范洪橋　胡金輝　劉麗芳　吳雨薇

〔摘要〕 目的 觀察礬冰納米乳對(duì)增生性瘢痕血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）、血管生成素-1（angiopoietin-1， Ang-1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）與基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2， MMP-2）表達(dá)的影響。方法 通過(guò)燒傷大鼠背部皮膚建立增生性瘢痕模型。144只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、曲安奈德組及低、中、高劑量組（礬冰納米乳8.15、16.3、32.6 mg/mL），每組24只。連續(xù)給藥35 d（除空白對(duì)照組外）。明顯分別在第14、21、28、35天4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)采用空氣栓塞法每組隨機(jī)處死6只大鼠。采用HE染色法檢測(cè)成纖維細(xì)胞數(shù)密度;采用Westernblot檢測(cè)VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)。結(jié)果 與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組比較，模型組成纖維細(xì)胞數(shù)密度及VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)均明顯升高（P<0.05）。除14 d外，與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較，曲安奈德組與低、中、高劑量組成纖維細(xì)胞數(shù)密度及VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05）。與同時(shí)間點(diǎn)曲安奈德組比較，中劑量組成纖維細(xì)胞數(shù)密度及VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05）;低、高劑量組成纖維細(xì)胞數(shù)密度及VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)均升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。模型組中，與前一時(shí)間點(diǎn)比較，成纖維細(xì)胞密度均明顯升高（P<0.05）。曲安奈德組與低、中、高劑量組中，與前一時(shí)間點(diǎn)比較，成纖維細(xì)胞密度均明顯降低（P<0.05）?？瞻讓?duì)照組中，21 d與14 d比較，VEGF、Ang-1、TGF-β1蛋白表達(dá)均明顯升高（P<0.05）;35 d與28 d比較，VEGF、Ang-1、TGF-β1蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05）。模型組中，28 d與21 d比較，TGF-β1蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）;35 d與28 d比較，VEGF、Ang-1蛋白表達(dá)均明顯升高（P<0.05）。曲安奈德組中，28 d與21 d比較，TGF-β1蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）;35 d與28 d比較，TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05）。低劑量組中，35 d與28 d比較，TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05）。中劑量組中，28 d與21 d比較，TGF-β1蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）;35 d與28 d比較，VEGF、Ang-1蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05）。結(jié)論 礬冰納米乳能降低增生性瘢痕模型大鼠成纖維細(xì)胞數(shù)密度及VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)，防治增生性瘢痕，以中劑量礬冰納米乳療效最佳。

〔關(guān)鍵詞〕 礬冰納米乳;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;血管生成素-1;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1;基質(zhì)金屬蛋白酶-2;增生性瘢痕

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R269? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.03.003

〔Abstract〕 Objective To observe the effects of alum ice nanoemulsion on expression of vascular endothelial growth factor （VEGF）， angiopoietin-1 （Ang-1）， transforming growth factor-β1 （TGF-β1） and matrix metalloproteinase-2 （MMP-2） in hypertrophic scar. Methods Hypertrophic scar model was established by burn rat dorsal skin. 144 SD rats （SPF grade） were divided into blank control group， model group， triamcinolone group， low-dose， medium-dose and high-dose group （alum ice nanoemulsion 8.15， 16.3， 32.6 mg/mL）， with 24 rats in each group. Continuous administration for 35 days （except for blank control group）. Six rats in each group were randomly killed by air embolization at 4 different time points on day 14， 21， 28 and 35， respectively. The number density of fibroblasts was detected by HE staining. The protein expression levels of VEGF， ANG-1， TGF-β1 and MMP-2 were detected by Western blot. Results Compared with blank control group at the same time point， the number density of fibroblasts and the protein expression of VEGF， Ang-1， TGF-β1 and MMP-2 were significantly increased in model group （P<0.05）. Compared with model group at the same time point except the day 14， the number density of fibroblasts and the protein expression of VEGF， Ang-1， TGF-β1 and MMP-2 were decreased in triamcinolone group， low-dose， medium-dose and high-dose group （P<0.05）. Compared with triamcinolone group， the number density of fibroblasts and the protein expression of VEGF， Ang-1， TGF-β1 and MMP-2 were decreased in low-dose group at the same time point; the number density of fibroblasts and the protein expression of VEGF， Ang-1， TGF-β1 and MMP-2 were significantly increased in low-dose and high-dose group， and there was no statistical significance （P>0.05）. In model group， compared with the previous time point， the density of fibroblast was significantly increased （P<0.05）. Compared with the previous time point， the density of fibroblasts in triamcinolone group， low， medium and high dose groups was significantly decreased （P<0.05）. In blank control group， the protein expression levels of VEGF， ANG-1 and TGF-β1 were significantly increased on day 21 compared with day 14 （P<0.05）; compared with day 28， the protein expression leves of VEGF and ANG-1 were significantly decreased on day 35 （P<0.05）. In the model group， the expression of TGF-β1 protein was significantly increased on day 28 compared with day 21 （P<0.05）; the protein expression levels of VEGF and ANG-1 were significantly increased on day 35 compared with day 28 （P<0.05）. In triamcinolone group， the expression of TGF-β1 protein was significantly decreased on day 28 compared with day 21 （P<0.05）; compared with day 28， the protein expression levels of TGF-β1 and MMP-2 were significantly decreased on day 35 （P<0.05）. In the low-dose group， the protein expression levels of TGF-β1 and MMP-2 were significantly decreased on day 35 compared with day 28 （P<0.05）. In the medium-dose group， the expression of TGF-β1 protein was significantly decreased on day 28 compared with day 21 （P<0.05）; compared with day 28， VEGF and ANG-1 protein expression levels were significantly decreased on day 35 （P<0.05）. Conclusion Alum ice nanoemulsion can reduce the number density of fibroblasts and the protein expression of VEGF， Ang-1， TGF-β1 and MMP-2 in hypertrophic scar model rats， and prevent hypertrophic scar formation， with the best effect in medium-dose alum ice nanoemulsion.

〔Keywords〕 alum ice nanoemulsion; vascular endothelial growth factor; angiopoietin-1; transforming growth factor-β1;

matrix metalloproteinase-2; hypertrophic scar

增生性瘢痕作為臨床上最常見(jiàn)的病理性瘢痕，主要是由于燒傷后組織過(guò)度再生和細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積所導(dǎo)致，伴有疼痛與瘙癢等不適，也伴有不同程度的外觀的損害和功能的障礙，影響患者的生活和工作質(zhì)量，影響患者的社會(huì)交往。糖皮質(zhì)激素、5-氟尿嘧啶和激光三者聯(lián)合運(yùn)用，被證實(shí)是治療增生性瘢痕的最強(qiáng)搭配[1]，糖皮質(zhì)激素、5-氟尿嘧啶等長(zhǎng)時(shí)間使用都存在不同程度的毒副作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)，增生性瘢痕形成過(guò)程中有大量的新生血管與較明顯的血管密度增加[2-4]。采用藥物抑制血管新生能夠達(dá)到抑制增生性瘢痕形成的效果[5-8]。前期研究發(fā)現(xiàn)，礬冰納米乳能夠激活、促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合且具有防止瘢痕形成的作用[9-10]，推測(cè)礬冰納米乳防治增生性瘢痕的可能作用機(jī)制與抑制血管生成有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立大鼠增生性瘢痕模型，探討礬冰納米乳抑制增生瘢痕形成的作用機(jī)制，為臨床防治瘢痕提供“簡(jiǎn)、便、效、廉”的藥物。

1 材料與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

體質(zhì)量180～220 g的SPF級(jí)SD大鼠，鼠齡6～8周，雌雄不限，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境許可證號(hào)：SYXK（湘）2013-0005。

1.2? 藥品及試劑

礬冰納米乳由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制備（批號(hào)：20190001），采用8.15、16.3、32.6 mg/mL低、中、高3種不同劑量;醋酸曲安奈德乳膏由新和成控股集團(tuán)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：20190311）。小鼠抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）單克隆抗體（批號(hào)：19003-1-AP）、山羊抗血管生成素-1（angiopoietin-1， Ang-1）多克隆抗體（批號(hào)：23302-1-AP）、小鼠抗TGF-β1單克隆抗體（批號(hào)：21898-1-AP）、小鼠抗MMP-2單克隆抗體（批號(hào)：10373-2-AP）均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3? 礬冰納米乳的制備方法

取冰片2.5 g，研細(xì)，加入油酸乙酯6 g，攪拌使其溶解，再向其中加入乳化劑16 g，攪拌混勻，然后向其中緩緩加入蒸餾水，邊加邊攪拌，開(kāi)始時(shí)隨水量增加而變得黏稠呈凝膠狀，繼續(xù)加入蒸餾水至一定量時(shí)變稀，呈透明至半透明狀，并帶淡藍(lán)色乳光。另取白礬13.8 g，氯化鈉9 g，溶于適量蒸餾水中，濾過(guò)，濾液緩緩加入到上述含有冰片等的溶液中，并加蒸餾水至1000 mL，攪拌混勻，濾過(guò)，灌封，于115.5 ℃滅菌30 min，即得16.3 mg/mL的中劑量礬冰納米乳。同量藥物，同樣制備流程，蒸餾水分別加至2000、500 mL則為低、高劑量礬冰納米乳。

1.4? 主要儀器

病理切片機(jī)（型號(hào)：RM2016，上海徠卡儀器有限公司）;顯微鏡、數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（型號(hào)：BA410、Motic Medical 6.0）均購(gòu)自麥克奧迪公司;掃描儀（型號(hào)：V300，愛(ài)普生有限公司）;輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)（型號(hào)：RM2235，德國(guó)萊卡公司）;高速離心機(jī)（型號(hào)：TDL-5-A，上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.5? 造模方法

首先用備皮刀將大鼠背部皮膚剃毛，再用8%Na2S溶液脫毛，然后用清水沖洗干凈，肉眼觀察無(wú)局部損傷。畫(huà)出待燒面積（待燒面積：根據(jù)體質(zhì)量計(jì)算出大鼠的總表面積乘以待燒面積的百分比）;采用3%戊巴比妥鈉（戊巴比妥鈉用量為30 mg/kg）麻醉大鼠;大鼠體位為俯臥位，將四肢用4號(hào)絲線分別固定于手術(shù)臺(tái)兩側(cè)。采用恒溫恒壓電熱燙傷儀，在75 ℃溫度條件下，將一個(gè)直徑為2 cm的圓形燙傷頭置于大鼠背部燒傷10 s，形成大鼠深Ⅱ°燒傷模型[7]。自然愈合后（約21～23 d上皮化）。經(jīng)病理證實(shí)為深Ⅱ°燒傷與增生性瘢痕。見(jiàn)圖1。

1.6? 分組及干預(yù)方法

按照隨機(jī)分組方法，將144只SPF級(jí)SD大鼠分成6組，即空白對(duì)照組、模型組、曲安奈德組、低劑量組（8.15 mg/mL礬冰納米乳）、中劑量組（16.3 mg/mL礬冰納米乳）、高劑量組（32.6 mg/mL礬冰納米乳），每組24只?？瞻讓?duì)照組不進(jìn)行造模處理，其余各組按照造模方法進(jìn)行造模，經(jīng)病理證實(shí)造模成功后24 h，模型組給予0.2 mL生理鹽水，曲安奈德組予以曲安奈德均勻涂抹，直徑約2 cm，厚度約2 mm，低、中、高劑量組分別涂抹相同面積和厚度的低、中、高劑量礬冰納米乳，每天2次，每次0.2 mL，連續(xù)給藥35 d。

1.7? 標(biāo)本采集

分別在第14、21、28、35天4個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)用空氣栓塞法每組隨機(jī)處死6只大鼠，用手術(shù)刀在大鼠背部距離瘢痕邊緣0.5 cm處切取圓形的瘢痕組織（空白對(duì)照組相同部位取同樣大小的皮膚組織）。取材后，大鼠退出實(shí)驗(yàn)。一部分標(biāo)本在瘢痕最高點(diǎn)縱行切片，每張切片厚度約5 μm，石蠟包埋后，保存?zhèn)溆?。另一部分?biāo)本快速放入凍存管中密封后，放置于-80 ℃冰箱中保存，待3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的標(biāo)本全部收集后統(tǒng)一進(jìn)行Western blot檢測(cè)分析。

1.8? 指標(biāo)檢測(cè)

1.8.1? HE染色計(jì)算成纖維細(xì)胞數(shù)密度? 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;用Weigert氏蘇木素染色約20 min;用蒸餾水洗滌約10 min;用Van Gieson氏染色液染色約1 min;丟棄染液，用95%酒精急速分化約數(shù)秒鐘;無(wú)水酒精分化與脫水，透明，封固;生物顯微鏡下攝取圖像，圖片采集分析。

1.8.2? Western blot檢測(cè)VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2的蛋白表達(dá)? 將瘢痕組織，用干凈的剪刀盡量剪碎，勻漿、離心后提取上清液，采用BCA蛋白濃度測(cè)定。按照說(shuō)明書(shū)要求配置濃縮膠及分離膠，進(jìn)行蛋白電泳后采用半干轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉、一抗（1∶500） 4 ℃孵育、二抗（1∶1000）室溫孵育、TBST漂洗后顯影及曝光。用EPSON掃描儀掃描膠片，將圖像輸入計(jì)算機(jī)，并對(duì)目標(biāo)條帶的蛋白灰度值，利用Image J軟件檢測(cè)與分析。同時(shí)設(shè)置β-actin為內(nèi)參照。

1.9? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理與分析。對(duì)計(jì)量資料采用“x±s”描述，采用頻數(shù)及百分比描述計(jì)數(shù)資料。符合正態(tài)分布和方差齊性，則采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)多樣本單因素方差分析，否則則采用多樣本秩和檢驗(yàn)。以P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1? 對(duì)成纖維細(xì)胞數(shù)密度的影響

與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組比較，模型組成纖維細(xì)胞數(shù)密度均明顯升高（P<0.05）。除14 d外，與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較，曲安奈德組及低、中、高劑量組成纖維細(xì)胞數(shù)密度均明顯降低（P<0.05）。與同時(shí)間點(diǎn)曲安奈德組比較，中劑量組成纖維細(xì)胞數(shù)密度均明顯降低（P<0.05）?？瞻讓?duì)照組中，與前一時(shí)間點(diǎn)成纖維細(xì)胞密度比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。模型組中，與前一時(shí)間點(diǎn)比較，成纖維細(xì)胞密度均明顯升高（P<0.05）。曲安奈德組與低、中、高劑量組中，與前一時(shí)間點(diǎn)比較，成纖維細(xì)胞密度均明顯降低（P<0.05）。見(jiàn)表1、圖2。

2.2? 對(duì)VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)的影響

與同時(shí)間點(diǎn)空白對(duì)照組比較，模型組VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2的蛋白表達(dá)均明顯升高（P<0.05）。與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較，曲安奈德組及低、中、高劑量組VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05）。與同時(shí)間點(diǎn)曲安奈德組比較，中劑量組VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05）;低、高劑量組VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)均升高，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）?？瞻讓?duì)照組中，21 d與14 d比較，VEGF、Ang-1、TGF-β1蛋白表達(dá)均明顯升高（P<0.05）;35 d與28 d比較，VEGF、Ang-1、TGF-β1蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05）。模型組中，28 d與21 d比較，TGF-β1蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.05）;35 d與28 d比較，VEGF、Ang-1蛋白表達(dá)均明顯升高（P<0.05）。曲安奈德組中，28 d與21 d比較，TGF-β1蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）;35 d與28 d比較，TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05）。低劑量組中，35 d與28 d比較，TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05）。中劑量組中，28 d與21 d比較，TGF-β1蛋白表達(dá)明顯降低（P<0.05）;35 d與28 d比較，VEGF、Ang-1蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05）。見(jiàn)圖3-10。

3 討論

增生性瘢痕可由深度燒傷、嚴(yán)重外傷或感染后皮膚的異常修復(fù)引起[11-12]，主要是由于真皮內(nèi)成纖維細(xì)胞異常增生及細(xì)胞外間質(zhì)沉積過(guò)多。治療增生性瘢痕有諸多方法與藥物，但多數(shù)治療手段均存在副作用，原因在于增生性瘢痕確切的發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，所以闡明增生性瘢痕的發(fā)病機(jī)制與尋求治療增生性瘢痕的中藥已成為迫切需要。研究發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕與正常皮膚相比，VEGF與微血管密度明顯升高[13]，說(shuō)明增生性瘢痕與血管生成關(guān)系密切。VEGF參與包括血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、存活與血管新生等血管生成的幾乎所有步驟[14-15]。VEGF在增生期瘢痕中呈高表達(dá)，抗VEGF治療可顯著減少血管生成，降低增生性瘢痕的形成的概率[16-18]。繼VEGF后，血管生成素是調(diào)節(jié)血管生長(zhǎng)和保持血管穩(wěn)定性的另一個(gè)重要因子。有研究[19]發(fā)現(xiàn)VEGF、Ang-1、Ang-2、Tie-2的表達(dá)在早期瘢痕中顯著升高，表明Ang/Tie-2系統(tǒng)促進(jìn)創(chuàng)傷的正常愈合和瘢痕形成。TGF-β1具有多種生物學(xué)作用，它不僅有助于傷口的正常愈合，而且與多種纖維化疾病和增生性瘢痕有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)與正常皮膚組織相比，增生性瘢痕中TGF-β1 mRNA呈高表達(dá)，提示TGF-β1可促進(jìn)增生性瘢痕的形成[20-21]。在增生性瘢痕形成的過(guò)程中起關(guān)鍵作用的是細(xì)胞外基質(zhì)。MMP-2的活性能夠促進(jìn)增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的遷移能力[22]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)均明顯高于空白對(duì)照組（P<0.05），與上述研究結(jié)果一致。

礬冰納米乳是以本院院內(nèi)制劑礬冰液為基礎(chǔ)藥物，納米乳為載體，以水相載白礬、油相載冰片制備成的水包油型復(fù)合納米乳。它對(duì)礬冰液分散不均勻，易結(jié)晶等不足進(jìn)行了改進(jìn)。前期發(fā)現(xiàn)礬冰納米乳具有良好的促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合及防止瘢痕形成的作用[9]，但預(yù)防瘢痕的具體作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步將礬冰納米乳作用于大鼠增生性瘢痕模型，結(jié)果顯示曲安奈德與不同劑量礬冰納米乳都能明顯降低成纖維細(xì)胞數(shù)密度及VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)（P<0.05）。與曲安奈德組比較，中劑量組成纖維細(xì)胞數(shù)密度及VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2蛋白表達(dá)均明顯降低（P<0.05），表明中劑量組可以明顯抑制增生性瘢痕組織中的血管生成，達(dá)到防治增生性瘢痕的目的。

綜上所述，礬冰納米乳可以抑制大鼠增生性瘢痕形成，這種影響可能是礬冰納米乳具有抑制增生性瘢痕血管生成相關(guān)因子VEGF、Ang-1、TGF-β1、MMP-2表達(dá)的作用，但具體的作用機(jī)制有待于深入研究。

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