劉文竹，胡 欣，江 偉，左秀靜，朱華軍

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV) 是造成慢性肝病的重要病原微生物。HCV感染往往難以引發(fā)適當(dāng)?shù)墓逃忻庖邞?yīng)答，因而導(dǎo)致約80%感染者轉(zhuǎn)為慢性感染，其中部分患者繼而發(fā)展為HCV 感染相關(guān)性肝硬化，甚至肝癌[1，2]。小泛素樣修飾物(small ubiquitin-like modifier，SUMO)化修飾是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的翻譯后修飾過程，廣泛參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和維持基因組穩(wěn)定等過程[3]。與此同時(shí)，SUMO特異性蛋白酶家族(SUMO-specific protease，SENP)的去SUMO化功能發(fā)揮動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)作用，其中SENP3可通過解偶聯(lián)SUMO2和SUMO3，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、細(xì)胞增殖或凋亡，并作為感染、缺氧等多種應(yīng)激的傳感器[4]。近年來，研究顯示脂滴對于HCV的復(fù)制具有關(guān)鍵性作用，而SENP3是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)的重要分子，但SENP3在HCV復(fù)制過程中扮演的角色尚不明確[5]。本研究初步探究了SENP3對HepG2細(xì)胞脂滴水平和HCV復(fù)制的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 HepG2 細(xì)胞和感染性HCV 病毒顆粒( cell-culture-derived infectious HCV，HCVcc) 由安徽醫(yī)科大學(xué)安徽病原生物學(xué)省級(jí)實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM 基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國GIBCO 公司；Lipofectamine? RNAiMAX試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；油紅O、棕櫚酸和油酸購自美國Sigma公司；Trizol RNA提取試劑盒購自Takara公司；實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒購自天根生化科技(北京) 有限公司；抗HCV核心蛋白單克隆抗體、抗SENP3蛋白單克隆抗體和抗GAPDH多克隆抗體購于Cell Signaling公司。HCV RNA、內(nèi)參GAPDH qRT-PCR引物和SENP3-siRNA 寡核苷酸均由吉瑪基因公司合成。HCV RNA引物序列：5′-CTGTCTTCACGCAGAAAGCG-3′，3′- TCGCAACCCAACGCTACTCG-5′；GAPDH引物序列：5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′，3′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-5′；SENP3-siRNA 寡核苷酸序列：5′-GGGCUGGAAAGGUUACUUCdTdT-3′，3′-dTdTCCCGACCUUUCCAAUGAAG-5′。

1.2 HCV感染HepG2細(xì)胞 取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，消化后以1×105個(gè)/孔的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，采用添加10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和10 μg/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃、飽和濕度、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。繼而，按感染復(fù)數(shù)( multiplicity of infection，MOI)為0.5加入HCVcc，分別于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育0 d、3 d和6 d，棄去上清并以預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞后采用Western blot 法檢測HCV核心蛋白和SENP3蛋白表達(dá)量，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3 轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞 采用脂質(zhì)體法，取HepG2細(xì)胞，以1×105個(gè)/孔接種于24孔板，培養(yǎng)過夜。將SENP3-siRNA或NS-siRNA以0.2 pmol/μL(終濃度)溶解于Opti-MEMR溶解液中，另按體積比3：50將LipofectamineRRNAiMAX溶于Opti-MEM?溶解液。將上述溶液等體積輕柔混勻后，室溫孵育5 min，繼而以每孔50 μL混合液加入24孔板，培養(yǎng)3 d。采用Western blot法檢測SENP3蛋白表達(dá)水平。另取上述轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞，加入MOI為0.5的HCVcc，感染3 d，采用Western blot法檢測HCV核心蛋白表達(dá)量，采用qRT-PCR法檢測HCV RNA水平，采用油紅O染色，觀察細(xì)胞脂滴水平[6]。

1.4 細(xì)胞蛋白表達(dá)量檢測 采用Western blot法，將上述預(yù)處理后的細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，以預(yù)冷的PBS洗滌后加入細(xì)胞裂解液，充分吹打后將裂解物轉(zhuǎn)移至EP管中，于冰上振蕩30 min，置于低溫高速離心機(jī)，15000 g離心15 min，轉(zhuǎn)移上清并加入SDS-PAGE上樣緩沖液、煮沸5 min。繼而行SDS-PAGE 電泳，并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。封閉后，根據(jù)蛋白分子量標(biāo)記剪下目的條帶，以GAPDH作為內(nèi)參。分別加入兔抗HCV核心蛋白單克隆抗體( 1：1 000)、兔抗人SENP3單克隆抗體( 1：1 000)、抗GAPDH多克隆抗體( 1：2 000)，4℃孵育過夜。用TBST洗膜3次，加入HRP 標(biāo)記的二抗( 1：5000)，室溫孵育60 min，洗膜后以BCIP /NBT 堿性磷酸脂酶顯色試劑盒顯色，應(yīng)用Image J 軟件行灰度分析[7]。

1.5 細(xì)胞HCV RNA水平檢測 采用qRT-PCR法，取待檢測的細(xì)胞，嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書采用TRIzol 試劑盒提取總RNA，并采用SYBRGreen 法進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)，以GAPDH 作為內(nèi)參基因，反應(yīng)條件為: 95 ℃ 15 s，55℃ 15 s, 68℃ 30 s。循環(huán)進(jìn)行45 次，采用2-ΔΔCt法分析各處理組HCV RNA 水平[8]。

1.6 細(xì)胞回補(bǔ)軟脂酸 將棕櫚酸與油酸按1∶2混合，配置含軟脂酸總濃度為0.5 mmol/L的DMEM完全培養(yǎng)基。棄去HepG2細(xì)胞原培養(yǎng)基，以上述含脂肪酸培養(yǎng)基于37 ℃、飽和濕度、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h[9]。

1.7 細(xì)胞脂滴檢測 用PBS洗滌細(xì)胞，采用40 g/L多聚甲醛溶液室溫固定10 min，繼而以5 g/L油紅O在避光條件下染色60 min，用PBS洗滌細(xì)胞，以100 ng/ml DAPI染色10 min，用PBS洗滌后，在鏡下觀察細(xì)胞[9]。

2 結(jié)果

2.1 HCV感染HepG2細(xì)胞SENP3蛋白表達(dá)量上調(diào) 在HCV與HepG2細(xì)胞共孵育后的第一天、第三天和第六天，檢測顯示以GAPDH作為內(nèi)參，HCV 核心蛋白相對表達(dá)量分別為0.01±0.00、0.17±0.02和0.43±0.04，SENP3蛋白相對表達(dá)量分別為0.23±0.04、0.42±0.03和0.46±0.04，兩蛋白表達(dá)量進(jìn)行性升高(P<0.05)，提示HCV有效感染HepG2細(xì)胞，并且病毒復(fù)制增強(qiáng)。與此同時(shí)，SENP3蛋白表達(dá)量也相應(yīng)增強(qiáng)，提示在HepG2細(xì)胞，HCV感染促進(jìn)了SENP3表達(dá)(圖1)。

圖1 HCV感染HepG2細(xì)胞SENP3蛋白表達(dá)A：HepG2細(xì)胞HCV 核心蛋白和SENP3蛋白表達(dá)；B：隨感染時(shí)間延長，蛋白表達(dá)增強(qiáng)與第一天比， aP<0.01； 與第三天比，bP<0.05

2.2 敲低SENP3蛋白表達(dá)抑制HCV 復(fù)制 采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染SENP3-siRNA至HepG2細(xì)胞，以非特異性siRNA作為對照，經(jīng)Western blot法檢測顯示SENP3蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明該方法可有效下調(diào)SENP3表達(dá)(圖2A)；繼而，以HCV感染SENP3敲低后的細(xì)胞，檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞HCV核心蛋白相對水平明顯低于對照組(圖2B)。以轉(zhuǎn)染非特異性siRNA組細(xì)胞為參照，SENP3敲低組細(xì)胞HCV RNA水平為54.23±11.35 %，較轉(zhuǎn)染非特異性siRNA組細(xì)胞顯著降低(P<0.01，圖2C)，初步表明SENP3蛋白促進(jìn)HCV復(fù)制。

圖2 敲低SENP3的HepG2細(xì)胞HCV復(fù)制變化A：轉(zhuǎn)染SENP3-siRNA后，細(xì)胞SENP3蛋白表達(dá)水平下調(diào)；B：敲低SENP3細(xì)胞HCV 核心蛋白表達(dá)下調(diào)；C：敲低SENP3細(xì)胞HCV RNA水平下調(diào)與轉(zhuǎn)染NS-siRNA比，aP<0.01

2.3 敲低SENP3蛋白表達(dá)后細(xì)胞脂滴水平變化 以油紅O對轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞進(jìn)行染色，在熒光倒置顯微鏡下觀察可見轉(zhuǎn)染非特異性siRNA的HepG2細(xì)胞質(zhì)中散布較多的紅色熒光斑點(diǎn)，而轉(zhuǎn)染SENP3-siRNA的細(xì)胞中熒光斑點(diǎn)顯著減少，見圖3。

圖3 敲低SENP3細(xì)胞脂滴變化 轉(zhuǎn)染SENP3-siRNA細(xì)胞紅色熒光斑點(diǎn)數(shù)顯著少于轉(zhuǎn)染NS-siRNA細(xì)胞(油紅O/DAPI染色， 400×)

2.4 SENP3下調(diào)后回補(bǔ)軟脂酸對HCV復(fù)制的影響 以轉(zhuǎn)染非特異性siRNA組細(xì)胞為參照，經(jīng)qRT-PCR法檢測顯示敲低SENP3的HepG2細(xì)胞HCV RNA相對水平為58.2±5.2%，較轉(zhuǎn)染非特異性siRNA組細(xì)胞顯著降低(P<0.01)，而以軟脂酸處理SENP3敲低的HepG2細(xì)胞，HCV RNA相對水平為74.6±6.4%，較未經(jīng)軟脂酸處理組細(xì)胞顯著升高(P<0.01，圖4)。

圖4 回補(bǔ)軟脂酸對細(xì)胞HCV復(fù)制的影響與轉(zhuǎn)染NS-siRNA比，aP<0.01，與轉(zhuǎn)染SENP3-siRNA比，bP<0.01

3 討論

脂滴是由單層兩性磷脂包裹疏水核心構(gòu)成，用于貯存膽固醇酯、三酰甘油等多種中性脂，并可轉(zhuǎn)化游離脂肪酸以避免抑制脂肪酸積聚及其毒性衍生物的產(chǎn)生[10]。脂滴不僅參與調(diào)控脂質(zhì)代謝、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，在細(xì)菌、病毒、寄生蟲在內(nèi)的多種病原體感染和免疫過程中亦發(fā)揮重要的相互作用[11,12]。HCV可通過“劫持”宿主的脂質(zhì)進(jìn)行增殖。HCV利用脂蛋白的組裝和分泌進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在富含脂質(zhì)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜室開始病毒衣殼的形成之前，HCV與脂滴相互作用[13]。以載脂蛋白E (apoE)為代表的交換性載脂蛋白在增強(qiáng)HCV特異性傳染過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[14]。與此同時(shí)，HCV病毒粒子可能與血管中循環(huán)的其他脂蛋白相互作用，并與載脂蛋白和脂質(zhì)結(jié)合[15]。目前認(rèn)為，在HCV感染的過程中，脂滴參與HCV復(fù)制、組裝和病毒顆粒釋放，影響HCV生活周期，并為HCV的能量儲(chǔ)存器和脂質(zhì)儲(chǔ)庫[16]。在HCV復(fù)制時(shí)，病毒可利用脂滴相關(guān)蛋白47 kD 尾連蛋白(tail-interacting protein 47 kD，TIP47)作為新型輔助因子，通過非結(jié)構(gòu)蛋白5 (nonstructural protein 5，NS5A)蛋白與其相互作用，從而將脂滴膜整合至HCV復(fù)制所需膜網(wǎng)結(jié)構(gòu)中[17]。此外，NS5A可與另一種脂滴相關(guān)蛋白R(shí)ab18結(jié)合進(jìn)而將復(fù)制位點(diǎn)募集至脂滴上[18]。近年來的研究顯示，SUMO特異性蛋白酶家族成員SENP3在脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮重要的作用，參與非酒精性脂肪肝等脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展。然而，據(jù)我們所知，SENP3是否參與HCV感染過程，尚未見報(bào)道[19]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HCV感染HepG2細(xì)胞可上調(diào)SENP3蛋白表達(dá)水平，而敲低SENP3則降低HCV感染后HCV核心蛋白表達(dá)和HCV RNA水平，而HepG2細(xì)胞脂滴水平也下降。這些結(jié)果初步表明在HCV感染過程中SENP3可促進(jìn)HCV的復(fù)制并調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，提示HCV可能通過影響SENP3表達(dá)作為促進(jìn)其復(fù)制的策略之一?；谥慰赊D(zhuǎn)化游離脂肪酸為中性脂并將其存儲(chǔ)的功能，HepG2細(xì)胞與軟脂酸共孵育可提高脂滴水平[20]。在敲低HepG2細(xì)胞SENP3蛋白表達(dá)水平后，采用軟脂酸回補(bǔ)脂滴水平可有效降低SENP3蛋白表達(dá)下調(diào)對HCV復(fù)制的影響，表明SENP3可能通過調(diào)節(jié)脂滴代謝而促進(jìn)細(xì)胞HCV復(fù)制。有趣的是，有研究顯示在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染HepG2細(xì)胞時(shí)，SENP3可通過抑制肝細(xì)胞AKT磷酸化水平從而抑制HBV DNA載量，且HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織SENP3表達(dá)顯著降低[21]。在HepG2-NTCP細(xì)胞和人源化小鼠模型，感染HBV的肝細(xì)胞SENP3表達(dá)水平下降，下調(diào)SENP3可減少HBV復(fù)制并促進(jìn)宿主蛋白翻譯，這可能是肝細(xì)胞的宿主防御機(jī)制之一[22]。上述研究提示SENP3在不同噬肝病毒感染過程中可發(fā)揮差異性作用。

綜上所述，本研究初步顯示SENP3可作為新的宿主因子，通過調(diào)節(jié)脂滴水平促進(jìn)HCV的復(fù)制，并可能為治療HCV感染性疾病提供新的靶點(diǎn)。后續(xù)，我們將細(xì)化研究涉及該現(xiàn)象的信號(hào)通路，以進(jìn)一步明確其分子調(diào)節(jié)機(jī)制。