祁 芳 劉 星 錢群麗 周佳欣 姚春霞 宋衛(wèi)國(guó)*

(1.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306； 2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海 201403)

蔬菜是消費(fèi)者日常健康飲食不可或缺的食物類別。近年來(lái)，消費(fèi)者越來(lái)越關(guān)注所食用蔬菜的品質(zhì)和產(chǎn)地，愿意為高質(zhì)量蔬菜(如有機(jī)蔬菜)支付高的價(jià)格，且對(duì)于同品質(zhì)蔬菜，消費(fèi)者更信任本地蔬菜，愿意為之支付更高價(jià)格[1-2]。蔬菜產(chǎn)地通常由其外包裝信息獲取，但為謀取不正當(dāng)利益的標(biāo)簽虛假標(biāo)識(shí)給消費(fèi)者和監(jiān)管機(jī)構(gòu)識(shí)別蔬菜真實(shí)產(chǎn)地帶來(lái)困擾。為解決這一問(wèn)題，有學(xué)者基于不同產(chǎn)地蔬菜營(yíng)養(yǎng)組分差異利用有機(jī)成分含量分析方法[3]、光譜技術(shù)[4]、多元素技術(shù)[5]等來(lái)識(shí)別蔬菜產(chǎn)地，也有學(xué)者基于不同產(chǎn)地蔬菜栽培過(guò)程中碳氮?dú)溲趿蚍€(wěn)定同位素的分餾，利用穩(wěn)定同位素技術(shù)來(lái)追溯蔬菜的真實(shí)產(chǎn)地[6]。這些方法中，蔬菜的穩(wěn)定同位素比值(主要是δ13C、δ15N、δ2H、δ18O和δ34S值)與產(chǎn)地環(huán)境和投入品使用信息緊密相關(guān)，一定程度上已成為蔬菜固有的無(wú)形“特征”或“指紋”，因而已在蔬菜產(chǎn)地真實(shí)性判別上應(yīng)用[7-8]。如利用δ13C、δ15N、δ2H、δ18O和δ34S值來(lái)識(shí)別地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品金香大蒜的產(chǎn)地真實(shí)性，金香大蒜與阿根廷、泰國(guó)、越南及中國(guó)貴州和海南產(chǎn)大蒜的識(shí)別率超過(guò)89.5%[9]，還有利用粗纖維中δ13C和δ18O值實(shí)現(xiàn)日本、墨西哥和新西蘭來(lái)源的煮熟和加工過(guò)的南瓜產(chǎn)地溯源的研究[10]；我們前期也基于δ13C、δ15N、δ2H和δ18O值開(kāi)展了長(zhǎng)三角地區(qū)上海、安徽和浙江2省1市27種424個(gè)來(lái)自基地的蔬菜樣品產(chǎn)地溯源，產(chǎn)地識(shí)別率不低于85.7%[11]。但是由于市場(chǎng)上實(shí)際出售的蔬菜來(lái)源廣泛，穩(wěn)定同位素技術(shù)在排除多地蔬菜干擾來(lái)保證某一特定產(chǎn)地真實(shí)性上的應(yīng)用能力仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

因此，本研究以上海市場(chǎng)常見(jiàn)蔬菜生菜、茼蒿、辣椒、番茄和黃瓜為對(duì)象，依據(jù)不同產(chǎn)地蔬菜的地理氣候環(huán)境及投入品使用差異導(dǎo)致的13C、15N、2H和18O穩(wěn)定同位素自然豐度分餾差異，應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)和化學(xué)計(jì)量學(xué)方法開(kāi)展上海本地產(chǎn)5種蔬菜的真實(shí)性判別研究，為保證蔬菜產(chǎn)地真實(shí)性提供參考方法，為監(jiān)管機(jī)構(gòu)的監(jiān)測(cè)能力提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2021年1月至年7月，共采集上海大型超市136個(gè)有代表性的蔬菜樣品，具體見(jiàn)表1。

表1 蔬菜類別及產(chǎn)地

穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)USGS90(δ2H=-13.9‰±2.4‰，δ18O=35.90‰±0.29‰)、USGS91(δ2H=-45.7‰±7.4‰，δ18O=21.13‰±0.44‰)和USGS40(δ13C=-26.389‰±0.042‰，δ15N=-4.5‰±0.1‰)購(gòu)于美國(guó)Reston穩(wěn)定同位素實(shí)驗(yàn)室；B2157(δ13C=-27.21‰±0.13‰，δ15N=2.85‰±0.17‰)購(gòu)于Elemental Microanalysis 公司(英國(guó))；錫杯、銀杯等購(gòu)于賽默飛世爾科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EA Isolink型元素分析儀、253Plus型穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀和ConFloⅣ型連續(xù)流接口裝置(賽默飛世爾科技公司)；WXTS3DU 型電子天平(梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司)；SCIENTZ-18N冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；HR3865 飛利浦破壁料理機(jī)(飛利浦(中國(guó))投資有限公司)；HK-02A型粉碎機(jī)(廣州旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

將采集的蔬菜樣品去雜、打漿后倒入樣品罐放于-18 ℃冰箱預(yù)凍至少6 h，再置于-54 ℃冷凍干燥至少120 h，干燥后置于干燥器中備用。

1.3.2 碳和氮穩(wěn)定同位素比值測(cè)定

稱取1.0 mg左右蔬菜樣品于錫杯(4 mm×4 mm×11 mm)中，編號(hào)后置于EA Isolink元素分析儀的自動(dòng)進(jìn)樣盤上進(jìn)行分析；當(dāng)樣品中碳氮元素經(jīng)燃燒分別轉(zhuǎn)化為CO2和N2，適當(dāng)稀釋后進(jìn)入253Plus穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀檢測(cè)。儀器參數(shù)：元素分析儀燃燒爐溫度980 ℃，色譜柱溫度60 ℃，載氣流速180 mL/min，參考?xì)饬魉?0 mL/min吹掃進(jìn)樣口。

1.3.3 氫和氧穩(wěn)定同位素測(cè)定

稱取1.0 mg左右蔬菜樣品于銀杯(4 mm×4 mm×11 mm)中，編號(hào)后放入元素分析儀自動(dòng)進(jìn)樣盤中，待蔬菜樣品中氫氧元素高溫裂解分別轉(zhuǎn)化為H2和CO，適當(dāng)稀釋后進(jìn)入穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。儀器參數(shù)：元素分析儀高溫裂解爐溫度1 450 ℃，載氣流速100 mL/min，參考?xì)饬魉?00 mL/min。

1.3.4 穩(wěn)定同位素比值

穩(wěn)定同位素比值用δ表示，是將已知穩(wěn)定同位素比值的標(biāo)準(zhǔn)品作為參照來(lái)計(jì)算未知樣本穩(wěn)定同位素的相對(duì)值。公式如式(1)所示：

(1)

式中，R樣品為樣品中重同位素與輕同位素的豐度比，即13C /12C、15N/14N、2H/1H和18O/16O；R標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)樣品中重同位素與輕同位素的豐度比。測(cè)試數(shù)據(jù)均采用兩點(diǎn)校正法進(jìn)行處理定值，即δ13C和δ15N值采用B2157和USGS40標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)值校正，δ2H和δ18O值采用USGS90和USGS91標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)值校正。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析和模型建立

上海及其他產(chǎn)地蔬菜的δ13C、δ15N、δ2H和δ18O值間總差異應(yīng)用Matlab軟件(R2009a 美國(guó) Mathworks公司)進(jìn)行方差分析[12]，P<0.05表明統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異顯著；不同產(chǎn)地蔬菜間穩(wěn)定同位素比值差異分布通過(guò)Excel(Office365 美國(guó)Microsoft公司)中的箱線圖進(jìn)行描述性分析；通過(guò)無(wú)監(jiān)督算法主成分分析(Principal component analysis，PCA)來(lái)分析不同產(chǎn)地蔬菜的聚類情況[13]，利用有監(jiān)督的偏最小二乘判別分析(Partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)來(lái)構(gòu)建不同產(chǎn)地蔬菜的真實(shí)性判別模型[14]，由SIMCA軟件(14.1 瑞典Umetrics公司)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 上海與其他產(chǎn)地蔬菜的同位素特征

上海與其他產(chǎn)地蔬菜的δ13C、δ15N、δ2H和δ18O值(均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)分布差異見(jiàn)表2和圖1。所有蔬菜的δ13C值均低于-22‰，且上海蔬菜的δ13C值與其他產(chǎn)地差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明所采蔬菜樣品光合作用類型一樣，均屬于C3植物，且水分供給情況、光照強(qiáng)度及栽培環(huán)境污染狀況對(duì)上海蔬菜δ13C值的綜合影響與其他產(chǎn)地蔬菜相似[8，15]。上海蔬菜的δ15N均值為5.49‰，有48.61%蔬菜的δ15N值高于5.00‰，而其他產(chǎn)地只有28.12%蔬菜的δ15N值高于5.00‰，這在一定程度上說(shuō)明上海蔬菜栽培過(guò)程施用有機(jī)肥的比例更高，綠色和/或有機(jī)蔬菜比例也可能更高。因?yàn)槭卟说摩?5N值主要受栽培過(guò)程所施用肥料類型的影響，施用有機(jī)肥的非固氮蔬菜可能有更高的δ15N值，一般高于5.00‰，而施用化學(xué)肥料的非固氮蔬菜δ15N值一般低于3.00‰[16-19]。蔬菜的δ2H和δ18O值主要受灌溉水源水、蒸騰和蒸發(fā)作用的影響，一般隨著緯度增加、海拔升高、海洋到內(nèi)陸距離(大陸效應(yīng))增加，灌溉水的δ2H和δ18O值會(huì)越來(lái)越低，而蒸騰和蒸發(fā)作用則使得地表灌溉水和陸生植物的18O更富集[15]。上海蔬菜的δ2H值(-56.60‰)低于其他產(chǎn)地，這可能主要?dú)w因于很多其他產(chǎn)地蔬菜的緯度較上海更低(表2)；而上海蔬菜的δ18O值(24.95‰)略微高于其他產(chǎn)地蔬菜，可能歸因于上海的低海拔與相對(duì)高的蒸騰和/或蒸發(fā)作用綜合。雖然上海蔬菜的δ15N、δ2H和δ18O均值與其他產(chǎn)地蔬菜差異顯著(P<0.05)，但是由于蔬菜中包含5個(gè)類別，不同產(chǎn)地總蔬菜的穩(wěn)定同位素比值的標(biāo)準(zhǔn)偏差變化范圍較大，尤其是δ15N和δ2H值(圖1)，說(shuō)明不同類別蔬菜的不同產(chǎn)地間穩(wěn)定同位素豐度差異可能不同，這也使得僅通過(guò)單個(gè)穩(wěn)定同位素值的差異很難將上海和其他產(chǎn)地所有蔬菜類別很好地識(shí)別。因此，需要對(duì)蔬菜進(jìn)行分類比較。

表2 上海與其他產(chǎn)地蔬菜的碳氮?dú)溲醴€(wěn)定同位素比值

圖1 不同產(chǎn)地蔬菜的δ15N和δ2H值分布(其中“×”表示均值；“-”表示中位值；“?！北硎酒娈愔?Figure 1 Nitrogen and hydrogen stable isotope values of vegetables from different regions where “×” represents mean values；“-” represents median values；“。” represents suspected outliers.

5種蔬菜的δ13C值在上海與其他產(chǎn)地間均差異不顯著，這與總的蔬菜δ13C值一致；除了黃瓜外，上海蔬菜均有相對(duì)高的δ15N值，且茼蒿和番茄的δ15N值在上海和其他產(chǎn)地間差異顯著(P<0.05)，分別有66.67%和50.00%的上海茼蒿和番茄δ15N值高于5.00‰，而其他產(chǎn)地茼蒿和番茄的δ15N值均低于此值，進(jìn)一步說(shuō)明所采集的上海蔬菜中施用有機(jī)肥的比例高[18-19]；上海茼蒿和辣椒有相對(duì)更負(fù)的δ2H值，但只有辣椒的δ2H值與總蔬菜一致，在上海和其他產(chǎn)地間差異顯著(P<0.05)，上海辣椒有70%的δ2H值低于-50.00‰，而其他產(chǎn)地僅有20.83%辣椒低于此值，說(shuō)明辣椒的δ2H值是引起總蔬菜δ2H值在上海和其他產(chǎn)地間存在顯著差異的重要因素，這可能與辣椒的其他產(chǎn)地如福建、廣西、海南等所處的低緯度相關(guān)；除了茼蒿，上海蔬菜有相對(duì)更高的δ18O值，且番茄的δ18O值在上海和其他產(chǎn)地間差異顯著(P<0.05)，上海番茄有78.57%的δ18O值高于24.00‰，而其他產(chǎn)地番茄只有38.46%高于此值，這可能歸因于上海的低海拔、相對(duì)低的緯度、距離海洋近及相對(duì)高的蒸騰和/或蒸發(fā)作用。由上可知，生菜和黃瓜的穩(wěn)定同位素比值在上海和其他產(chǎn)地間差異均不顯著，通過(guò)單個(gè)穩(wěn)定同位素比值的差異僅可將部分上海茼蒿、番茄和辣椒與其他產(chǎn)地區(qū)分開(kāi)。因此，需要借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法將所有同位素信息綜合起來(lái)提高蔬菜產(chǎn)地真實(shí)性判別的正確率。

2.2 基于PCA的上海蔬菜產(chǎn)地識(shí)別

PCA是將多個(gè)變量通過(guò)正交變換轉(zhuǎn)化為少數(shù)綜合變量(即主成分)來(lái)表征原變量信息的一種無(wú)監(jiān)督學(xué)習(xí)方法，主成分保留了原有變量的大部分信息，其得分圖在一定程度上反映了不同數(shù)據(jù)集的聚類，可以通過(guò)原變量對(duì)主成分的貢獻(xiàn)(即載荷變量)來(lái)反映其在主成分中的重要性[13，20-21]，上海和其他產(chǎn)地不同類別蔬菜的PCA載荷變量及得分圖見(jiàn)圖2。PCA前兩個(gè)主成分對(duì)原始變量的解釋能力為0.609，基本包含了碳氮?dú)溲醴€(wěn)定同位素的數(shù)據(jù)信息。對(duì)第一個(gè)主成分(為0.327，保留了最多原變量信息)影響大的變量為δ2H和δ18O值，對(duì)第二主成分(為0.284，保留的原變量信息次之)影響大的變量為δ15N值，這與方差分析結(jié)果一致，說(shuō)明蔬菜栽培過(guò)程的灌溉水源水、蒸騰和蒸發(fā)作用及所施用肥料類型的差異是導(dǎo)致上海和其他產(chǎn)地蔬菜穩(wěn)定同位素比值差異的主要因素[8，15]。

由前兩個(gè)主成分得分圖知，只有5個(gè)上海生菜相對(duì)聚集(圖2b綠色圈)，其他生菜較均勻地分布在4個(gè)象限內(nèi)；茼蒿均分布在第一主成分的左側(cè)，有7個(gè)上海茼蒿相對(duì)聚集(圖2b淺藍(lán)色菱形)；辣椒多分布在第一主成分的右側(cè)，除了2個(gè)其他產(chǎn)地辣椒(圖2b深藍(lán)色正方形)聚集外，上海辣椒和其他產(chǎn)地辣椒不能被明顯區(qū)分；6個(gè)上海番茄聚集(圖2b黃色倒三角)，其他番茄較均勻地聚集；上海和其他產(chǎn)地黃瓜也沒(méi)有明顯的聚集，這些結(jié)果說(shuō)明PCA可以將組間差異明顯的樣本區(qū)分[13]，如生菜、辣椒、番茄和茼蒿的圈內(nèi)外樣品，但很難將組間差異不明顯的蔬菜進(jìn)行產(chǎn)地判別，如黃瓜樣品。因而，PCA很難將上海蔬菜與其他產(chǎn)地蔬菜進(jìn)行完全識(shí)別，需要運(yùn)用有監(jiān)督的算法PLS-DA來(lái)實(shí)現(xiàn)不同類別蔬菜產(chǎn)地真實(shí)性判別。

2.3 PLS-DA判別上海蔬菜產(chǎn)地真實(shí)性

PLS-DA是一種基于偏最小二乘的有監(jiān)督算法，可以通過(guò)變量權(quán)重反映不同變量間關(guān)系，發(fā)現(xiàn)不同類別間的異同點(diǎn)，并通過(guò)人為賦值有效區(qū)分不同類別[13-14]，每個(gè)類別的上海蔬菜和其他產(chǎn)地蔬菜的真實(shí)性判別結(jié)果見(jiàn)表3，影響模型判別結(jié)果的重要變量(VIP)見(jiàn)表4。最優(yōu)PLS-DA模型對(duì)上海生菜的排他性判別正確率為100.00%，其他產(chǎn)地生菜的判別率較低。此時(shí)，第一主成分對(duì)原變量的解釋能力為0.40，VIP變量順序?yàn)棣?8O>δ13C>1>δ15N>δ2H，說(shuō)明不同產(chǎn)地生菜的水分蒸騰和/或蒸發(fā)作用及光照強(qiáng)度可能存在較大差異[8，15，22]。PLS-DA模型也可以很好地實(shí)現(xiàn)茼蒿(判別正確率91.67%)和番茄(判別正確率85.71%)的產(chǎn)地真實(shí)性判別，由VIP值知對(duì)模型貢獻(xiàn)最大的變量均為δ15N值(分別為1.73和1.48)，說(shuō)明上海和其他產(chǎn)地的茼蒿和番茄所施用的肥料存在顯著差異，這也與方差分析結(jié)果一致(表2)。雖然上海辣椒的產(chǎn)地真實(shí)性判別正確率為60.00%，但其他產(chǎn)地辣椒的判別正確率為100.00%，說(shuō)明該P(yáng)LS-DA模型可以很好地排除市場(chǎng)上其他產(chǎn)地的辣椒虛假標(biāo)識(shí)；δ2H值(1.67)對(duì)該模型的貢獻(xiàn)最大，說(shuō)明辣椒產(chǎn)地判別主要是依據(jù)緯度效應(yīng)導(dǎo)致的灌溉水源水中氫同位素分餾的差異。上海和其他產(chǎn)地黃瓜的產(chǎn)地判別正確率分別為50.00%和78.57%，說(shuō)明發(fā)生黃瓜產(chǎn)地混淆的可能性較高，δ18O值(1.87)對(duì)該模型的貢獻(xiàn)最大，說(shuō)明了不同產(chǎn)地黃瓜生長(zhǎng)過(guò)程中灌溉水來(lái)源、水分蒸騰和/或蒸發(fā)作用可能存在差異[8，15]。上述結(jié)果證實(shí)了碳氮?dú)溲跬凰乇戎到Y(jié)合PLS-DA可以較好地實(shí)現(xiàn)生菜、茼蒿、番茄和辣椒的產(chǎn)地真實(shí)性判別，但是由于樣品數(shù)量及不同產(chǎn)地蔬菜實(shí)際栽培過(guò)程多因素差異導(dǎo)致的穩(wěn)定同位素比值的復(fù)雜變化，上海蔬菜產(chǎn)地真實(shí)性模型，尤其是黃瓜，仍需進(jìn)一步改善。

圖2 PCA載荷變量圖(a)及得分圖(b)Figure 2 The loading variable plot (a) and score plot (b) of PCA.

表3 PLS-DA模型分類結(jié)果

表4 PLS-DA的第一個(gè)主成分VIP值

3 結(jié)論

通過(guò)δ13C、δ15N、δ2H和δ18O值結(jié)合單因素方差分析、箱線圖、PCA和PLS-DA對(duì)上海市場(chǎng)常見(jiàn)蔬菜生菜、茼蒿、辣椒、番茄和黃瓜的產(chǎn)地真實(shí)性進(jìn)行分析和判別。上海蔬菜與其他產(chǎn)地蔬菜的δ15N、δ2H和δ18O值差異顯著，且茼蒿的δ15N值、辣椒的δ2H值、番茄的δ15N和δ18O值在上海和其他產(chǎn)地間差異顯著，說(shuō)明上海與其他產(chǎn)地蔬菜在所施用的肥料類型、灌溉水源水、蒸騰和蒸發(fā)作用方面存在較大差異。PCA很難將組間差異不明顯的蔬菜進(jìn)行產(chǎn)地聚類，PLS-DA模型很好地實(shí)現(xiàn)了上海生菜(判別準(zhǔn)確率100.0%)、茼蒿(判別正確率91.67%)和番茄(判別正確率85.71%)的產(chǎn)地真實(shí)性判別，辣椒的PLS-DA模型也可以很好的避免其他產(chǎn)地辣椒(判別正確率100.0%)錯(cuò)誤標(biāo)識(shí)上海辣椒，但是黃瓜的PLS-DA模型仍需進(jìn)一步改善。這些結(jié)果說(shuō)明穩(wěn)定同位素技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)及化學(xué)計(jì)量學(xué)方法可以實(shí)現(xiàn)特定產(chǎn)地蔬菜的真實(shí)性判別，但因不同產(chǎn)地氣候地理環(huán)境和投入品使用的差異及樣品數(shù)量有限，后續(xù)需要增加不同產(chǎn)地蔬菜的水、肥、土等樣品的穩(wěn)定同位素自然豐度信息，并不斷增加蔬菜樣品數(shù)量來(lái)提高蔬菜產(chǎn)地真實(shí)性判別模型的通用性。