張玉娟 葉惠榮 袁惠玲 王永霞

廣東省東莞市人民醫(yī)院乳腺科，廣東東莞 523000

不同分子標(biāo)記的乳腺癌亞型對(duì)治療的反應(yīng)和預(yù)后均存在較大差異，如何早期診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后是乳腺癌研究的熱點(diǎn)問(wèn)題[1-2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）是長(zhǎng)度大于200 個(gè)核苷酸的RNA 分子，具有結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、介導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)及結(jié)合mRNA 抑制翻譯過(guò)程等生物學(xué)作用[3-5]。LncRNA 參與包括癌變?cè)趦?nèi)的多種疾病狀態(tài)，在肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌等惡性腫瘤中異常表達(dá)，與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA ROR（long noncoding RNA ROR，LncRNA ROR）是新近發(fā)現(xiàn)的LncRNA 分子，具有調(diào)節(jié)多能干細(xì)胞自我更新和分化的功能，子宮內(nèi)膜癌、肝癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)LncRNA ROR 表達(dá)異常[9]。基礎(chǔ)研究顯示，LncRNA ROR/轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）途徑激活促進(jìn)裸鼠乳腺癌細(xì)胞增殖和侵襲[10]。研究顯示，膀胱癌等腫瘤LncRNA ROR和TGF-β1 水平與血清表達(dá)均呈明顯正相關(guān)，血清LncRNA ROR 和TGF-β1 的價(jià)值逐漸引起臨床醫(yī)師重視，但血清LncRNA ROR 和TGF-β1 水平與乳腺癌病理特征及預(yù)后因素的相關(guān)性鮮見(jiàn)報(bào)道[11]。本研究通過(guò)分析乳腺癌和健康女性血清LncRNA ROR與TGF-β1水平，分析兩種標(biāo)志物與乳腺癌病理特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018 年1 月至2019 年6 月在廣東省東莞市人民醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）經(jīng)病理學(xué)確診的73 例乳腺癌患者作為研究組（A 組），其中中高分化47 例，低分化26 例；Ⅰ期24 例，Ⅱ期23 例，Ⅲ期26 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37 例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36 例；表型：人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）陽(yáng)性14 例，三陰性18 例，Luminal 41 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理或組織學(xué)檢查確診為乳腺癌；②年齡≥20 歲，初次確診為乳腺癌，血清LncRNA ROR 和TGF-β1 檢查前未接受放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療；③患者對(duì)本研究知情并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心肝腎等功能不全；②合并其他部位原發(fā)性惡性腫瘤；③合并自身免疫性或急慢性傳染?。虎苋焉锘虿溉槠趮D女；⑤精神疾病或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙。隨機(jī)抽取同期在我院就診的經(jīng)病理證實(shí)的37 例乳腺良性病變（包括乳腺腺病21 例，乳腺纖維腺瘤8 例，乳腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀瘤8 例）為對(duì)照1 組（B 組），隨機(jī)抽取同期健康體檢的37 名健康受試者作為對(duì)照2 組（C 組）。A、B、C 組受試者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 三組一般資料比較

1.2 研究方法

受試者入組后抽取空腹靜脈血，采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）法檢測(cè)血清LncRNA ROR 水平，首先采用Triol 法（試劑盒購(gòu)自Biosharp 公司，貨號(hào)：20180911）提取血漿中總RNA，鑒別濃度和純度后，以1 μg RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（complementary deoxyribonu cleic acid，cDNA），嚴(yán)格按照TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自紅榮微再上海生物工程技術(shù)有限公司，貨號(hào)：20180821）說(shuō)明實(shí)施。qRT-PCR 反應(yīng)體系為cDNA 0.2 μl，2×SYBR 5 μl，ROXⅡ0.2 μl，正反向引物各0.5 μl，RNA-free 水3.6 μl，總反應(yīng)體系體積10 μl。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min、95℃變性30 s、62℃退火30 s、70℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行定量分析。ROR 的正向引物序列：5’-CTCCAGCTATGCAGACCACTC-3’，反向引物：5’-GTGACGCCTGACCTGTTGAC-3’；GAPDH 的正向引物序列：5’-AATGGACAACTGGTCGTGGAC-3’，反向引物：5’-CCCTCCAGGGGATCTGTTTG-3’。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清TGF-β1 水平，采用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定受試者腫瘤標(biāo)志物水平，腫瘤標(biāo)志物包括糖類抗原153（carbohy drate antigen 153，CA153）和癌胚抗原（carcinoembry onic antigen，CEA），試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，貨號(hào)：20181016（TGF-β1）、20180721（CA153）和20181204（CEA），嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，正常參考值范圍：CEA≤5 ng/L，CA153 ≤25 U/ml。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察三組受試者血清LncRNA ROR 和TGF-β1水平和LncRNA ROR與TGF-β1 診斷乳腺癌的臨床價(jià)值；觀察A 組年齡（≤50 歲、＞50 歲）、病理學(xué)分級(jí)（中、高分化，低分化）、臨床分期（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（是、否）、表型（HER-2、三陰性、Luminal）等不同預(yù)后因素患者LncRNA ROR 和TGF-β1 水平的差別。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t 法，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman 相關(guān)分析，采用受試者工作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC 曲線）計(jì)算LncRNA-ROR 和TGF-β1 預(yù)測(cè)乳腺癌的價(jià)值，曲線下面積（area under the curve，AUC）比較采用Z 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組受試者LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比較

A 組LncRNA ROR 和TGF-β1 水平高于B 組和C 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；B 組和C 組LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 三組受試者LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比較（）

表2 三組受試者LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比較（）

注與B 組比較，aP ＜0.05；與C 組比較，bP ＜0.05。LncRNA ROR：長(zhǎng)鏈非編碼RNA ROR；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

2.2 LncRNA ROR與TGF-β1 的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)性分析顯示，LncRNA ROR與TGFβ1 呈正相關(guān)（r=0.897，P ＜0.05）。

2.3 三組受試者腫瘤標(biāo)志物水平比較

A 組CA153、CEA 水平高于B 組和C 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；B 組CA153 和CEA 水平高于C 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 受試者腫瘤標(biāo)志物水平比較（）

表3 受試者腫瘤標(biāo)志物水平比較（）

注與B 組比較，aP ＜0.05；與C 組比較，bP ＜0.05。CA153：糖類抗原153；CEA：癌胚抗原

2.4 不同指標(biāo)預(yù)測(cè)乳腺癌的臨床價(jià)值比較

LncRNA ROR 和TGF-β1 預(yù)測(cè)乳腺癌的AUC 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=0.536，P=0.592），LncRNA ROR 預(yù)測(cè)乳腺癌的AUC 高于CA153 和CEA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=3.158、3.152，P=0.002、0.000）；TGF-β1預(yù)測(cè)乳腺癌的AUC 高于CA153 和CEA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=2.372、2.594，P=0.018、0.010）。見(jiàn)表4、圖1A。以表4 中截?cái)嘀底鳛榕卸?yáng)性依據(jù)，LncRNA ROR：陽(yáng)性＞1.45，陰性：≤1.45；TGF-β1 陽(yáng)性：＞17.84 μg/ml，陰性：≤17.84 μg/ml。LncRNAROR 和TGF-β1 均陽(yáng)性預(yù)測(cè)乳腺癌的特異性為98.65%，高于二者單一預(yù)測(cè)的特異性值；LncRNA ROR 陽(yáng)性或TGF-β1 陽(yáng)性預(yù)測(cè)乳腺癌的靈敏度為100%，高于二者單一預(yù)測(cè)的靈敏度值。見(jiàn)表4、圖1B。

圖1 不同指標(biāo)預(yù)測(cè)乳腺癌的ROC 曲線

表4 不同指標(biāo)預(yù)測(cè)乳腺癌的臨床價(jià)值比較

2.5 乳腺癌患者不同臨床特征LncRNA ROR 和TGFβ1 表達(dá)水平比較

不同年齡、分化程度、表型乳腺癌患者血清LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；不同臨床腫瘤分期乳腺癌患者LncRNA ROR 和TGF-β1 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者血清LncRNA ROR 和TGF-β1水平均高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 乳腺癌患者不同臨床特征LncRNA ROR和TGF-β1 表達(dá)水平比較（）

表5 乳腺癌患者不同臨床特征LncRNA ROR和TGF-β1 表達(dá)水平比較（）

注 LncRNA ROR：長(zhǎng)鏈非編碼RNA ROR；TGF-β1：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；HER-2：人表皮生長(zhǎng)因子受體-2

3 討論

多項(xiàng)研究[12-14]顯示，LncRNA 通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)修飾因子或核不均一核糖核蛋白結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá)，部分LncRNA 介導(dǎo)的功能破壞失調(diào)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，LncRNA 在腫瘤患者診斷和預(yù)后評(píng)估方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。LncRNA ROR 長(zhǎng)2591 nts，又稱為L(zhǎng)incRNA-ST8SIA3，位于18q21.31，是p53 對(duì)DNA 損傷反應(yīng)的強(qiáng)負(fù)性調(diào)節(jié)因子，其過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致miRNA與相應(yīng)基因之間的負(fù)調(diào)控，與上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、侵襲和化療耐藥相關(guān)[15]。

近年來(lái)的研究[16-21]顯示，LncRNA ROR與胃癌、膽囊癌、非小細(xì)胞肺癌、肝細(xì)胞癌、胰腺導(dǎo)管腺癌等多種癌癥發(fā)生相關(guān)，上述腫瘤組織和LncRNA ROR 表達(dá)高于正常組織，LncRNA ROR 表達(dá)升高的程度與腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移和增殖呈正相關(guān)，但其影響腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲等生物學(xué)行為的機(jī)制尚未完全闡明。對(duì)乳腺癌來(lái)說(shuō)，細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致預(yù)后較差、病死率高的重要原因，而EMT 是這個(gè)過(guò)程的重要環(huán)節(jié)[22]。LncRNA ROR 是EMT 的重要陽(yáng)性調(diào)節(jié)因子，體外研究顯示，LncRNA ROR 上調(diào)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，體內(nèi)研究則可促進(jìn)免疫缺陷小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移[23]。TGF-β1 是誘導(dǎo)EMT 的重要誘導(dǎo)因子，可通過(guò)特異性識(shí)別下游細(xì)胞信使因子Smad2/3，使其磷酸化并與Smad4 形成寡聚體，并在細(xì)胞核內(nèi)與基因啟動(dòng)子結(jié)合，促使靶基因轉(zhuǎn)錄[24]。研究顯示，TGF-β1 可通過(guò)誘導(dǎo)EMT 促進(jìn)包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤轉(zhuǎn)移，在多種腫瘤組織中呈高表達(dá)[25]。Hou 等[26]研究顯示，LncRNA ROR 過(guò)度表達(dá)可通過(guò)影響TGF-β1 信號(hào)通路活性促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及裸鼠腫瘤生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，在乳腺癌患血清中表現(xiàn)為L(zhǎng)ncRNA ROR 和TGF-β1 異常高表達(dá)，與Hou 等[26]研究中LncRNA ROR 和TGF-β1 的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示LncRNA ROR 和TGF-β1 預(yù)測(cè)乳腺癌的AUC 高于CA153 和CEA，提示LncRNA ROR 和TGF-β1 可能是乳腺癌潛在的生物標(biāo)志物，鑒于本研究病例數(shù)有限，LncRNA ROR 和TGF-β1 和傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物CA153和CEA 預(yù)測(cè)乳腺癌的臨床價(jià)值差異尚需要進(jìn)一步納入更多病例進(jìn)行論證。二者聯(lián)合檢測(cè)的結(jié)果顯示，LncRNA ROR 和TGF-β1 均陽(yáng)性作為預(yù)測(cè)因子，可提高特異性，有助于減少假陽(yáng)性率，LncRNA ROR 和TGF-β1 之一陽(yáng)性作為預(yù)測(cè)因子，可提高靈敏度，有助于減少假陰性率，結(jié)果提示，LncRNA ROR 和TGF-β1可能是乳腺癌潛在的生物標(biāo)志物，二者不同聯(lián)合方式有助于乳腺癌的確診和排除。

臨床研究[27]顯示，TGF-β1與乳腺癌患者腫瘤分期相關(guān)，臨床分期Ⅲ期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中TGF-β1 水平顯著升高。本研究結(jié)果同樣顯示，不同臨床腫瘤分期增加和是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者之間LncRNA ROR 和TGF-β1 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），這與既往研究[27]中TGF-β1 促進(jìn)乳腺癌發(fā)展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究一致。本研究結(jié)果顯示，患者血清LncRNA ROR 和TGF-β1 表達(dá)與患者年齡、腫瘤分化程度等無(wú)關(guān)，與既往研究一致。HER2 是一種185 kD 的糖蛋白，20%～30%初診浸潤(rùn)性乳腺癌顯示HER2 陽(yáng)性[28-29]。Merry 等[30]曾用HER2陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞體外培養(yǎng)研究LncRNA與HER2 陽(yáng)性乳腺癌之間的關(guān)系，該研究發(fā)現(xiàn)僅三種LncRNA（linc-STARD6-2、linc-GJA1-2 和linc-SLC39A10-10）表達(dá)與HER2 表達(dá)相關(guān)，不包括LncRNA ROR。Luo 等[31]曾對(duì)乳腺癌不同表現(xiàn)LncRNA 功能多態(tài)性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，LncRNA 功能多態(tài)性與雌激素受體、HER-2表達(dá)不存在相關(guān)性。本研究未觀察到LncRNA ROR 和TGF-β1與乳腺癌表現(xiàn)型的相關(guān)性，與既往研究一致。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，血清LncRNA ROR和TGF-β1 可能是乳腺癌潛在的生物標(biāo)志物，患者血清LncRNA ROR 和TGF-β1 表達(dá)與臨床腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，對(duì)預(yù)后判定具有一定參考價(jià)值。