李亭玉 劉 行 李一權 李文杰 李善智 王 政 于 桐 于成東 孟 媛 李太元 李 霄 金寧一（延邊大學農學院，延吉 133000）

肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的癌癥，并且其發(fā)病率和病死率呈迅速上升的趨勢，分別占整個癌癥的11.6%和18.4%［1］。肺癌細胞表面可表達多種蛋白，其中程序性死亡分子配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）是主要的免疫抑制蛋白之一，主要調節(jié)人體免疫功能，可以與免疫細胞表面的程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）相結合，減弱免疫細胞的活性和功能，從而抑制機體的免疫應答，協(xié)助腫瘤的發(fā)生、轉移和免疫逃逸。當前人類腫瘤免疫療法的熱點之一就是抗PD-L1的免疫療法，并且有望成為免疫治療的重要手段［2］。

溶瘤病毒（oncolytic viruses，OVs）既可以單獨作為溶瘤劑，又可以作為抗癌基因的有效載體，是一種很有前途的抗腫瘤制劑，目前一些OVs 的種類已經被用于抗腫瘤制劑，如腺病毒、痘苗病毒、單純皰疹病毒、新城疫病毒、細小病毒等數(shù)十種［3］。其中對腺病毒的研究最為廣泛，目前常用的腺病毒載體是5 型腺病毒和2 型腺病毒［4］，但是不利的腫瘤微環(huán)境會影響溶瘤腺病毒發(fā)揮溶瘤效果，溶瘤腺病毒載體并不能完全消除腫瘤，如何改造腺病毒載體以提高溶瘤腺病毒的療效及特異性和安全性是目前臨床備受關注的問題。

端粒酶是一種核糖核蛋白酶，具有逆轉錄酶活性。人端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）作為端粒酶的限速成分，在端粒酶的活化中發(fā)揮決定性的作用［5］。多數(shù)正常人體細胞端粒酶活性被抑制，但在大部分人類惡性腫瘤中能觀察到hTERT 高度表達和端粒酶激活，因此癌細胞獲得了無限的增殖能力［6］。這為腫瘤的治療創(chuàng)建了新方法。在過去的研究中本課題組已經利用hTERT 的特性構建了能夠特異性殺傷腫瘤細胞的重組腺病毒（Ad-hTERTp-E1a，Ad-T）［7］。在其他研究中本課題組已經表明重組腺病毒對其他幾種腫瘤細胞具有顯著的殺傷作用［8-11］。本研究利用重組腺病毒Ad-T 下調腫瘤細胞PD-L1 的表達，并驗證其對肺癌細胞的增殖抑制及凋亡誘導作用，為今后肺癌治療提供理論依據，并探索肺癌治療的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料 溶瘤腺病毒及人小細胞肺癌細胞株（NCI-H446）、人鱗狀細胞肺癌細胞株（NCI-H226）、人肺癌細胞株（A549）由所在軍事醫(yī)學研究院軍事獸醫(yī)研究所分子病毒學與免疫學實驗室保存。結晶紫染色液購自Beyotime 公司，WST-1 購自Roche公司，Hoechst、JC-1 購自Invitrogen 公司，PD-L1 及GAPDH兔單克隆抗體購自CST公司。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR 法檢測重組腺病毒Ad-T 對NCI-H446、NCI-H226、A549 細 胞PL-L1 表達的影響 將對數(shù)生長期的3 種細胞以2.5×105個/孔鋪在6 孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，用Ad-Mock、Ad-T各100 MOI 感染3 種細胞，培養(yǎng)24 h、48 h。到達培養(yǎng)時間后按照生工RNA 提取試劑盒進行提取、定量，常規(guī)方式反轉錄為cDNA。以cDNA 為模板用于PCR 擴增。PCR 反應條件：預熱變性95℃5 min；變性94℃5 s；退火62℃30 s；延伸72℃30 s，共40個循環(huán)。每個樣品設定3 個復孔，PD-L1 的Ct 值經內參基因GAPDH 標準化后，采用2-ΔΔCt公式比較各組間PD-L1 的表達情況，引物序列：PD-L1 正向5'-AGC?TATGGTGGTGCCGACTA-3'，反向5'-CAGATGACTTCGGCCTTGGG-3'，GAPDH 正向5'-GACCCCTTCATTGACCTCAACTA-3'，反 向5'-GAATTTGCCATGGGTGGAAT-3'。

1.2.2 Western blot 法驗證重組腺病毒Ad-T 對NCI-H446、NCI-H226、A549 細 胞PL-L1 表達的影響 將對數(shù)生長期的3 種細胞以5×105個/孔鋪在6 孔板中，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，用Ad-Mock、Ad-T各100 MOI分別感染3種細胞，培養(yǎng)24 h和48 h。到達培養(yǎng)時間后采用蛋白質提取試劑盒提取蛋白，BCA 蛋白質測定試劑盒測定蛋白濃度并定量，加入5×SDS 蛋白上樣電泳緩沖液，100℃加熱10 min 后冷卻備用。每孔等量蛋白上樣，進行SDS-PAGE 凝膠電泳，并將蛋白轉至PVDF 膜上，用TBST 配制的5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗PD-L1（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）4℃孵育過夜，充分洗膜后加入二抗，室溫孵育30 min，ECL顯影。

1.2.3 重組腺病毒Ad-T 對NCI-H446、NCI-H226、A549細胞的抑制作用

1.2.3.1 結晶紫法 將對數(shù)生長期的3 種細胞以2.5×105個/孔鋪在12孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，用Ad-Mock、Ad-T 各100 MOI 分別感染3 種細胞，培養(yǎng)24 h和48 h。取上述孔板，棄去每孔上清液，用無菌PBS 沖洗3 次，每孔加入500 μl 0.4%結晶紫染色液，室溫靜置染色10 min吸出染色液，PBS沖洗3次，晾干并拍照分析。

1.2.3.2 WST-1 法 將處于對數(shù)生長期的3 種細胞以5×103個/孔鋪在96 孔板中，每孔培養(yǎng)體積為100 μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，用Ad-Mock、Ad-T 各100 MOI分別感染3種細胞，分別培養(yǎng)24 h和48 h后棄掉培養(yǎng)液，每孔加入100 μl WST-1稀釋液（1∶9稀釋的WST-1 染色液）在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育90 min，對照孔處理方法同上，用酶標儀在450 nm振蕩20 s，測每孔的OD值。按照如下公式計算其抑制率：細胞增殖抑制率（%）=（對照孔OD 值-處理孔OD值）/對照孔OD值×100%。

1.2.4 重組腺病毒Ad-T 對NCI-H446、NCI-H226、A549細胞凋亡水平的影響

1.2.4.1 Hoechst 法 將蓋玻片放在6 孔板中，制備單層細胞，細胞密度為2.5×105個/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，用Ad-Mock、Ad-T 各100 MOI 分別感染3 種細胞，分別培養(yǎng)24 h 和48 h 后棄培養(yǎng)基，每孔加入1 ml Hoechst稀釋液（按1∶1 000稀釋Hoechst染色液）置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱染色10 min，在避光的環(huán)境，棄工作液，PBS 清洗3 次，倒置蓋玻片置于載玻片上，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4.2 JC-1 法 將蓋玻片放在6 孔板中，制備單層細胞，2.5×105個/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h，用Ad-Mock、Ad-T 各100 MOI 分別感染3 種細胞，分別培養(yǎng)24 h 和48 h 后棄培養(yǎng)基，每孔加入1 ml JC-1 稀釋液（1∶1 000 稀釋的Hoechst 染色液）置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱染色10 min，在避光的環(huán)境，棄工作液，PBS 清洗3 次，倒置蓋玻片置于載玻片上，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析 數(shù)據以表示，采用GraphPad Prism 5.0軟件分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 熒光定量PCR 檢測Ad-T 對NCI-H446、NCI-H226、A549細胞表達PD-L1的影響 熒光定量PCR結果如圖1所示，與對照組組相比，Ad-T組的3種細胞中PD-L1 的表達量均顯著下降，且隨Ad-T 作用時間延長，PD-L1的表達量減少更加明顯（P＜0.01）。

圖1 RT-qPCR 法檢測Ad-T 對NCI-H446、NCI-H226、A549細胞PD-L1表達的影響Fig.1 Effect of Ad-T on expression of PD-L1 of NCI-H446，NCI-H226 and A549 was analyzed by RT-qPCR

2.2 Western blot 法驗證Ad-T 對NCI-H446、NCIH226、A549 細胞表達PD-L1 的影響 Western blot結果如圖2 顯示，與對照組和Ad-Mock 組相比，Ad-T組的3 種細胞中PD-L1 的表達量均下降，且隨Ad-T作用時間延長，PD-L1 的表達量減少。這與熒光定量PCR 結果相一致。結果表明Ad-T 能夠抑制腫瘤細胞自身產生的免疫逃逸能力。

圖2 Western blot 法檢測Ad-T 對NCI-H446、NCI-H226、A549細胞PD-L1表達的影響Fig.2 Effect of Ad-T on expression of PD-L1 of NCIH446，NCI-H226 and A549 was analyzed by Western blot

2.3 Ad-T 對NCI-H446、NCI-H226、A549 細胞的抑制作用 Ad-Mock、Ad-T各100 MOI分別感染3種細胞，在24 h 和48 h 進行結晶紫染色和WST-1 檢測，結果如圖3所示，3種細胞在感染Ad-Mock、Ad-T后，結晶紫染色強度均呈下降趨勢，且隨時間延長其增殖抑制作用有顯著的提升，抑制程度Ad-Mock＞Ad-T，48 h＞24 h，而Ad-Mock 與對照組無顯著性差異；WST-1 結果顯示，在24 h 時，Ad-T 對NCI-H446、NCI-H226、A549 的抑制率分別為：52.27%、30.91%和20.54%；在48 h 時，Ad-T 對3 種細胞的抑制率分別為：85.58%、37.98%和39.36%，而Ad-Mock對細胞的抑制率隨時間增加，無顯著性差異。

圖3 Ad-T對NCI-H446、NCI-H226、A549細胞的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of Ad-T on proliferation of NCIH446，NCI-H226 and A549 cells

2.4 Ad-T 對NCI-H446、NCI-H226、A549 細胞凋亡的影響 Hoechst結果如圖4所示，3種細胞感染Ad-T后，部分細胞核呈亮藍色濃染或碎裂，且隨作用時間增長，細胞逐漸減少，而Ad-Mock與對照組的細胞核呈均一藍色熒光。表明，Ad-T 對肺癌細胞產生了顯著的凋亡誘導作用。JC-1 結果：與對照組和Ad-Mock 組相比，Ad-T 對細胞的抑制作用通過線體膜電位的變化而表現(xiàn)出來，隨時間的增加，凋亡的細胞逐漸增多，JC-1 由最初的紅色聚集體逐漸變?yōu)榫G色單體。表明，Ad-T 誘導的肺癌細胞凋亡主要為線粒體途徑的凋亡。

圖4 Ad-T 對NCI-H446、NCI-H226、A549 細胞凋亡的影響（×400）Fig.4 Effects of Ad-T on apoptosis of NCI-H446，NCIH226 and A549 cells（×400）

3 討論

肺癌的發(fā)病率和病死率在所有癌癥中位列第一［12-13］，嚴重威脅人類健康，目前對肺癌治療最常用的方式還是化療和放療，這兩種方式雖然有效，但沒有特異性，殺死癌細胞的同時也伴隨著嚴重的毒副作用，使患者的生活質量不能得到保證，盡管當前肺癌在免疫治療、分子靶向治療等精準醫(yī)療領域取得了一定的成果，然而這些研究還處于臨床二線或二線以上臨床階段，治療尚未成熟［14］。本研究旨在通過新型生物治療手段，為今后肺癌的治療提供新的思路和方法。

近年來，隨著生物醫(yī)學及基因工程技術的發(fā)展，已經開發(fā)出很多新的腫瘤治療方法，包括溶瘤病毒療法等，它是一種治療腫瘤的新方法，當前用于腫瘤基因治療的溶瘤病毒有腺病毒、痘苗病毒、麻疹病毒、逆轉錄病毒、呼吸腸道病毒等數(shù)十種［15-16］。其中對腺病毒的研究最為廣泛，本課題組前期通過對腺病毒進行基因工程改造，利用hTERT 啟動子構建了一個特異性重組腺病毒，命名為Ad-hTERTp-E1a（Ad-T），hTERT 啟動子是一種可以激活腫瘤細胞中某些基因的復制、表達的特異性啟動子，而在正常細胞被抑制，這使得腺病毒能夠特異性識別腫瘤細胞并在腫瘤細胞內大量增殖，可有效提高溶瘤腺病毒的靶向作用和抗腫瘤效果［9］。

PD-L1 是在胎盤文庫中發(fā)現(xiàn)的一種免疫抑制因子，又稱CD274或B7-H1［17］。PD-L1屬于B7家族，可廣泛表達于多種細胞，包括腫瘤細胞、免疫細胞、內皮細胞、上皮細胞等，其他正常組織也可經過誘導表達PD-L1，主要作用是調節(jié)人體免疫功能，腫瘤細胞可通過表達PD-L1 與T 細胞表面的PD-1 結合，使免疫細胞失去攻擊能力［18］。腫瘤細胞正是充分利用其特性，通過誘導PD-L1 表達上調從而直接或間接抑制T 細胞對癌細胞的殺傷功能，抑制炎癥細胞的免疫效應，進而產生免疫逃逸。機體內PD-L1 水平直接反映其免疫功能。通過干擾調控PD-L1表達的基因或通路，可有效降低PD-L1的表達，恢復機體的免疫防御功能，因此抗PD-L1 研究有望成為腫瘤免疫治療的重要手段。在本研究中，首先通過熒光定量PCR 及Western blot 法發(fā)現(xiàn)，Ad-T可下調3種肺癌細胞上PD-L1 的表達，且隨作用時間的延長，PD-L1 下調更加明顯；通過結晶紫染色、WST-1、Hoechst 和JC-1 法發(fā)現(xiàn)Ad-T 還可抑制肺癌細胞，并通過降低線粒體膜電位的方式來誘導細胞凋亡，結果表明，Ad-T可抑制肺癌細胞表達PD-L1，同時也可誘導肺癌細胞的凋亡，對肺癌細胞具有抑制作用。

綜上所述，重組腺病毒Ad-T可抑制肺癌細胞表達PD-L1，同時也可誘導肺癌細胞的凋亡，對肺癌細胞具有抑制作用，由此推測特異性溶瘤腺病毒可抑制腫瘤免疫逃逸，增強機體的免疫防御功能，為今后肺癌治療提供理論依據并探索肺癌治療的新方法。