歐榮清　嚴(yán)汝慶　習(xí)君　蔡驊琳　劉謀澤　吳嘉敏　王峰

摘要：目的 ：建立短檢驗結(jié)果回報時間、高自動化的二維液相色譜（2D-LC-UV）法測定人血漿中卡泊芬凈濃度并應(yīng)用于臨床。方法：全自動二維液相色譜法測定人血漿中卡泊芬的凈血漿濃度。結(jié)果：卡泊芬凈在0.30～15.22μg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，r=0.999，定量限0.30μg·mL-1，方法回收率為96.34%～100.72%，提取回收率為94.89%～97.31%，日內(nèi)、日間精密度RSD 均小于7%（n=5），血漿樣品在處理過程中較穩(wěn)定。結(jié)論 ：本方法操作簡單、準(zhǔn)確、靈敏、自動化程度高，符合生物樣品測定要求，可用于卡泊芬凈血漿濃度測定。

關(guān)鍵詞：全自動二維液相色譜;卡泊芬凈;治療藥物監(jiān)測

[Abstract] Objective： To establish a two-dimensional liquid chromatography （2D-LC-UV） method with short test results return time and high automation for the determination of carpofungin concentration in human plasma and apply it in clinic. Methods： The net plasma concentration of carpofen in human plasma was determined by automatic two dimensional liquid chromatography. Results： The method recoveries were 96.34%-100.72%， the extraction recoveries were 94.89%-97.31%， and the quantitation limit was 0.30μg·mL-1， r=0.999. RSDS of intra-day and intra-day precision were all less than 7% （n=5）， and plasma samples were stable in the treatment process. Conclusion： The method is simple， accurate， sensitive and highly automated， which meets the requirements of biological sample determination and can be used for the determination of plasma concentration of carpofen net.

【 Key words 】 Automatic two-dimensional liquid chromatography; Carpofungin; Therapeutic drug monitoring

【中圖分類號】G644.5???????????? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A???????????? 【文章編號】2107-2306（2022）1--03

卡泊芬凈是第一個上市的棘白菌素類抗真菌藥物，通過非競爭性抑制葡聚糖合成酶，干擾真菌細(xì)胞壁內(nèi)（1，3）-β-D-葡聚糖合成，導(dǎo)致真菌細(xì)胞壁通透性增加發(fā)揮抗真菌作用?？ú捶覂粼隗w內(nèi)受肝功能不全、低蛋白血癥、多器官功能衰竭以及藥物間相互作用等因素影響，個體間血藥濃度差異大。為提高抗真菌感染療效，有必要測定血漿中卡泊芬凈濃度，開展治療藥物監(jiān)測（TDM），實現(xiàn)精準(zhǔn)用藥。

1 儀器與試劑

1.1儀器

二維液相色譜（2D-LC-UV），由FLC-2420全自動二維液相色譜耦合儀（湖南德米特儀器有限公司 ）和LC-20AT高效液相色譜部件（日本島津株式會社 ）構(gòu)成;TDZ4-WS 低速臺式離心機(jī)（湖南長沙平凡儀器儀表有限公司）;XW-80A 漩渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司）;Wini-15k 高速離心機(jī)（杭州奧盛儀器有限公司）;GH-202 電子分析天平（日本 AND）;Milli-Q超純水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）;容聲冰箱。

FLC-2420全自動二維液相色譜耦合儀通過微流控系統(tǒng)將色譜泵、進(jìn)樣器、檢測器等色譜部件耦合在一起，構(gòu)成第一維液相色譜系統(tǒng)（LC1）與第二維液相色譜系統(tǒng)（LC2）;LC1主要負(fù)責(zé)樣品在線富集及第一維分離，LC2主要負(fù)責(zé)樣品進(jìn)一步分離測定，樣品通過微流控系統(tǒng)從LC1 轉(zhuǎn)移至LC2，完成分析過程;兩維系統(tǒng)通過智能流路控制系統(tǒng)（TRS）連接，采用“中心切割”模式及中間柱轉(zhuǎn)移目標(biāo)物，見圖1。

1.2試劑與藥品

卡泊芬凈標(biāo)準(zhǔn)品;甲醇、乙腈;磷酸、磷酸銨;純凈水為純水儀所制（不低于GB17323執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)）?？瞻籽獫{和患者血漿由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院臨床科室提供。

2.方法

2.1色譜條件

第一維液相色譜系統(tǒng)（LC1）色譜柱為Aston? SX1（氰基柱3.5*25mm，5μm），流動相為甲醇：乙腈：10mmol?L-1磷酸銨水溶液=1：1：10 （V：V：V），調(diào)PH至4.50，流速為0.60mL?min-1;中間色譜柱為Aston SCB（C83.0*10mm，2.8μm），輔助流動相為純化去離子水;第二維液相色譜系統(tǒng)（LC2）色譜柱為Aston MSCB（C183.0*50mm，3.3μm），流動相為水（含1.0mmol?L-1磷酸氫二銨水溶液，磷酸調(diào)pH至7.40）：水（1.0mmol?L-1磷酸氫二銨水溶液，磷酸調(diào)pH至3.00）：甲醇：乙腈=18：34：7：41 （V：V：V：V），測定波長為225nm。測定流程：色譜耦合儀通過預(yù)設(shè)的時間程序，自動將色譜狀態(tài)分為富集凈化、捕獲、轉(zhuǎn)移和分析。富集凈化：一維色譜柱對樣品進(jìn)行萃取和第一維分離;捕獲：目標(biāo)物即將通過一維色譜柱時，中間柱開始截取目標(biāo)物;轉(zhuǎn)移：中間柱將目標(biāo)物轉(zhuǎn)移至二維色譜柱;分析：二維色譜柱繼續(xù)對樣品分離和分析，中間柱和一維柱在LC1在線清洗（表1）。輔助流動相流速由時間程序控制，在萃取和轉(zhuǎn)移時通過增加一維流路的極性，將目標(biāo)物富集于色譜柱中避免流失。目標(biāo)物進(jìn)入二維柱后，立即啟動中間柱與一維柱清洗程序，保證系統(tǒng)連續(xù)分析時的可靠性。

系統(tǒng)工作狀態(tài)

一維色譜柱工作，進(jìn)行樣品初級分離

中間柱與一維色譜柱連通，捕獲樣品中目標(biāo)組分。

二維色譜柱與中間柱連通，分離測定樣品中目標(biāo)組分;中間柱和萃取柱在線清洗

2.2 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)品儲備液的配制：精密稱取卡泊芬凈標(biāo)準(zhǔn)品1.43mg，純化去離子水溶解并定容至25mL，得到濃度為54.80μg·mL-1的卡泊芬凈標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，置-20℃冰箱保存，使用前恢復(fù)至室溫并渦旋振蕩混勻。

質(zhì)控溶液的配制：精密吸取不同量卡泊芬凈標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，空白血漿定容至10mL，配制成濃度為0.61、8.65、13.39μg·mL-1的低、中、高濃度質(zhì)控溶液，置于-20℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品：精密吸取不同量卡泊芬凈標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，空白血漿定容至10mL，使?jié)舛确謩e為0.30、1.00、2.00、5.02、10.04、15.22μg·mL-1，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品前處理

EDTA抗凝管采集全血后經(jīng)3000 rpm離心5 min，取上清液400μL置1.5mL EP管內(nèi)，加入1000μL乙腈，渦旋振蕩1min，14500rpm離心8min，取上清液1200μL加入進(jìn)樣瓶，進(jìn)樣800μL。

3結(jié)果

3.1 二維色譜圖與專屬性

在“2.1”項色譜條件下，卡泊芬凈保留時間約為9.71 min，血漿內(nèi)源性物質(zhì)及合并用藥不干擾樣品的測定（見圖2）。

A.空白血漿（blank plasma）? B.卡泊芬凈標(biāo)準(zhǔn)溶液（13.39μg·mL）? C.空白人血漿加入卡泊芬凈（LLOQ）（0.30μg·mL） D. 卡泊芬凈與氟康唑聯(lián)合用藥患者血樣色譜圖

3.2線性范圍和定量限

將“2.2”項下標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，按“2.3”項下方法處理，按“2.1”項下方法測定，以卡泊芬凈的峰面積（Y， mau*s]）對卡泊芬凈濃度（X， μg·mL）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：

Y= 281.127X，r =0.999

卡泊芬凈在0.30～15.22μg·mL濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，定量下限濃度為0.30μg·mL，信噪比S/N=10，能夠滿足臨床卡泊芬凈血藥濃度測定要求。

3.3定量方法

采用外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，將測得的卡泊芬凈樣品峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算濃度。每工作批隨行測定低、中、高質(zhì)控溶液。

3.4.回收率與精密度

3.4.1 轉(zhuǎn)移回收率與精密度

轉(zhuǎn)移回收率和精密度是體現(xiàn)藥物在2D-LC-UV中準(zhǔn)確、穩(wěn)定傳遞的重要指標(biāo)。2D-LC-UV可對測定過程中每一步轉(zhuǎn)移進(jìn)行監(jiān)控，其中LC2 條件模式用于考察目標(biāo)物單獨(dú)經(jīng)過二維柱的出峰情況，LC1條件模式用于考察目標(biāo)物單獨(dú)經(jīng)過一維柱的情況，目標(biāo)物從一維柱轉(zhuǎn)移至二維柱，通過中間柱進(jìn)行傳遞。其中中間柱在一維系統(tǒng)的保留能力以及中間柱在二維系統(tǒng)的洗脫能力是轉(zhuǎn)移過程的關(guān)鍵之一。取適量54.80μg·mL卡泊芬凈標(biāo)準(zhǔn)品儲備液在“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，進(jìn)樣體積10μL，得到的峰面積與其在 LC2 條件模式下得到的峰面積比較，考察目標(biāo)物在2D-LC-UV中的轉(zhuǎn)移回收率和精密度。設(shè)置 6 組平行樣本，測得轉(zhuǎn)移回收率為98.71%，RSD為1.25%。結(jié)果表明卡泊芬凈在2D-LC-UV中轉(zhuǎn)移回收率高且穩(wěn)定。

3.4.2 方法回收率和精密度

配制卡泊芬凈濃度分別為0.61、8.56、13.39 μg·mL的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿樣品各5份，按“2.3”項下處理，按“2.1”項下色譜條件測定，將測得的卡泊芬凈色譜峰面積A代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算各樣品中卡泊芬凈濃度，連續(xù)測定3批，方法回收率在96.34%～100.72%，日間、日內(nèi)精密度<7%，表明方法回收率與精密度符合生物樣品分析要求。

3.4.3 提取回收率

將濃度為54.80μg·mL-1卡泊芬凈標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別用二維流動相、空白血漿用稀釋10倍，按“2.3”項下處理，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，分別進(jìn)樣5次，計算兩者峰面積比值（提取回收率=空白血漿稀釋樣品峰面積/二維流動相稀釋樣品峰面積*100%），得提取回收率為94.89%～97.31%，表明本方法的提取回收率符合生物樣品分析要求。

3.4.4樣品在線處理能力

全自動2D-LC-UV通過在線萃取提高測定靈敏度，但一維色譜柱載樣量具有上限，因此進(jìn)樣量過大時，會發(fā)生柱上擴(kuò)散現(xiàn)象。本文2D-LC-UV色譜條件下卡泊芬凈定量限為0.30μg·mL，為提高靈敏度，需將進(jìn)樣量增大至800μL，才能滿足最低點(diǎn)信噪比S/N=10的要求。如圖4所示，本系統(tǒng)進(jìn)樣量增加至800μL時，峰面積成線性變化，因此本方法設(shè)定進(jìn)樣量為800μL，與普通色譜系統(tǒng)進(jìn)樣量20μL比較，靈敏度可提高40倍。

3.5穩(wěn)定性考察

取低、中、高濃度質(zhì)控溶液，分別在室溫放置24h、4℃放置24h、反復(fù)凍融 3 次以及-20℃冷凍保3d，按“2.3”項下處理，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，考察卡泊芬凈穩(wěn)定性，結(jié)果見表5。結(jié)果表明血漿中卡泊芬凈在室溫放置24小時后降解20%以上;4℃放置24h降解10%以上，反復(fù)凍融3次以及在-20℃下保存3d卡泊芬凈較穩(wěn)定，降解比例均小于5%。

4 討論

質(zhì)譜法檢測測定人血漿中卡泊芬凈濃度快速、靈敏度高，但質(zhì)譜儀及同位素內(nèi)標(biāo)試劑價格昂貴，檢測成本高，且每次測定前需清洗離子源，操作復(fù)雜，重復(fù)性稍差。

二維液相色譜法簡化了樣品前處理過程，分離能力強(qiáng)，適用于高通量檢測，被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜樣品及血藥濃度分析。本文建立的全自動二維液相色譜系統(tǒng)（2D-LC-UV）測定人血漿中卡泊芬凈的方法，在12min內(nèi)完成測定，樣本前處理步驟少，操作簡單，結(jié)果易重復(fù);樣品進(jìn)入二維分析柱前已初步分離凈化，雜質(zhì)干擾小，高度自動化極大降低了人工操作誤差;方法的專屬性、定量限、準(zhǔn)確度、精密度、回收率能夠滿足血漿中藥物濃度準(zhǔn)確定量的要求;使用外標(biāo)法就能精準(zhǔn)定量，無添加內(nèi)標(biāo)物等繁瑣操作，批量測定臨床樣本的可操作性更強(qiáng)。

綜上所述，該方法測定成本低、自動化程度高、測定快速、靈敏度及準(zhǔn)確性好，可作為卡泊芬凈TDM及其藥物代謝動力學(xué)研究的有效方法。

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通訊作者：王峰，男，主要從事色譜自動化及生物樣本分析研究。Tel：（0731）85292099，E-mail：roitech@126.com