織，使用RNA測(cè)序（RNA-Seq）分析各組間差異表達(dá)的mRNAs，篩選玉竹多糖干預(yù)后表達(dá)逆轉(zhuǎn)的mRNAs。通過基因本體分析及京都基因與基因組百科全書通路富集分析差異基因參與的主要生物學(xué)過程，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR， RT-qPCR）驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果。結(jié)果 玉竹多糖提取率為7.12%，含量為81.27%±0.02%。RNA-Seq分析顯示玉竹多糖逆轉(zhuǎn)了衰老小鼠海馬組織19個(gè)mRNAs的表達(dá)，生物信息學(xué)分析顯示這些基因可能通過各類代謝、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)通路及過氧化物酶體增殖物激活受體信號(hào)通路發(fā)揮治療作用，RT-qPCR驗(yàn)證了RNA-Seq結(jié)果中差異基因的準(zhǔn)確性。結(jié)論 玉竹多糖可通過多條信號(hào)通路來(lái)保護(hù)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠的認(rèn)知功能。

〔關(guān)鍵詞〕 玉竹多糖;衰老;RNA-Seq;認(rèn)知障礙;D-半乳糖

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.03.004

〔Abstract〕 Objective To explore the molecular mechanism of Polygonatum odoratum polysaccharide on the cognitive function of D-galactose-induced aging mice. Methods The total polysaccharides of Polygonatum odoratum were extracted by water alcohol precipitation method and the content was determined. 30 KM mice were randomly divided into normal group， model group， and Polygonatum odoratum polysaccharide group. （2 g/kg）. Mice in the model group and Polygonatum odoratum polysaccharide group were injected subcutaneously with D-galactose （150 mg/kg） daily. At the same time， the normal group and model group were gavaged with equal volume of normal saline daily， and mice in the Polygonatum odoratum polysaccharide group were gavaged with equal volume of corresponding dose. After 8 weeks of administration， the mice were sacrificed and hippocampal tissues were collected. RNA sequencing （RNA-Seq） was used to analyze the differentially expressed mRNAs between the groups， and the mRNAs whose expression was reversed after the intervention of Polygonatum odoratum polysaccharide were screened. Through GO function and KEGG pathway enrichment analysis of the main biological processes involved in differential genes， the sequencing results real-time quantitative PCR （RT-qPCR）. Results The extraction rate of Polygonatum odoratum polysaccharide was 7.12%， and the content was 81.27%±0.02%， RNA-Seq analysis showed that Polygonatum odoratum polysaccharide reversed the expression of 19 mRNAs in the hippocampus of aging mice. Bioinformatics analysis showed that these genes may play a therapeutic role through various metabolism， vascular endothelial growth factor signaling pathway and PPAR signaling pathway. RT-qPCR verified the accuracy of RNA-Seq results. Conclusion Polygonatum odoratum polysaccharide may protect the cognitive function of D-galactose-induced aging mice through multiple signaling pathways.

〔Keywords〕 Polygonatum odoratum polysaccharid; aging; RNA-Seq; cognitive impairment; D-galactose

隨著人口老齡化的不斷加劇，衰老相關(guān)疾病發(fā)病率也逐漸增高[1]。衰老是機(jī)體各組織、器官功能隨年齡增長(zhǎng)而發(fā)生的退行性變化，其中神經(jīng)退行性病變是指由于神經(jīng)元進(jìn)行性變性死亡導(dǎo)致的以大腦為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2]。與年齡相關(guān)的大腦退行性病變是大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)在生長(zhǎng)、發(fā)育及成熟之后走向衰老過程中而表現(xiàn)的生物老化的生理現(xiàn)象，其最突出的臨床表現(xiàn)是記憶和學(xué)習(xí)能力下降[3]。目前，如何延緩衰老、改善衰老導(dǎo)致的認(rèn)知障礙已成為研究熱點(diǎn)之一。

玉竹是湖南省道地藥材，具有調(diào)免疫、降血糖、抗衰老等廣泛藥理活性[4]，可治療多種疾病，其主要有效成分為玉竹多糖。課題組前期研究已經(jīng)用行為學(xué)結(jié)果證實(shí)了玉竹多糖改善小鼠認(rèn)知記憶能力的作用效果，發(fā)現(xiàn)玉竹多糖能夠抑制D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，并降低海馬組織中的炎癥因子[5]。但既往研究均是基于單一通路或單一靶點(diǎn)，無(wú)法系統(tǒng)闡明玉竹多糖改善衰老后認(rèn)知功能障礙的分子機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)擬借助RNA-Seq技術(shù)，采用D-半乳糖作為致衰劑，建立小鼠亞急性衰老模型，以系統(tǒng)探討玉竹多糖在生物體內(nèi)抗衰老及改善認(rèn)知障礙的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1? 藥材來(lái)源

玉竹來(lái)源于湖南省邵東縣國(guó)家級(jí)玉竹規(guī)范化種植基地，所有用于實(shí)驗(yàn)的玉竹均經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定為百合科玉竹Polygonatum odoratum （Mill.） Druce。

1.2? 玉竹多糖的提取與測(cè)定

1.2.1? 玉竹多糖的提取? 取上述玉竹干燥根莖大約1000 g，置70 ℃烘箱中干燥12 h，用粉碎機(jī)粉碎，得藥材粗粉。加8倍量水，于80 ℃水浴中回流提取2次，每次2 h，趁熱過濾，合并2次提取的濾液，并減壓濃縮至約20 mL，加4倍量80%乙醇沉淀，離心（r=20 cm，4000 r/min，10 min），沉淀物以無(wú)水乙醇、丙酮依次洗滌3次，每次5 mL，合并濾液，得到玉竹總多糖組分，以60 ℃烘干，稱質(zhì)量，計(jì)算玉竹總多糖得率，備用。

1.2.2? 玉竹多糖脫色、去蛋白? 脫色處理：精密稱取玉竹總多糖1 g，加適量蒸餾水溶解，定容至50 mL容量瓶中，分別緩慢上AB-8大孔樹脂柱，用蒸餾水洗脫，流速1.0 mL/min。取少量洗脫液用Molish反應(yīng)檢測(cè)至無(wú)紫色環(huán)出現(xiàn)或紫色環(huán)顏色明顯變淡，停止洗脫。收集洗脫液，減壓濃縮至200 mL，備用。

木瓜蛋白酶-Sevag法去蛋白：取脫色處理后的玉竹粗多糖洗脫液200 mL，加入0.5%體積的木瓜蛋白酶，攪拌，60 ℃水浴酶解2 h，80 ℃滅酶10 min，放冷，離心20 min，r=20 cm，4000 r/min，棄去沉淀取上清液。將上清液與Sevag試劑（氯仿-正丁醇為4∶1）按4∶1的比例混合振蕩20 min，置分液漏斗中靜置分層，取上清液，再重復(fù)上述操作3次，留上清液測(cè)定玉竹多糖濃度。

1.2.3? 玉竹多糖含量測(cè)定? 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg，加水溶解，并定容于100 mL容量瓶，搖勻，即得濃度為0.200 mg/mL的葡萄糖對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。分別吸取上述不同濃度的對(duì)照品溶液，以試劑做空白對(duì)照，在490 nm處測(cè)定對(duì)照品吸光度值，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下方法測(cè)定樣品中玉竹總多糖吸光度，計(jì)算玉竹多糖含量。

1.3  主要儀器

Illumina測(cè)序平臺(tái)（美國(guó)Illumina公司）;9700型PCR儀（美國(guó)ABI公司）;5418型離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.4? 動(dòng)物與分組

昆明小鼠30只，雄性，體質(zhì)量約18～22 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證SCKX（2016-0002），自由飲水飲食。課題組前期研究表明玉竹多糖以每天2 g/kg干預(yù)療效確切[5]，因此，本研究采用該劑量進(jìn)行干預(yù)。將動(dòng)物隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為正常組、模型組及玉竹多糖組，玉竹多糖組及模型組動(dòng)物分別每天皮下注射D-半乳糖（150 mg/kg）[8]，正常組用等量生理鹽水代替。同時(shí)，玉竹多糖組每天灌胃玉竹多糖，劑量為2 g/kg，正常組與模型組灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)給藥8周。

1.5? 海馬組織取材

小鼠脫頸椎處死后，剪開小鼠的頭皮，暴露出頭部，用直鑷將大腦皮層撥開，暴露出雙側(cè)海馬組織，將海馬組織與大腦皮層及周圍的腦組織分開，取出海馬組織，置于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.6? RNA-Seq檢測(cè)

小鼠麻醉后直接斷頭取腦，冰上操作迅速分離海馬組織，放入預(yù)先盛滿RNA wait液的凍存管中，放入液氮中速凍后按照寄送流程，送至上海派森諾公司進(jìn)行RNA-Seq檢測(cè)。采用Trizol法提取總RNA，RNA濃度及質(zhì)量經(jīng)檢測(cè)合格后，進(jìn)行mRNA純化、片段化及cDNA合成，建立文庫(kù)后上機(jī)測(cè)序。

1.7? 基因本體（gene ontology， GO）分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and

genomes， KEGG）通路富集分析

借助歐易生物云平臺(tái)富集分析模塊（https：//cloud.oebiotech.cn/task/），輸入差異表達(dá)的基因，物種選擇為小鼠，進(jìn)行GO功能及KEGG通路富集分析。GO功能富集分析可描述基因產(chǎn)物可能形式的分子功能、參與的生物過程和所處的細(xì)胞環(huán)境。KEGG通路富集分析通過將已知的基因組注釋信息進(jìn)行分類，得出最顯著的生物學(xué)過程。

1.8? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR， RT-qPCR）驗(yàn)證

將RNA-Seq檢測(cè)后的剩余樣本進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。隨機(jī)選取了5個(gè)差異表達(dá)的核心mRNAs。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格參照試劑盒步驟。海馬組織總RNA的提取采用Trizol法提取，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃，30 s;變性94 ℃，5 s;退火60 ℃，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線反應(yīng)程序：從60 ℃緩慢升溫至97 ℃（20 min）。內(nèi)參基因選用β-actin，使用2-ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，各引物序列詳見表1。

1.9? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用差異倍數(shù)（fold change， FC）≥1.0及P<0.05篩選差異基因。計(jì)量資料均以“x±s”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來(lái)比較多組間均數(shù)，P<0.05說(shuō)明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)用Graphpad Prism 8作圖軟件分析并處理。

2 結(jié)果

2.1 玉竹多糖含量測(cè)定

2.1.1多糖提取率測(cè)定 1000 g玉竹根莖按照物料比1﹕5 g/mL，提取時(shí)間2 h回流2次，提取溫度80 ℃條件下煎煮濃縮醇沉去蛋白，共提取玉竹多糖71.21 g，玉竹多糖提取率為7.12%。

2.1.2? 多糖含量測(cè)定? （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：使用苯酚-硫酸法，以無(wú)水葡萄糖為對(duì)照品，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定對(duì)照品質(zhì)量濃度與吸光度的對(duì)應(yīng)關(guān)系，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得y=0.474 8x-0.010 4，R2=0.999 8，線性范圍為61.80～100.84 μg/mL。（2）多糖含量測(cè)定：按照苯酚-硫酸法測(cè)得玉竹多糖含量，根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=0.474 8x-0.010 4，R2=0.999 8，根據(jù)公式得到多糖含量為：81.27%±0.02%。

2.2? 差異mRNAs的篩選

通過RNA-Seq檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)衰老小鼠海馬組織在衰老后有152個(gè)差異表達(dá)的mRNAs，其中130個(gè)上調(diào)，22個(gè)下調(diào);另外經(jīng)玉竹多糖干預(yù)后，衰老小鼠海馬組織有70個(gè)差異表達(dá)的mRNAs，其中30個(gè)上調(diào)、40個(gè)下調(diào)，詳見圖1A及圖1B。通過對(duì)兩次比較中的差異基因進(jìn)行交集分析表明，玉竹多糖能夠逆轉(zhuǎn)在衰老后表達(dá)失調(diào)的19個(gè)mRNAs的表達(dá)水平，其中9個(gè)mRNAs在衰老后表達(dá)上調(diào)，經(jīng)玉竹多糖干預(yù)后表達(dá)下降;10個(gè)mRNAs在衰老后表達(dá)下調(diào)，經(jīng)玉竹多糖干預(yù)后表達(dá)上升，詳見圖1C及圖1D。推測(cè)這19個(gè)mRNAs可能是玉竹多糖的核心作用靶點(diǎn)。見表2。

2.3? 核心差異mRNA的富集分析

發(fā)現(xiàn)mRNAs GO功能的生物過程主要為神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸、蛋白水解及對(duì)細(xì)胞因子的反應(yīng)等;細(xì)胞組成主要為質(zhì)膜的組成部分、突觸小泡與軸突等;分子功能主要為金屬羧肽酶活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性與膽堿跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等，詳見圖2A。KEGG通路富集分析結(jié)果主要為各類代謝、VEGF信號(hào)通路及PPAR信號(hào)通路等，詳見圖2B。

2.4? 核心差異mRNA的RT-qPCR驗(yàn)證

通過RT-qPCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)H2-B1及Cbp1在模型組中表達(dá)下調(diào)，玉竹多糖能夠逆轉(zhuǎn)其表達(dá)趨勢(shì)（P<0.01或P<0.05）;Aldh1a2、Sphk1及Slc22a2在模型組中表達(dá)上調(diào)，玉竹多糖干預(yù)后與模型組比較能夠下調(diào)其表達(dá)（P<0.01或P<0.05），結(jié)果均與測(cè)序結(jié)果趨勢(shì)一致，證明其結(jié)果具有一定的可靠性，詳見圖3。

3 討論

腦部的衰老會(huì)引起大腦的解剖生理變化，而這些變化會(huì)影響到認(rèn)知功能，尤其是處理速度、工作記憶以及行為的執(zhí)行功能[8]。腦衰老的病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，假說(shuō)主要有Aβ學(xué)說(shuō)、膽堿能學(xué)說(shuō)、氧化應(yīng)激脂代謝異常學(xué)說(shuō)、神經(jīng)炎癥學(xué)說(shuō)和神經(jīng)凋亡學(xué)說(shuō)等[6-9]，因此，衰老是一個(gè)復(fù)雜的過程，針對(duì)這一復(fù)雜過程，中藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)就體現(xiàn)出了獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。

玉竹為滋養(yǎng)肺陰常用中藥，具有多種藥理學(xué)活性，多糖是其有效成分之一，現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為玉竹多糖具有免疫調(diào)節(jié)、降低血糖、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤等廣泛的藥理活性[4]。目前，針對(duì)玉竹多糖治療腦衰老的研究尚未深入，雖然本課題組前期研究已經(jīng)證實(shí)了玉竹多糖可以改善衰老小鼠的認(rèn)知功能障礙[5]，但是對(duì)于玉竹多糖抗腦衰老還需要進(jìn)一步系統(tǒng)性研究。

中草藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)極其復(fù)雜，僅依靠傳統(tǒng)研究方法無(wú)法系統(tǒng)闡明中藥基于“整體觀念”治療的分子機(jī)制。目前，基于高通量測(cè)序的檢測(cè)手段能夠從整個(gè)轉(zhuǎn)錄組水平探討藥物的治療機(jī)制，并已逐漸用于篩選中醫(yī)證候特異性標(biāo)志物及中藥治療機(jī)制研究[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)衰老小鼠海馬組織有152個(gè)差異表達(dá)的mRNAs，玉竹多糖逆轉(zhuǎn)了衰老小鼠海馬組織中19個(gè)mRNAs的表達(dá)，相關(guān)文獻(xiàn)亦證實(shí)了相關(guān)mRNA的作用：如有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Sphk1在衰老小鼠的海馬組織中表達(dá)上調(diào)，抑制Sphk1的表達(dá)可以改善小鼠認(rèn)知功能障礙，并抑制炎癥反應(yīng)[12]。

通過GO功能富集分析與KEGG通路富集，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸、蛋白水解、突觸小泡、金屬羧肽酶活性及轉(zhuǎn)運(yùn)活性等生物過程，VEGF信號(hào)通路及PPAR號(hào)通路等可能與玉竹多糖的抗衰老的機(jī)制密切相關(guān)。VEGF是一種細(xì)胞有絲分裂原，參與了血管生成的生理和病理過程，具有促進(jìn)血管生長(zhǎng)和滲透調(diào)節(jié)等作用[13]。最近的研究表明，在神經(jīng)系統(tǒng)中，VEGF也有保護(hù)神經(jīng)的作用，其對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、軸突的生成等方面也有直接作用。PPAR信號(hào)通路與認(rèn)知功能障礙的氧化應(yīng)激密切相關(guān)。氧化應(yīng)激是指由于氧自由基的產(chǎn)生與清除出現(xiàn)異常致使活性氧蓄積在細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體氧化損傷的過程。機(jī)體正常生命活動(dòng)中，氧化應(yīng)激是基本的調(diào)控保護(hù)機(jī)制，可以調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、組織再生修復(fù)、炎癥免疫應(yīng)答等過程[14-17]。當(dāng)機(jī)體在經(jīng)歷衰老和老化時(shí)，受氧化應(yīng)激影響，反應(yīng)性活性氧簇和反應(yīng)性活性氮簇產(chǎn)生過多，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)就會(huì)失衡，活性物質(zhì)應(yīng)激性反應(yīng)導(dǎo)致組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)，異常的氧化應(yīng)激能引起細(xì)胞或組織的蛋白變性、脂質(zhì)過氧化、DNA損傷和其他生理功能改變，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和組織損傷，是衰老等神經(jīng)退行性疾病的主要危險(xiǎn)因素[18-19]。前期研究結(jié)果表明，衰老的模型小鼠海馬勻漿中超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力均顯著降低，MDA含量顯著升高[20]，用玉竹多糖干預(yù)后，有明顯的改善，提示玉竹多糖可以提高細(xì)胞抗氧化的能力，達(dá)到延緩衰老和抑制氧化損傷的作用[5]。上述報(bào)道表明，玉竹多糖能夠通過多靶點(diǎn)改善衰老后的認(rèn)知功能障礙，也進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究的準(zhǔn)確性。

綜上所述，玉竹多糖能夠通過海馬組織影響

mRNA表達(dá)譜，調(diào)控VEGF信號(hào)通路及PPAR信號(hào)通路，改善衰老后認(rèn)知功能障礙。本研究為進(jìn)一步明確玉竹多糖抗衰老的分子機(jī)制提供了方向。

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