彭芳辰，鄭 斌，王 晶，張 慧，陳麗芳，郝 杰，雷 崐，康 靜(.山西省人民醫(yī)院藥學(xué)部臨床藥學(xué)科，太原 000； .山西省人民醫(yī)院皮膚科，太原 000； .山西省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，太原 000； .山西省人民醫(yī)院中醫(yī)科，太原 000)

復(fù)方膚參霜源于臨床驗(yàn)方，該方由苦參、地膚子和丁香等9味中藥組成，在臨床上以外洗和外浴的方法應(yīng)用于皮膚瘙癢癥患者，具有良好的安全性和止癢效果，深受患者喜愛(ài)，但缺點(diǎn)為使用不便。本研究對(duì)9味中藥經(jīng)水提、醇提和濃縮等工藝制備，利用現(xiàn)代透皮吸收技術(shù)制成霜?jiǎng)?，具有清熱祛風(fēng)止癢、滋陰養(yǎng)血潤(rùn)膚的功效，兼具抗炎、抗過(guò)敏的作用；同時(shí)具有使用簡(jiǎn)便、攜帶方便和易于存放的優(yōu)點(diǎn)。前期研究完成了苦參中所含苦參堿和氧化苦參堿的含量測(cè)定，以及地膚子和丁香的定性鑒別，有效控制了該制劑的質(zhì)量。為了更好地評(píng)價(jià)復(fù)方膚參霜的安全性和藥效，本研究進(jìn)行了抗炎、止癢等藥效學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)急性毒性試驗(yàn)評(píng)價(jià)其安全性，以期為其臨床應(yīng)用的有效性及安全性評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種(KM)小鼠[合格證號(hào)：SCXK(晉)2019-0001]，20～30 g，雌雄各半，由我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。豚鼠[合格證號(hào)：SCXK(晉)2019-0002]，280～320 g，雌雄各半，由山西省太原市康寶瑞實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。健康成年新西蘭白兔[合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0007]，2～2.5 kg，雌雄各半，由中國(guó)食品藥品鑒定所提供。動(dòng)物(小鼠)實(shí)驗(yàn)環(huán)境為我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK(晉)2019-0003]；動(dòng)物(豚鼠)實(shí)驗(yàn)環(huán)境為中國(guó)輻射防護(hù)研究院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK(晉)2018-0005]；動(dòng)物(新西蘭白兔)實(shí)驗(yàn)環(huán)境為山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室[設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK(晉)2017-0001]。本實(shí)驗(yàn)遵守國(guó)家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用準(zhǔn)則，經(jīng)我院倫理委員會(huì)(倫理批準(zhǔn)號(hào)：2020省醫(yī)科倫審字第141號(hào))和中國(guó)輻射防護(hù)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫理批準(zhǔn)號(hào)：CRIP-IACUC-(R)-2019011]。

1.2 儀器

EK3820型動(dòng)物電子秤(廣東香山衡器集團(tuán)股份有限公司)；BSA2245-CW型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；BX41-32H02型生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.3 藥品與試劑

復(fù)方膚參霜(我院自制，研制批號(hào)：20190531)；復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(陽(yáng)性對(duì)照藥，華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)為1903023X)。硫化鈉(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，分析純，批號(hào)：20181129)；二甲苯(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號(hào)：20170705)；磷酸組胺(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純，批號(hào)：20150508)；水為蒸餾水。

2 方法

2.1 復(fù)方膚參霜對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

參照文獻(xiàn)[1]，取KM小鼠50只，隨機(jī)分為低、中和高劑量復(fù)方膚參霜組，陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組；分別在各組小鼠右耳耳廓均勻涂抹對(duì)應(yīng)藥物，即復(fù)方膚參霜0.5、1.0和2.0 g/kg，陽(yáng)性對(duì)照藥物(復(fù)方醋酸地塞米松乳膏)1.0 g/kg，空白基質(zhì)1.0 g/kg，1日2次，連續(xù)3 d，第4日涂藥1 h后對(duì)各小鼠右耳涂予二甲苯50 μL致炎，4 h后以純化水洗去小鼠右耳藥液，用棉球擦干后斷頸處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑為8 mm的打孔器于雙耳同部位打下圓耳片，分別稱(chēng)重。以左耳作為對(duì)照，左右耳片質(zhì)量之差為腫脹程度，計(jì)算腫脹抑制率，腫脹抑制率(%)=(空白對(duì)照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/空白對(duì)照組平均腫脹度×100%。

2.2 復(fù)方膚參霜對(duì)磷酸組胺致豚鼠足趾致癢閾的影響

取豚鼠50只，隨機(jī)分為低、中和高劑量復(fù)方膚參霜組，陽(yáng)性對(duì)照組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)前1 d，各豚鼠右后足剃毛；各組豚鼠右后足分別涂抹對(duì)應(yīng)藥物1次，即復(fù)方膚參霜0.5、1.0和2.0 g/kg，陽(yáng)性對(duì)照藥物(復(fù)方醋酸地塞米松乳膏)1.0 g/kg，空白基質(zhì)1.0 g/kg。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日用粗砂紙擦傷豚鼠右后足剃毛處(面積約1 cm×1 cm)，以少量滲血為度，按照前述方法對(duì)各組豚鼠涂抹對(duì)應(yīng)藥物1次，30 min后在創(chuàng)面處滴0.02%磷酸組胺0.05 mL/只，每次間隔3 min，至出現(xiàn)豚鼠舔該側(cè)后足為止，累計(jì)各組每只豚鼠所用磷酸組胺總量(μg)為致癢閾。

2.3 急性毒性試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)

參照相關(guān)文獻(xiàn)[2]，找出引起小鼠100%和0死亡的劑量。取12只KM小鼠，隨機(jī)分為3組，每組4只，雌雄各2只，按0.02、0.01和0.005 mL/g的劑量，灌胃給予復(fù)方膚參霜。灌胃前12 h禁食、不禁水，灌胃后常規(guī)飼養(yǎng)，并觀察小鼠3 d內(nèi)死亡情況。

2.4 最大給藥量試驗(yàn)

取KM小鼠60只，隨機(jī)分為對(duì)照組、空白基質(zhì)組(0.02 mL/g)和復(fù)方膚參霜組(0.02 mL/g)，每組20只，雌雄各10只。按上述劑量灌胃給藥1次，對(duì)照組小鼠按0.02 mL/g灌蒸餾水，灌胃前禁食12 h，不禁水，灌胃后常規(guī)飼養(yǎng)。連續(xù)觀察14 d內(nèi)動(dòng)物的中毒反應(yīng)及有無(wú)死亡，以死亡為主要指標(biāo)，如無(wú)死亡，則以該用藥量為小鼠的最大給藥量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱(chēng)量小鼠的體重，計(jì)算灌胃給藥組小鼠的最大給藥量為擬臨床用藥劑量的倍數(shù)。

2.5 復(fù)方膚參霜皮膚給藥小鼠的急性毒性試驗(yàn)

取KM小鼠40只，隨機(jī)分為基質(zhì)組和復(fù)方膚參霜組，每組20只，雌性各半；小鼠背部正中剪毛(約2.5 cm×4 cm)，8%硫化鈉溶液脫毛，24 h后在小鼠背部脫毛區(qū)分別涂抹空白基質(zhì)和復(fù)方膚參霜(0.25 g/只)，連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠死亡數(shù)及毒性反應(yīng)。

2.6 復(fù)方膚參霜單次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)

取新西蘭兔8只，雌雄各半，隨機(jī)分為完整皮膚組和破損皮膚組，每組4只，采用自身對(duì)照，所有新西蘭兔背部脊柱兩側(cè)用剪刀去毛(每側(cè)約3 cm×5 cm，無(wú)紅斑、水腫及破損)，再用8%硫化鈉水溶液脫毛。破損皮膚組兔用消毒針頭去毛區(qū)劃“#”字以滲血為度。各組在左側(cè)去毛區(qū)分別涂抹復(fù)方膚參霜(0.5、1.0 g)，在右側(cè)去毛區(qū)分別涂抹空白基質(zhì)(1.0 g)和空白(不涂抹)，用一層4 cm×6 cm保鮮膜覆蓋保濕，加紗布覆蓋保護(hù)，最后用無(wú)刺激性膠布和繃帶適當(dāng)固定。6 h后用溫水洗去殘留的受試藥，于去除涂抹物后1、24、48和72 h觀察涂抹部位有無(wú)紅斑和水腫等情況，以及上述變化的恢復(fù)情況和時(shí)間，并對(duì)紅斑水腫情況進(jìn)行評(píng)分。

2.7 復(fù)方膚參霜多次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)

按“2.7”項(xiàng)下方法將新西蘭兔處置去毛區(qū)，隨機(jī)分為完整皮膚組和破損皮膚組。各組在左側(cè)去毛區(qū)分別涂抹復(fù)方膚參霜(0.5、1.0 g)，在右側(cè)去毛區(qū)分別涂抹空白基質(zhì)(1.0 g)和空白(不涂抹)，按“2.7”項(xiàng)下方法對(duì)涂抹部位進(jìn)行保濕、保護(hù)和固定。每日同一時(shí)間在同一部位涂抹藥物1次，涂抹后6 h以溫水洗去殘留涂抹物，連續(xù)7 d。于每次去除涂抹物后1 h，再次涂抹前，末次給藥后去除受試物后1、24、48和72 h，觀察并記錄涂抹部位紅斑水腫及是否有色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙或皮膚菲薄等情況發(fā)生及其消退時(shí)間，并對(duì)紅斑水腫情況進(jìn)行評(píng)分。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 復(fù)方膚參霜對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和低、中和高劑量復(fù)方膚參霜組小鼠耳廓腫脹度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.001、0.046、0.043和0.001)；高劑量復(fù)方膚參霜組與陽(yáng)性對(duì)照組小鼠耳廓腫脹程度相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.901)，見(jiàn)表1。提示復(fù)方膚參霜能夠明顯抑制二甲苯致小鼠耳廓炎癥，且隨劑量增加效果更顯著，高劑量復(fù)方膚參霜可與對(duì)照藥物等效。

表1 復(fù)方膚參霜對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響Tab 1 Effects of compound Fushen cream on xylene-induced auricular swelling in mice n=10)

3.2 復(fù)方膚參霜對(duì)磷酸組胺致豚鼠足趾致癢閾的影響

與空白對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和低、中和高劑量復(fù)方膚參霜組豚鼠磷酸組胺所致的致癢閾均提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P分別為0.000、0.037、0.000和0.000)；高劑量復(fù)方膚參霜組與陽(yáng)性對(duì)照組豚鼠磷酸組胺所致的致癢閾相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.320)，見(jiàn)表2。提示復(fù)方膚參霜可以顯著提高磷酸組胺對(duì)豚鼠的致癢閾，且隨劑量增加效果更明顯，高劑量復(fù)方膚參霜可與對(duì)照藥物等效。

表2 復(fù)方膚參霜對(duì)磷酸組胺致豚鼠足趾致癢閾的影響Tab 2 Effects of CFC on the itching threshold of guinea pig toes induced by histamine

3.3 急性毒性試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

急性毒性試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，三組小鼠均無(wú)死亡，無(wú)法測(cè)出其半數(shù)致死量(LD50)，因此采用測(cè)定小鼠最大給藥量來(lái)評(píng)估受試藥物對(duì)小鼠的急性毒性作用。

3.4 最大給藥量試驗(yàn)結(jié)果

空白基質(zhì)組、復(fù)方膚參霜組和空白對(duì)照組，按0.02 mL/g一次灌胃給藥后常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14 d，小鼠均無(wú)中毒反應(yīng)及死亡。灌胃復(fù)方膚參霜后30 min內(nèi)部分小鼠活動(dòng)偶有減少，至1 h后完全恢復(fù)，實(shí)驗(yàn)期間給藥動(dòng)物無(wú)1只死亡，觀察期間小鼠整體體重平穩(wěn)增長(zhǎng)，飲食、皮膚與毛發(fā)、行為、活動(dòng)、分泌物(口、鼻、耳和眼)和排泄物(大小便)等均未見(jiàn)明顯異常。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死全部小鼠，大體解剖、尸檢，肉眼觀察，各鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、胃和腸等主要臟器未見(jiàn)出血、充血、水腫、滲出、潰瘍和穿孔，胸腔、腹腔、心包腔無(wú)積液。表明復(fù)方膚參霜灌胃給藥對(duì)小鼠無(wú)明顯急性毒性，其對(duì)小鼠灌胃的最大給藥量為20 mL/kg或20.0 g/kg。實(shí)驗(yàn)7、14 d(實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí))稱(chēng)量小鼠的體重，結(jié)果見(jiàn)表3。在本實(shí)驗(yàn)條件下，KM小鼠口服給藥復(fù)方膚參霜組不能求得LD50，其最大給藥量為20.0 g/kg，該劑量約為人臨床擬用劑量(0.05 g/kg)的400倍。

表3 口服給藥急性毒性試驗(yàn)對(duì)小鼠體重的影響Tab 3 Effect of acute toxicity test of oral administration on body weight of mice n=10)

3.5 復(fù)方膚參霜皮膚給藥小鼠的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

基質(zhì)組和復(fù)方膚參霜組小鼠在皮膚給藥60 min內(nèi)，部分小鼠活動(dòng)偶有減少，出現(xiàn)感覺(jué)不適癥狀(舔、用后肢撓癢背部涂藥處)，至2 h后完全恢復(fù)；實(shí)驗(yàn)期間給藥動(dòng)物無(wú)死亡；觀察期間，小鼠飲食、行為和活動(dòng)等均未見(jiàn)明顯異常；口、鼻、耳和眼無(wú)異常分泌物，排泄物等均正常。用藥處皮膚未見(jiàn)有紅腫、滲出及潰爛等異常改變。實(shí)驗(yàn)7 d時(shí)，脫毛處皮膚毛發(fā)已經(jīng)全部長(zhǎng)出，皮膚光滑平整，復(fù)方膚參霜組與基質(zhì)組未見(jiàn)明顯差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死全部小鼠，大體解剖、尸檢，肉眼觀察各鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、胃和腸等主要臟器未見(jiàn)異常，胸腔、腹腔、心包腔無(wú)積液。小鼠體重穩(wěn)步增長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)7 d時(shí)基質(zhì)組與復(fù)方膚參霜組小鼠體重比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.977>0.05)，見(jiàn)表4。

表4 復(fù)方膚參霜皮膚給藥后對(duì)小鼠體重的影響Tab 4 Effect of compound Fushen cream for cutaneous administration on body weight of mice n=10)

3.6 復(fù)方膚參霜單次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果

完整皮膚組和破損皮膚組新西蘭兔在涂藥后1、24、48和72 h均存活，其飲食、行為活動(dòng)、眼和黏膜、呼吸和精神狀態(tài)、糞便和分泌物均正常，皮膚無(wú)紅斑、水腫等現(xiàn)象，刺激反應(yīng)均為0分。

3.7 復(fù)方膚參霜多次給藥皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果

完整皮膚組和破損皮膚組新西蘭兔在用藥的7 d及停藥1、24、48和72 h后均存活，其飲食、行為活動(dòng)、眼和黏膜、呼吸和精神狀態(tài)、糞便和分泌物均正常，受藥部位皮膚無(wú)色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙和皮膚菲薄等情況，刺激反應(yīng)均為0分，破損皮膚組破損部位已結(jié)痂脫落。病理組織學(xué)改變：可見(jiàn)各組皮膚結(jié)構(gòu)正常，層次清晰，皮膚表皮、真皮、皮下及毛囊附屬器均未見(jiàn)異常，受損皮膚炎癥細(xì)胞較完整皮膚增多，100倍顯微鏡下觀察的病理改變見(jiàn)圖1—2。

A.兔背部完整皮膚病理表現(xiàn)；B.多次涂基質(zhì)后的皮膚病理改變；C.兔背部皮膚涂多次1 g藥膏后病理改變A.pathological features of intact skin of New Zealand rabbits; B.pathological changes of intact skin of New Zealand rabbits after repeated application of substrate; C.pathological changes of intact skin of New Zealand rabbits after repeated application of 1 g ointment圖1 新西蘭兔完整皮膚、多次涂基質(zhì)及藥膏后皮膚病理改變(HE染色，×100)Fig 1 Pathological features of intact skin, pathological changes of intact skin rabbits after repeated application of substrate and ointment of New Zealand (HE staining，×100)

A.兔背部受損皮膚病理表現(xiàn)；B.多次涂基質(zhì)后的皮膚病理改變；C.兔背部皮膚涂多次1 g藥膏后病理改變A.pathological features of damaged skin of New Zealand rabbits; B.pathological changes of damaged skin of New Zealand rabbits after repeated application of substrate; C.pathological changes of damaged skin of New Zealand rabbits after repeated application of 1 g ointment圖2 新西蘭兔受損皮膚、多次涂基質(zhì)及藥膏后皮膚病理改變(HE染色，×100)Fig 2 Pathological features of damaged skin, pathological changes of damaged skin after repeated application of substrate and ointment of New Zealand rabbits (HE staining，×100)

4 討論

復(fù)方膚參霜方中以苦參為君藥，其活性成分為苦參堿和氧化苦參堿，具有抗炎、抗病毒、抗菌、免疫調(diào)節(jié)和抗變態(tài)反應(yīng)的作用[3-6]；以地膚子為臣藥，皂苷為其活性成分，具有止癢、抗菌、抗炎和抗變態(tài)反應(yīng)的作用[7-9]；以丁香為臣藥，丁香油和丁香酚為其活性成分，具有抗菌、抗氧化和鎮(zhèn)痛的作用[10]。9味藥材配伍，共奏清熱除濕、祛風(fēng)止癢的效果；并且可以避免長(zhǎng)期外用糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物可能出現(xiàn)的局部皮膚萎縮變薄、毛細(xì)血管擴(kuò)張、色素沉著和繼發(fā)感染等不良反應(yīng)[11]。

本研究以二甲苯誘發(fā)小鼠耳腫脹，模擬機(jī)體急性炎癥的病理狀態(tài)，以評(píng)價(jià)藥物的抗炎作用，結(jié)果表明，低、中和高劑量復(fù)方膚參霜組小鼠的耳廓腫脹度較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨著復(fù)方膚參霜?jiǎng)┝吭黾樱∈蠖[脹度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。說(shuō)明二甲苯致小鼠耳廓炎癥可被復(fù)方膚參霜顯著抑制，且隨劑量增加效果更顯著。本研究利用磷酸組胺建立豚鼠瘙癢模型[12-14]。結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和低、中和高劑量復(fù)方膚參霜組豚鼠磷酸組胺所致的致癢閾均提高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明復(fù)方膚參霜可顯著提高磷酸組胺對(duì)豚鼠的致癢閾，且隨劑量增加效果更明顯。皮膚給藥的急性毒性試驗(yàn)中未發(fā)生小鼠死亡情況，體重穩(wěn)步增長(zhǎng)。說(shuō)明皮膚給藥途徑下，復(fù)方膚參霜在相應(yīng)最大給藥量劑量范圍內(nèi)的安全性良好。實(shí)驗(yàn)新西蘭兔飲食、行為活動(dòng)、眼和黏膜、呼吸和精神狀態(tài)、糞便和分泌物均正常，皮膚無(wú)紅斑、水腫等現(xiàn)象，刺激反應(yīng)均為0分，病理組織學(xué)切片可見(jiàn)各組皮膚結(jié)構(gòu)正常，層次清晰，皮膚表皮、真皮、皮下及毛囊附屬器均未見(jiàn)異常。

苦參堿注射液可以有效穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜，減少肥大細(xì)胞脫顆粒及降低組胺釋放量[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)，復(fù)方膚參霜能夠顯著提高動(dòng)物的致癢閾值，與余明蓮等[16]的研究結(jié)果一致。有研究結(jié)果證實(shí)，苦參堿能顯著抑制炎癥介質(zhì)LTC4及LTB4的生物合成[17]，能夠降低大鼠TNF-α、IL-6水平[18]，這些可能都是苦參堿產(chǎn)生抗炎作用的機(jī)制。

綜上所述，復(fù)方膚參霜具有較明顯的抗炎、止癢療效，且安全性良好。本研究通過(guò)改變劑型，為臨床提供了一種安全、方便、高效、質(zhì)量可控的止癢、抗炎、抗過(guò)敏新制劑[19]。