鄭素慧，何 慶，張 健，關(guān)軍鋒，秦南南，楊怡靖銘，劉雪艷，吳 斌

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，石家莊 050051)

0 引 言

【研究意義】紅地球葡萄(VitisviniferaL. cv. Red Globe)以其果皮厚實(shí)、果肉飽滿、口感獨(dú)特和耐貯藏的特點(diǎn)[1]，但葡萄果實(shí)在采后貯藏過(guò)程中易產(chǎn)生色澤變化、風(fēng)味變劣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失等[2]。由于葡萄皮薄多汁、果實(shí)組織嬌嫩，在采摘、運(yùn)輸和貯藏過(guò)程中易遭受機(jī)械損傷。研究茉莉酸甲酯(MeJA)浸泡處理對(duì)葡萄采后病害的控制及貯藏品質(zhì)的影響。對(duì)于保持紅地球葡萄貯期果實(shí)品質(zhì)和控制灰霉病害發(fā)生有實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，采用二氧化硫(Sulfur dioxide,SO2)熏蒸結(jié)合冷藏仍然是控制葡萄真菌腐爛以及保持貯藏品質(zhì)的主要方法[3]，紅地球葡萄的植物學(xué)性狀決定其對(duì)SO2非常敏感，劑量稍不適合就會(huì)發(fā)生SO2傷害[4]。李月明等[5]使用可降解殼聚糖淀粉抗菌復(fù)合膜保鮮紅提葡萄，貯藏60 d后，好果率仍達(dá)到60%以上。呂明珠等[6]使用體積分?jǐn)?shù)為1.0%的肉桂精油在2℃，相對(duì)濕度90%條件下保鮮紅提葡萄，可有效抑制呼吸強(qiáng)度，保鮮期可達(dá)63 d。采用1-MCP、冰溫、臭氧、醋酸、涂膜技術(shù)等方法保鮮葡萄[7-8]，盡管很多研究報(bào)道了葡萄的貯藏保鮮方法，但大多數(shù)為物理化學(xué)貯藏，且效果并不理想，尋找替代SO2熏蒸控制葡萄采后病害，安全無(wú)殘留并能維持果實(shí)品質(zhì)的貯藏條件、采后處理技術(shù)與材料等尤為重要?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate，MeJA)是高等植物體內(nèi)天然存在的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，可在植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮信號(hào)傳導(dǎo)作用來(lái)調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、后熟衰老、抗逆性和次生代謝產(chǎn)物合成等一系列生理生化反應(yīng)[9]。外源MeJA處理能夠誘導(dǎo)果實(shí)提高防御酶的活性，提高藍(lán)莓[10]、甜瓜[11]、獼猴桃[12]、蘋果[13]等果實(shí)的抗病性，減少采后腐爛的發(fā)生。近年來(lái)，關(guān)于MeJA應(yīng)用于采后果蔬貯藏保鮮的研究報(bào)告不斷增多，但MeJA能否維持新疆紅地球葡萄產(chǎn)地短期鮮銷品質(zhì)及控制灰霉病還未進(jìn)行深入研究。研究茉莉酸甲酯(MeJA)浸泡處理對(duì)葡萄采后病害的控制及貯藏品質(zhì)的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以新疆紅地球葡萄為材料，對(duì)葡萄果實(shí)進(jìn)行不同濃度的MeJA浸泡處理，比較分析MeJA處理后果實(shí)的貯藏效果，以及在損傷接種條件下對(duì)病原菌的誘導(dǎo)抗病效應(yīng)，為MeJA應(yīng)用于葡萄貯運(yùn)保鮮提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

紅地球葡萄(VitisviniferaL. cv. Red Globe)，2016年9月和2017年9月均采摘于昌吉三工鎮(zhèn)葡萄種植園(2016年開(kāi)展?jié)舛群Y選試驗(yàn)，2017年開(kāi)展相關(guān)機(jī)理試驗(yàn))。挑選大小均一、色澤相近、果形端正、無(wú)機(jī)械損傷和病蟲(chóng)害的果實(shí)，采后當(dāng)日運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室冷庫(kù)(0±1)℃進(jìn)行預(yù)冷，預(yù)冷12 h后待用。

灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所分離、鑒定并保存。

1.2 方 法

1.2.1 MeJA浸泡處理

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇設(shè)定3個(gè)MeJA處理濃度，葡萄果實(shí)表面經(jīng)自來(lái)水沖洗干凈后分別在50、100和200 μmol/L(含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-80)的MeJA中浸泡10 min，以清水為對(duì)照(CK)，自然晾干。置于0℃±1℃下貯藏60 d，每隔10 d測(cè)定果實(shí)各相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 灰葡萄孢子懸浮液的制作

參考鄧惠文[14]的方法配制孢子懸浮液。將已長(zhǎng)出菌絲的菌株轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)7 d，用體積分?jǐn)?shù)為0.05%的Tween-80無(wú)菌水沖洗平板、收集孢子懸液，并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，最終將孢子懸浮液濃度稀釋至1×106個(gè)/mL。

1.2.3 不同濃度MeJA對(duì)果實(shí)灰霉病的防效損傷接種處理

參照Yao等[15]的方法。處理后的葡萄放置24 h后，先用75%的酒精擦拭果實(shí)表面，然后在果實(shí)赤道部位用滅菌竹簽刺1個(gè)孔(直徑2 mm，深度2 mm)，待傷口表面晾干后，用微量進(jìn)樣器向孔內(nèi)注入10 μL預(yù)先配置好的菌懸液。待菌液完全風(fēng)干后將果粒裝入塑料盒中(175 mm×135 mm×76 mm，盒蓋上有6個(gè)孔，直徑1 cm)，接種面向上，置于室溫(25±1)℃，相對(duì)濕度為 60%～65%的環(huán)境中貯藏8 d。每隔24 h觀察果實(shí)發(fā)病情況，測(cè)量病斑直徑。

1.2.4 MeJA處理后果實(shí)內(nèi)防御酶活性測(cè)定

將挑選好的葡萄果實(shí)分成4組處理：(1)CK組：用蒸餾水浸泡10 min后，于25℃放置24 h；(2)MeJA處理組：用50 μmol/L MeJA溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-80)浸泡10 min后，于25℃放置24 h；(3)B.cinerea接種組：用蒸餾水浸泡10 min后，于25℃放置24 h，再用微量進(jìn)樣器注入10 μL濃度為1×106個(gè)/mL的B.cinerea孢子懸浮液；(4)MeJA+B.cinerea接種組：用50 μmol/L MeJA溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.05% Tween-80)浸泡10 min后，于25℃放置24 h，再接種10 μL 1×106個(gè)/mL的B.cinerea孢子懸浮液。4 組處理完成后，將果粒裝入塑料盒中(175×135×76(mm)，盒蓋上有6個(gè)孔，直徑1 cm)，置于室溫(25℃±1℃)，相對(duì)濕度為60%～65%的環(huán)境中貯藏7 d。每24 h取樣，收集葡萄病斑周圍0.50 cm處健康果肉組織，液氮速凍后，于-80℃冰箱中保存。重復(fù)3次，每組約500個(gè)果實(shí)。

1.2.5 指標(biāo)測(cè)定

1.2.5.1 腐爛率

腐爛率(%)=(腐爛果實(shí)個(gè)數(shù)/果實(shí)總個(gè)數(shù))×100。

1.2.5.2 硬 度

采用GY-4型果實(shí)硬度計(jì)，測(cè)定探頭直徑為3 mm，刺入深度為10 mm，于果實(shí)赤道部位測(cè)定。每處理取10個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次。單位以N表示。

1.2.5.3 可溶性固形物含量

隨機(jī)選取30粒葡萄果實(shí)，榨汁后過(guò)濾，采用PR-PAL-1型數(shù)顯糖度計(jì)測(cè)定，各處理重復(fù)測(cè)定6次，取平均值。單位以%表示。

1.2.5.4 可滴定酸含量

參照曹建康[16]方法。采用酸堿滴定法測(cè)定，單位用%表示。

1.2.5.5 發(fā)病率及病斑直徑

病斑直徑超過(guò)穿刺孔徑2 mm的記為病果；病斑直徑利用游標(biāo)卡尺進(jìn)行十字交叉法測(cè)定，每個(gè)病斑測(cè)量3次，計(jì)算平均值。

1.2.5.6 相關(guān)酶活性

通過(guò)果實(shí)硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、自然腐爛率、損傷接種B.cinerea后發(fā)病率及病斑直徑的變化篩選出50 μmol/L MeJA處理組為較適宜濃度進(jìn)行酶活性測(cè)定。

(1)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性參照Liu等[17]方法測(cè)定(U/g 鮮重)。

(2)幾丁質(zhì)酶(CHI)活性參照曹健康等[16]方法測(cè)定(U/g 鮮重)。

(3)β-1,3葡聚糖酶(GLU)活性參照曹健康等[16]方法測(cè)定(U/g 鮮重)。

(4)多酚氧化酶(PPO)活性參考曹健康等[16]方法測(cè)定(U/g 鮮重)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010數(shù)據(jù)處理，利用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Duncan多重比較檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析(P<0.05 為差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA處理對(duì)紅地球葡萄果實(shí)自然腐爛率的影響

研究表明，各處理葡萄果實(shí)自然腐爛率隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸上升的趨勢(shì)，40～60 d快速上升。CK組和100 μmol/L MeJA處理組在10 d時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)腐爛，200 μmol/L MeJA處理組20 d出現(xiàn)腐爛，50 μmol/L MeJA處理組30 d出現(xiàn)腐爛。40 d時(shí)，CK組腐爛率為25.00%，分別是50、100和200 μmol/L MeJA處理組的2.82、1.30和1.04倍。60 d時(shí)，50、100和200 μmol/L MeJA處理組自然腐爛率分別比對(duì)照低了33.33%、21.79%和16.03%，整個(gè)貯藏期間，50 μmol/L MeJA處理組果實(shí)的自然腐爛率顯著低于CK組(P<0.05)。MeJA處理對(duì)紅地球葡萄果實(shí)腐爛具有抑制作用。圖1

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 MeJA處理對(duì)紅地球葡萄果實(shí)硬度的影響

研究表明，在貯藏期間果實(shí)硬度均呈下降趨勢(shì)，3種濃度MeJA處理組對(duì)果實(shí)硬度的影響差異較明顯。果實(shí)初始硬度為15.60 N，60 d時(shí)，CK組和50 μmol/L MeJA處理組硬度分別為8.60和11.20 N，降幅比例分別為44.87%和28.21%。在0～30 d期間，50 μmol/L MeJA處理組優(yōu)于100和200 μmol/L MeJA處理組，在30～60 d期間，MeJA 3個(gè)處理組無(wú)差異。整個(gè)貯期內(nèi)，50 μmol/L MeJA處理組與CK組在貯藏期間存在顯著性差異(P<0.05)。MeJA處理對(duì)果實(shí)硬度的下降有減緩作用。圖2

圖2 不同MeJA處理下紅地球葡萄果實(shí)硬度變化Fig.2 Effects of MeJA treatment at different concentrations on the hardness of grapes

2.3 MeJA處理對(duì)紅地球葡萄果實(shí)可溶性固形物和可滴定酸含量的影響

研究表明，貯藏期間，CK組和處理組果實(shí)可溶性固形物含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)，各處理組果實(shí)在20 d時(shí)達(dá)到峰值，隨后緩慢降低，30 d后，各處理組果實(shí)可溶性固形物下降加快。在30～60 d期間，各MeJA處理組可溶性固形物含量均高于CK組，至60 d時(shí)，50、100和200 μmol/L MeJA處理果實(shí)可溶性固形物含量分別比CK組高15.44%、5.88%和4.41%，差異顯著(P<0.05)。

貯藏期間，CK組和處理組果實(shí)可滴定酸含量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈緩慢下降趨勢(shì)，后期有小幅上升，總體變化不大。在10～40 d，50 μmol/L MeJA處理組可滴定酸含量高于CK組(P<0.05)，MeJA處理能延緩紅地球葡萄的可滴定酸含量的降低，其中50 μmol/L MeJA處理效果較好。圖3

注：(A)和可滴定酸(B)含量的影響

2.4 MeJA處理對(duì)葡萄果實(shí)采后損傷接種B. cinerea發(fā)病率和病斑直徑的影響

研究表明，不同濃度MeJA處理?yè)p傷接種的果實(shí)，在25℃條件下貯藏至第6 d時(shí)，50和200 μmol/L MeJA處理組發(fā)病率分別為59.96%和68.84%，與CK組相比，發(fā)病率分別降低了25.05%和13.95%，差異顯著(P<0.05)，而200 μmol/L MeJA處理組果實(shí)發(fā)病率與CK組無(wú)顯著差異。在25℃條件下貯藏至第6 d時(shí)，50 μmol/L MeJA處理組和CK組葡萄果實(shí)的病斑直徑分別為3.90和5.98 mm，50 μmol/L MeJA處理組病斑直徑較CK組降低了34.78%，50 μmol/L MeJA處理組與CK組差異顯著(P<0.05)；而100和200 μmol/L MeJA處理組果實(shí)發(fā)病率與CK組相比，無(wú)顯著差異。50 μmol/L MeJA處理能夠有效抑制發(fā)病率上升和果實(shí)病斑擴(kuò)大，能提高葡萄果實(shí)對(duì)灰葡萄孢的抗性，對(duì)灰霉病害的控制效果顯著。圖4

圖4 MeJA不同濃度處理下葡萄果實(shí)發(fā)病率(A)和病斑直徑(B)變化(第6 d)Fig.4 Effects of different MeJA concentrations treatment on grape incidence (A) and lesion diameter (B) (No.6 d)

2.5 MeJA處理對(duì)損傷接種B. cinerea葡萄果實(shí)PAL活性的影響

研究表明，各處理組果實(shí)PAL活性隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，各處理組在貯藏3～8 d時(shí)，PAL活性始終高于CK組(P<0.05)。經(jīng)接種B.cinerea果實(shí)的PAL活性在貯藏3 d達(dá)到峰值，為此時(shí)CK組的2.88倍。先經(jīng)MeJA處理后接種B.cinerea的葡萄果實(shí)PAL活性在貯藏前期快速增加，在貯藏2 d時(shí)出現(xiàn)明顯峰值，為CK組的5.31倍，并在之后的貯藏過(guò)程中顯著高于CK組果實(shí)(P<0.05)。MeJA處理能有效誘導(dǎo)葡萄果實(shí)接種B.cinerea后PAL活性的上升。圖5

圖5 不同MeJA處理下葡萄果實(shí)PAL活性變化Fig.5 Effects of MeJA treatment on PAL activity of grapes

2.6 MeJA處理對(duì)損傷接種B. cinerea葡萄果實(shí)CHI活性的影響

CHI活性總體上呈先上升后降低的變化趨勢(shì)，貯藏前后CK組無(wú)明顯變化。MeJA處理組、CK+B.cinerea接種組和MeJA+B.cinerea接種組果實(shí)CHI活性在貯藏2 d都有明顯升高，在第2 d時(shí)，各處理組均達(dá)到峰值，顯著高于CK組(P<0.05)。隨后各處理組CHI活性均開(kāi)始下降，后期有緩慢升高，但各處理組在貯藏1～8 d的CHI活性始終高于CK組(P<0.05)。其中MeJA+B.cinerea接種組果實(shí)CHI活性在貯藏1 d時(shí)就被快速激活，貯藏2 d時(shí)達(dá)到峰值，為CK組的2.36倍，且貯藏期間其活性一直顯著高于其他3組果實(shí)(P<0.05)。MeJA處理能有效誘導(dǎo)葡萄果實(shí)接種B.cinerea后CHI活性的上升。圖6

圖6 不同MeJA處理下葡萄果實(shí)CHI活性變化Fig.6 Effects of MeJA treatment on CHI activity of grapes

2.7 MeJA對(duì)損傷接種B. cinerea葡萄果實(shí)GLU活性的影響

研究表明，貯藏前后CK組和各處理組果實(shí)GLU活性總體呈下降趨勢(shì)，各處理組在貯藏期間4～8 d的GLU活性始終高于CK組(P<0.05)。MeJA處理組果實(shí)的GLU活性在整個(gè)貯藏期間與CK組有顯著差異(P<0.05)。B.cinerea接種組和MeJA+B.cinerea接種組果實(shí)GLU活性均在貯藏4 d時(shí)達(dá)到峰值，分別為CK組的1.60和3.30倍(P<0.05)，整個(gè)貯藏期MeJA+B.cinerea接種組果實(shí)GLU活性在4組中均為最高。MeJA處理能有效誘導(dǎo)葡萄果實(shí)接種B.cinerea后GLU活性的上升。圖7

圖7 不同MeJA下葡萄果實(shí)GLU活性變化Fig.7 Effects of MeJA treatment on GLU activity of grapes

2.8 MeJA處理對(duì)損傷接種B. cinerea葡萄果實(shí)PPO活性的影響

研究表明，各處理組果實(shí)PPO活性總體呈先上升后降低的變化趨勢(shì)。MeJA處理組、B.cinerea接種組和MeJA+B.cinerea接種組果實(shí)PPO活性在貯藏前期都有顯著升高，于2 d到達(dá)活性高峰，分別為對(duì)照的1.29、1.11和1.61倍，隨后酶活性均開(kāi)始下降，但始終高于CK組。貯藏1～8 d，MeJA+B.cinerea接種組果實(shí)PPO活性在4組中均為最高，顯著高于其他3組(P<0.05)。MeJA處理能有效誘導(dǎo)葡萄果實(shí)接種B.cinerea后PPO活性的上升。圖8

圖8 不同MeJA處理對(duì)葡萄果實(shí)PPO活性變化Fig.8 Effects of MeJA treatment on PPO activity of grapes

3 討 論

MeJA是一種外源非生物誘導(dǎo)因子，能充當(dāng)信號(hào)分子調(diào)控多種果實(shí)抗逆性反應(yīng)和次生代謝產(chǎn)物的合成，是植物獲得誘導(dǎo)抗性的重要誘導(dǎo)因子，它能誘導(dǎo)植物體產(chǎn)生抵抗外界脅迫的防御反應(yīng)[18]。MeJA屬于植物體內(nèi)的信號(hào)分子，具有明顯的生理代謝活性，且無(wú)毒、無(wú)污染，可作為傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑的替代物用于果蔬貯藏保鮮[19]。MeJA處理的葡萄果實(shí)腐爛率、硬度、可溶性固形物和可滴定酸含量與CK組相比，可顯著保持果實(shí)硬度，顯著延緩可溶性固形物和可滴定酸含量下降速度，延緩葡萄果實(shí)采后衰老速度，維持采后果蔬的品質(zhì)特性，延長(zhǎng)其貯藏期。MeJA在改善果蔬采后品質(zhì)、延緩果蔬衰老中有重要作用，可延緩李[20]、冬棗[21]、獼猴桃[22]、火龍果[23]、菠蘿[24]和楊梅[25]等果實(shí)硬度的下降，抑制果實(shí)可溶性固形物和可滴定酸含量的下降，維持果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，延緩果實(shí)成熟和衰老進(jìn)程。與實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果相一致，外源MeJA處理在葡萄果實(shí)貯運(yùn)保鮮中具有較好的應(yīng)用前景。

PPO活性的增強(qiáng)對(duì)于采后果實(shí)抗病性的增強(qiáng)具有重要作用。MeJA處理對(duì)冬棗果實(shí)貯藏品質(zhì)[21]、桃果實(shí)軟化[26]和鮮切紫薯病害的控制[27]，均與MeJA誘導(dǎo)了果實(shí)中PPO活性密切相關(guān)。與試驗(yàn)結(jié)果一致，在研究中，采后MeJA處理明顯增強(qiáng)了葡萄果實(shí)PPO活性，可能是因?yàn)镸eJA誘導(dǎo)了木質(zhì)素、植保素等抗性物質(zhì)的形成，增強(qiáng)酚類物質(zhì)氧化能力，生成對(duì)病原微生物有毒性作用的醌類物質(zhì)，直接抑制病原菌的侵染[28]。

PAL是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶。植物受到病原菌侵染后，會(huì)在感染部位誘導(dǎo)和積累大量PR蛋白使SAR，這就包括CHI和GLU[29]。研究發(fā)現(xiàn)MeJA+B.cinerea接種處理較單一的MeJA處理或B.cinerea接種處理更顯著地誘導(dǎo)了葡萄果實(shí)PAL、CHI、GLU和PPO活性的上升，使得這幾個(gè)酶活性在整個(gè)貯藏期間都維持在最高水平，表明MeJA處理可誘導(dǎo)提高采后葡萄果實(shí)的抗病性，并且只有在病原菌侵染后才表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗病反應(yīng)，推測(cè)MeJA可能是通過(guò)Priming機(jī)制誘導(dǎo)葡萄果實(shí)的抗病性，從而有效抑制灰霉病的發(fā)生。與MeJA誘導(dǎo)的鱷梨對(duì)Colletotrichumgloeosporioides引起的炭疽病抗性[30]及楊梅對(duì)Penicilliumcitrinum侵染的抗性[31]相關(guān)酶(CHI、GLU和PAL)活性增強(qiáng)的研究結(jié)果一致。但MeJA對(duì)病害控制的分子機(jī)理尚不清楚，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

50 μmol/L MeJA為最適宜葡萄采后處理濃度。MeJA處理能夠顯著提高葡萄PAL、CHI、GLU和PPO等抗性酶的表達(dá)及活性以及對(duì)灰葡萄孢顯著的誘導(dǎo)抑制能力。MeJA處理可延緩果實(shí)硬度的下降，維持葡萄果實(shí)中可溶性固形物和可滴定酸含量，抑制果實(shí)的腐爛，延緩葡萄果實(shí)采后衰老進(jìn)程，對(duì)于提高果實(shí)的采后抗病性和貯藏品質(zhì)，延長(zhǎng)果實(shí)的貨架期效果顯著。