高勇剛，高海峰,呂 卓，徐李娟，古麗尼沙·沙依木，唐琦勇，顧美英，張麗娟，朱錦泉，宋素琴

(1.五家渠新薯種業(yè)有限公司，新疆五家渠 831300；2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室,烏魯木齊 830091；3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室，烏魯木齊 830091；4.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；5.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；6.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院拜城農(nóng)業(yè)試驗站，新疆拜城 842300)

0 引 言

【研究意義】2017年我國馬鈴薯的種植面積和總產(chǎn)量分別為576.7×104hm2和9 920.5×104t，占全球總種植面積的29.9%和總產(chǎn)量的25.6%[1]。馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)適宜生長在15～25℃，國內(nèi)馬鈴薯優(yōu)勢產(chǎn)區(qū)包括北方一作區(qū)(東北、華北、西北)、中原二作區(qū)、西南混作區(qū)以及南方冬作區(qū)，形成了馬鈴薯周年生產(chǎn)的種植區(qū)域格局[2]。新疆具有種植馬鈴薯得天獨厚的自然資源條件，在各地州均有種植，2015年新疆馬鈴薯種植面積達2.587×104hm2，總產(chǎn)量約81.49×104t，單產(chǎn)2 064 kg/667m2[3]，主要分布在奇臺、尼勒克、巴里坤、喀什等地區(qū)?！厩叭搜芯窟M展】我國西北地區(qū)常見馬鈴薯病害有馬鈴薯晚疫病、早疫病、黑痣病、瘡痂病、枯萎病、黃萎病、黑脛病、青枯病等病害[1]，而新疆烏昌地區(qū)發(fā)生9種真菌性病害，即早疫病、晚疫病、枯萎病、干腐病、酸腐病、黃萎病、葉枯病、炭疽病和莖基腐病[4]；新疆伊犁地區(qū)分離出瘡痂病的病原菌[5]；新疆石河子地區(qū)報道有馬鈴薯早疫病[6]?！颈狙芯壳腥朦c】隨著馬鈴薯種植面積的增加，病蟲害的發(fā)生與危害情況也日趨嚴重，針對新疆不同地區(qū)馬鈴薯病害的研究尚且較少。研究新疆北部沿天山主要種植區(qū)病害的種類。【擬解決的關(guān)鍵問題】以新疆北部沿天山主要種植區(qū)感病的馬鈴薯植株與病薯為研究對象，分離其病原菌，鑒定病原種類，為病害防治提供研究基礎(chǔ)，減少因馬鈴薯病害造成的損失。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集

2018年8月，在新疆奇臺農(nóng)場二分場一隊、尼勒克縣實驗站、巴里坤石人子村四組采集馬鈴薯病薯、病株，并將樣品置于4℃立式保藏柜中待用。

致病力測定：塊莖購買于新疆烏魯木齊市北園春農(nóng)貿(mào)市場，品種為大西洋。

1.1.2 試劑與儀器

培養(yǎng)皿若干、試管若干、小刀、酒精燈、滅菌竹簽，均購自烏魯木齊鼎國昌盛有限公司。表1

表1 設(shè)備名稱Table 1 The device used in the experiment

1.2 方 法

1.2.1 菌株的分離與純化

參考方中達[7]的常規(guī)組織分離法，分離和純化菌株。取病斑病健交界處組織作為分離材料，置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)上，30℃生化培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)3～4 d，挑取單菌落至PDA平板上培養(yǎng)，后置于PDA斜面培養(yǎng)基上于4℃冰箱保存，供鑒定和生物學(xué)特性測定。

1.2.2 菌株分子鑒定

1.2.2.1 細菌

細菌的分子鑒定通過16S rDNA序列進行菌株鑒定，通用引物為F16S-27(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和R16S-1492(CGGTTACCTTGTTACGACTTC)，按常規(guī)設(shè)置PCR反應(yīng)體系，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、回收后，送烏魯木齊鼎國昌盛有限公司進行測序。將獲得的序列在NCBI上進行Blast比對，并選取同源性較高和形態(tài)相近菌株序列。表2

1.2.2.2 真菌

真菌的分子鑒定通過ITS序列進行菌株鑒定，用于ITS序列擴增的引物為ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，按常規(guī)設(shè)置PCR反應(yīng)體系，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、回收后，送烏魯木齊鼎國昌盛有限公司進行測序。將獲得的序列在UNITE、NCBI上進行Blast比對，并選取同源性較高和形態(tài)相近菌株序列。表3

1.2.3 致病性測定及病原菌形態(tài)

選擇健康馬鈴薯塊莖，表面清洗干凈并用75%乙醇溶液表面消毒，用無菌水清洗3次。采用菌餅接種法接種病菌測定菌株對馬鈴薯的致病性。利用打孔器打出6 mm的菌餅，將菌餅接至打孔的馬鈴薯薯塊中，以未接菌菌餅為對照，每個處理重復(fù)3次，20 d后觀察馬鈴薯病害癥狀，并對發(fā)病部位進行病原菌再分離。

參考周禹含等[8]方法。挑選致病力測定結(jié)果中有病害癥狀的菌株，挑取菌株將其接至PDA培養(yǎng)基中心位置，封口，于30℃黑暗條件下倒置培養(yǎng)3～4 d。觀察PDA培養(yǎng)基上病原菌的形態(tài)特性與之前接種菌株對比[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離及鑒定

研究表明，共分離得到36株菌，通過分子鑒定并在NCBI以及UNITE網(wǎng)站上進行比對，發(fā)現(xiàn)細菌有4屬13種14株，其中包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)；真菌有5屬12種21株，包括鐮刀菌屬(Fusarium)、地霉屬(Geotrichum)、鏈格孢屬(Alternaria)、絲狀菌屬(Filobasidium)、青霉屬(Penicillium)。在奇臺分離得到假單胞菌(Pseudomonaslactis)，該病菌疑似引起馬鈴薯青枯??；在奇臺、尼勒克均分離出鐮刀菌(Fusarium)，可引起馬鈴薯枯萎病、干腐病；在巴里坤以鏈格孢菌(Alternaria)居多，易引起馬鈴薯早疫病、赤星病等；其中，在巴里坤分離得到的白地霉(Galactomyces)經(jīng)致病力測定發(fā)現(xiàn)可引起馬鈴薯塊莖干腐病癥狀。表4，表5

表4 從感病馬鈴薯分離可培養(yǎng)細菌的種類Table 4 Species of pathogenic bacteria isolated from susceptible potatoes

2.2 致病菌種類

2.2.1 馬鈴薯青枯病

研究表明，引起馬鈴薯青枯病(Potato bacterial wilt)的病原菌是假單胞菌(Pseudomonaslactis)，乳白色的細菌，葉部受害后，病株較矮，從下部葉片開始后全株萎蔫。將病原菌接種在健康馬鈴薯塊莖上，20 d后接菌外觀病斑不明顯，馬鈴薯塊莖內(nèi)部大面積壞死，病斑呈圓形生長，為褐色，且腐爛程度較大，顯微鏡下病菌呈桿狀。圖1

2.2.2 馬鈴薯枯萎病

研究表明，馬鈴薯枯萎病由鐮刀菌屬(Fusarium)引起，分離和鑒定的馬鈴薯枯萎病的病原菌是Fusariumoxysporum(圖2c)，病菌顯微形態(tài)呈鐮刀狀，且周圍附著分生孢子。打孔法將其接種于馬鈴薯塊莖，20 d后觀察發(fā)現(xiàn)：外觀病斑部分按壓稍軟，且有明顯的腐臭味(圖2a)；切開后內(nèi)部呈黃褐色、不定形病斑，且侵染面積較廣，擠壓有菌膿(圖2b)。圖2

表5 從感病馬鈴薯分離可培養(yǎng)真菌的種類Table 5 Species of pathogenic fungi isolated from susceptible potatoes

注：a：接菌20 d塊莖；b：接菌內(nèi)部圖；c：CK；d：病菌形態(tài)圖(100×)

注：a：接菌20 d塊莖；b：接菌內(nèi)部圖；c：病菌菌落圖；d：病菌形態(tài)圖(100×)

2.2.3 馬鈴薯干腐病

研究表明，馬鈴薯干腐病(Dry rot of potato)是由鐮刀菌引起的，病原菌主要為茄病鐮刀菌F.solani，病菌在PDA培養(yǎng)基上菌落為白色，顯微形態(tài)呈鐮刀狀。該病多為貯藏期病害，薯塊局部變褐，稍凹陷多褶疊成同心輪紋狀，薯肉變褐，有空心，最后僵縮干腐，變硬變輕(圖3a)，之后易被其他軟腐細菌第2次侵染。圖3

注：a：接菌20 d塊莖；b：病菌菌落；c：病菌形態(tài)(100×)

2.2.4 馬鈴薯早疫病

研究表明，馬鈴薯早疫病(Alternariasolaniof potato)是由茄鏈格孢菌(Alternariasolani)引起的真菌性病害，分離得到病原菌Alternariasp.，病菌菌絲顯微形態(tài)呈桿狀分支，桿上附著有鏈格孢子(圖4c)。打孔法將其接種于馬鈴薯塊莖，20 d后觀察發(fā)現(xiàn)：塊莖表面出現(xiàn)暗褐色近圓形至不定形、稍凹陷的軟組織病斑(圖4a)，邊緣明顯，病斑下薯肉組織變成褐色層狀干腐(圖4b)。圖4

注：a：接菌20 d塊莖；b：接菌內(nèi)部；c：病菌菌落；d：病菌形態(tài)(40×)

2.2.5 馬鈴薯白地霉病

研究表明，由白地霉(Galactomycescandidum)引起(圖4d)，病菌菌絲呈桿狀，孢子呈橢圓狀附著在菌絲周圍。塊莖發(fā)病癥狀：外觀病斑呈圓形，病斑下薯肉組織呈不定形向下擴展且易剝離，內(nèi)部果肉縮小發(fā)灰，后期出現(xiàn)大量白色霉層。圖4

2.2.6 馬鈴薯赤星病

研究表明，馬鈴薯赤星病(Potato red star disease)是由赤星病菌(Alternariaalternata)引起的，癥狀表現(xiàn)為最初在葉片上出現(xiàn)黃褐色圓形小斑，后期逐漸擴大至出現(xiàn)同心輪紋病斑，植株由下至上，病斑分界處出現(xiàn)淡黃色或黃白色暈圈，甚至出現(xiàn)深褐色或黑色霉?fàn)钗?，致使葉片焦枯。

2.2.7 馬鈴薯黑斑病

研究表明，馬鈴薯黑斑病(Potato black spot)病原為細極鏈格孢菌(Alternariatenuissima)，其主要危害葉片。感病初期出現(xiàn)黑褐色小斑點，迅速擴大，呈圓形或不規(guī)則形褐色病斑，具有明顯或不明顯同心輪紋。主莖和側(cè)枝感病時產(chǎn)生圓形或橢圓形斑塊，略凹陷，潮濕條件下，病部產(chǎn)生褐色霉層。

2.3 非致病菌種類

研究表明，從感病馬鈴薯分離可培養(yǎng)細菌經(jīng)致病性測定表明為非致病菌，主要有貝萊斯芽孢桿菌Bacillusvelezensis、地衣芽孢桿菌Bacillusparalicheniformis、高溫芽孢桿菌Bacillussubtilissubsp. 、萎縮芽孢桿菌Bacillusatrophaeus、霍氏腸桿菌Enterobacterhormaechei等。

3 討 論

研究從新疆北部沿天山主要種植區(qū)尼勒克、巴里坤、奇臺地區(qū)篩選得出35株菌株，菌群包含內(nèi)生菌群以及病原菌等，包括細菌14株，真菌21株；分屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鐮刀菌屬(Fusarium)、地霉屬(Geotrichum)、鏈格孢屬(Alternaria)、絲狀菌屬(Filobasidium)、青霉屬(Penicillium)。病原菌7種，分別引起青枯病、枯萎病、干腐病、塊莖病、早疫病、赤星病、黑斑病病害。王麗麗等[4]調(diào)查了新疆烏昌地區(qū)馬鈴薯真菌性病害，共發(fā)現(xiàn)馬鈴薯真菌性病害有9種，即早疫病、晚疫病、枯萎病、干腐病、酸腐病、黃萎病、葉枯病、炭疽病和莖基腐病；杜鵑等[5]在新疆伊犁地區(qū)分離得到瘡痂病的病原菌，發(fā)現(xiàn)其病原菌為Streptomycesacidiscabies和S.scabies。

馬鈴薯青枯病的病原菌有青枯假單胞菌或茄假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)[10]、青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)[11]。研究分離鑒定出假單胞菌Pseudomonaslactis，致病力測定發(fā)現(xiàn)其對馬鈴薯塊莖有致病性，在新疆屬新報道。新疆夏季的土壤溫度大概在20℃左右，濕度大概在30%左右，適合青枯病菌的生長[12]。據(jù)報道，青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)還易引起辣椒[13]、番茄[14]、煙草[15]、羅漢果[16]等的青枯病。

安小敏[17]報道，枯萎病由鐮刀菌的8個不同種引起，即尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、茄病鐮刀菌(F.solani)、接骨木鐮刀菌(F.sambucinum)、雪腐鐮刀菌(F.nivale)、串珠鐮刀菌(F.moniliforme)、三線鐮刀菌(F.tricinctum)、銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)和燕麥鐮刀菌(F.avenaceum)。研究從新疆不同地區(qū)的感病馬鈴薯上均分離出F.oxysporum，在奇臺地區(qū)分離出F.solani。

馬鈴薯干腐病的病原菌多為接骨木鐮刀菌(F.sambucinum)、銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)和芳香鐮刀菌(F.redolens)等[18]，各地區(qū)干腐病病原菌有差異，優(yōu)勢菌種也不盡相同，感染后的薯塊灰褐色或深褐色、僵縮、干腐、變輕、變硬。在奇臺分離出F.solani和F.redolens，F(xiàn).solani的致病力強于F.redolens。

馬鈴薯白地霉病由白地霉(Galactomycescandidum)引起，目前尚屬新發(fā)現(xiàn)。白地霉易引起巴西紅果[8]、甘薯[19]等多種植物的酸腐病，其病害癥狀和馬鈴薯上的癥狀不同，暫命名為白地霉病，后續(xù)有待研究。研究首次在新疆尼勒克馬鈴薯生長期分離得到，之后在奇臺窖藏馬鈴薯塊莖中又分離和鑒定出該菌[20]。

研究在新疆巴里坤地區(qū)的感病馬鈴薯上分離出Alternaria屬的3個不同種，分別是Alternariasp.、Alternariaalternata和Alternariatenuissima。馬鈴薯早疫病是新疆北疆馬鈴薯生產(chǎn)中危害最廣的病害[21]。研究表明Alternariasp.是巴里坤馬鈴薯早疫病致病菌，該病在新疆烏昌地區(qū)[4]、石河子地區(qū)[6]發(fā)現(xiàn)可由鏈格孢屬(Alternariasolani)引起[22]。范子耀[23]研究發(fā)現(xiàn)Alternariaalternata亦能引起馬鈴薯早疫病、赤星病、黑點?。焕钛拍系萚22]研究發(fā)現(xiàn)Alternariatenuissima可引起馬鈴薯黑斑病。

4 結(jié) 論

從新疆奇臺農(nóng)場、尼勒克縣實驗站、巴里坤石人子村等地區(qū)的感病植株與塊莖中分離出假單胞菌(Pseudomonaslactis)、致病性尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、茄病鐮刀菌(Fusariumsolani)、鏈格孢菌(Alternariasp.)、細級鏈格孢菌(Alternariatenuissima)、赤星病菌(Alternariaalternata)、白地霉(Galactomycescandidum)病原菌，分別引起青枯病、枯萎病、干腐病、早疫病、黑斑病、赤星病、白地霉干腐病，其中致病性尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)致病性較強。