楊美萍,何江濤*,鄒 華,鄧 璐,張金剛

(1.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(北京)水資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100083;2.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(北京)水資源與環(huán)境工程北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

0 引 言

近年來，環(huán)境中抗生素對(duì)反硝化過程的影響已被多項(xiàng)研究證實(shí)。Chen等研究指出諾氟沙星濃度從0 μg·L增加到100 μg·L時(shí)，硝酸鹽去除率從0.68 mg·L·h降低到0.44 mg·L·h；Ahmad等研究表明1.0 mg·L磺胺二甲嘧啶和金霉素對(duì)亞硝酸鹽的抑制率分別為82.0%和31.1%；D’Alessio等研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用莫能菌素或磺胺二甲嘧啶對(duì)亞硝酸鹽還原無影響，而莫能菌素、林可霉素和磺胺二甲嘧啶的聯(lián)合使用可通過抑制亞硝酸鹽的還原影響反硝化過程。根據(jù)這些研究可以看出，反硝化過程所受影響與抗生素的種類、濃度以及聯(lián)合使用息息相關(guān)。

此外，有研究指出抗生素的輸入方式也是重要的影響因素。例如，Yi等研究發(fā)現(xiàn)在厭氧和好氧環(huán)境交替條件下，一次性輸入2 mg·L環(huán)丙沙星對(duì)總氮去除無影響，而連續(xù)輸入可使其去除率減少15.6%，且有亞硝酸鹽積累的現(xiàn)象；Chen等研究表明一次性輸入磺胺甲惡唑的濃度越高，對(duì)反硝化活性影響越大，分階段連續(xù)輸入由低到高濃度的磺胺甲惡唑，在0.1 mg·L增加至2 mg·L時(shí)反硝化活性逐漸減弱，而2 mg·L增加至100 mg·L時(shí)反硝化活性有所恢復(fù)；Li等設(shè)計(jì)了連續(xù)6個(gè)周期更換上清液以及輸入10 mg·L鹽酸金霉素的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明硝酸鹽去除率不受影響，但去除速率降低了67.0%；姚曉婧研究發(fā)現(xiàn)，在與文獻(xiàn)[6]相同的實(shí)驗(yàn)條件下，連續(xù)輸入1 mg·L鹽酸金霉素可使硝酸鹽去除率降低了27.78%，明顯抑制了反硝化過程。在上述這些研究中多采用模擬實(shí)驗(yàn)的方式，環(huán)境中抗生素的輸入方式主要有一次輸入、間斷輸入和連續(xù)輸入，在一定程度上可分別反映含抗生素等污水和廢水一次性、分批次進(jìn)入環(huán)境介質(zhì)，或者畜牧養(yǎng)殖場(chǎng)、污水處理廠等場(chǎng)地長(zhǎng)期連續(xù)排放到水環(huán)境和土壤環(huán)境中等情景。從已有的研究結(jié)果來看，抗生素輸入方式對(duì)反硝化過程有明顯影響，但是缺少抗生素總量相同時(shí)，不同輸入方式對(duì)反硝化過程影響的對(duì)比研究。此外，鹽酸洛美沙星(Lomefloxacin Hydrochloride,LOM)污染很常見，在水環(huán)境和城市污水處理廠中抗生素的檢出濃度多集中在每升納克級(jí)到微克級(jí)之間，醫(yī)療相關(guān)的水環(huán)境中可檢測(cè)到濃度高于每升毫克級(jí)的抗生素。因此，進(jìn)一步探討不同濃度抗生素在總量相同、輸入方式不同時(shí)的影響，對(duì)揭示水土環(huán)境中不同抗生素污染情景具有重要的實(shí)際意義。

基于此，本文選取典型抗生素LOM，分別以一次輸入和兩次輸入兩種方式開展批實(shí)驗(yàn)，探究水環(huán)境和醫(yī)療廢水環(huán)境濃度(200 ng·L和2 mg·L)條件下LOM對(duì)反硝化過程的不同影響，并從微生物響應(yīng)方面探究其影響機(jī)制，以期為水土環(huán)境中不同污染模式下抗生素對(duì)反硝化過程產(chǎn)生的影響提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 抗生素的選擇

Zou等研究表明，氟喹諾酮類抗生素LOM在低濃度條件下對(duì)(假單胞菌屬)、(寡養(yǎng)單胞菌屬)和(無色桿菌屬)占主導(dǎo)的反硝化細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用，其抗菌機(jī)制是抑制核酸的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，影響細(xì)胞活性和酶的合成，具有抗菌譜廣、作用強(qiáng)、高效等特點(diǎn)，溶解度為27.2 mg·mL。因此，本實(shí)驗(yàn)選取第三代氟喹諾酮類抗生素LOM作為典型抗生素。實(shí)驗(yàn)所用LOM購置于上海麥克林生化科技有限公司，其純度高于98%。

1.1.2 碳源的選擇

納米乳化油是一種新型綠色緩釋液態(tài)碳源，具有廉價(jià)、無毒、緩釋和長(zhǎng)效等特性。在以往抗生素對(duì)反硝化過程影響的研究中，納米乳化油在維持穩(wěn)定的反硝化條件以及多個(gè)實(shí)驗(yàn)周期順利進(jìn)行等方面取得了良好的效果。因此，本研究同樣選擇納米乳化油作為碳源，以營(yíng)造穩(wěn)定的反硝化環(huán)境。

1.1.3 反硝化菌的選擇

水環(huán)境中有多種反硝化菌，為保證實(shí)驗(yàn)更貼合真實(shí)的水環(huán)境狀況，選擇上海甘度環(huán)境工程有限公司提供的菌種。該菌種提取于自然環(huán)境中的混合反硝化菌，主要是由假單胞菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、科奈瑟菌科、紅螺菌科、芽孢桿菌科、纖維粘菌科等組成的反硝化菌群，對(duì)總氮的去除效率大于90%，適應(yīng)溫度為10 ℃～60 ℃，pH值為6～9。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究共設(shè)計(jì)5組實(shí)驗(yàn)，每組包含3個(gè)平行對(duì)照，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。每個(gè)反應(yīng)體系裝有1 L的反應(yīng)溶液，反應(yīng)溶液含有常規(guī)組分NaHCO(質(zhì)量為0.208 0 g)、NaSO(0.073 9 g)、NaCl(0.041 1 g)和污染組分KNO(0.360 9 g)。溶液pH值調(diào)節(jié)至7.1±0.1，經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌和氬氣吹掃20 min后，加入0.75 g反硝化菌劑和3 mL納米乳化油密封，最后利用錫箔紙包裹反應(yīng)容器，為反硝化菌提供避光環(huán)境以及防止抗生素的光解。

表1 各反應(yīng)體系LOM濃度和投加方式Table 1 Concentrations and Adding Methods of LOM in Each Reaction System

1.2.2 實(shí)驗(yàn)裝置

模擬實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示。其中，反應(yīng)容器為1.5 L的廣口瓶，裝有1 L反應(yīng)溶液；用套針和探針式溫度計(jì)穿透的橡膠塞密封，套針用于取樣，溫度計(jì)用于監(jiān)測(cè)反硝化環(huán)境的溫度。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig.1 View of Experimental Setup

1.3 分析方法

表2 PCR引物序列Table 2 Sequences of Primers in PCR Conductions

2 結(jié)果分析與討論

2.1 常規(guī)指標(biāo)及氮素濃度的變化

各反應(yīng)體系的常規(guī)指標(biāo)溫度()、pH值和總有機(jī)碳平均值如表3所示。溫度和pH值會(huì)影響微生物的反硝化速率。當(dāng)<15 ℃，pH值小于6.5或大于9時(shí)，反硝化速率會(huì)下降。實(shí)驗(yàn)兩個(gè)階段內(nèi)溫度在20.50 ℃～20.90 ℃之間波動(dòng)，pH值在7.57～8.18之間波動(dòng)，均屬于正常的反硝化環(huán)境?？傆袡C(jī)碳可反映反硝化菌維持正常生命活動(dòng)所需碳源是否充足，實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)總有機(jī)碳平均值為164.89～286.38 mg·L，變化范圍較大。其原因是微生物的利用和定期取樣使納米乳化油含量逐漸減少，但各反應(yīng)體系總有機(jī)碳均大于115 mg·L，滿足反硝化過程所需碳源，其不會(huì)成為制約反硝化過程的因素。

表3 各反應(yīng)體系溫度、pH值和總有機(jī)碳平均值Table 3 Average Values of Temperature,pH and TOC of Each Reaction System

表4 各反應(yīng)體系去除率和抑制率Table 4 Removal and Inhibition Rates of in Each Reaction System

馴化階段的Ⅴ周期也是正式實(shí)驗(yàn)階段的空白周期；Ⅰ～Ⅳ誤差棒表示15個(gè)平行樣之間標(biāo)準(zhǔn)差，Ⅴ～Ⅷ誤差棒表示3個(gè)平行樣之間標(biāo)準(zhǔn)差圖2 Ⅰ～Ⅷ周期和濃度變化Fig.2 Concentration Variations of and in Ⅰ-Ⅷ Cycles

2.2 反硝化動(dòng)力學(xué)特征

反硝化過程硝酸鹽的還原符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和Monod動(dòng)力學(xué)模型。本文對(duì)各反應(yīng)體系進(jìn)行動(dòng)力學(xué)擬合，以期獲取擬合參數(shù)來進(jìn)一步說明LOM對(duì)反硝化過程的影響。

2.2.1 一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型

圖3 Ⅴ～Ⅷ周期各反應(yīng)體系還原一級(jí)動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 First-order Kinetic Plots of Concentrations for Each Reaction System in Ⅴ-Ⅷ Cycles

2.2.2 Monod動(dòng)力學(xué)模型

表還原一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合方程及參數(shù)Table 5 First-order Kinetic Fitting Equation and Parameters of Concentration

表6 各反應(yīng)體系最大還原速率隨周期變化Table 6 Variation of Vmax with Cycle for Each Reaction System

2.3 微生物數(shù)量和活性

誤差棒表示各周期OD600值或OD490值標(biāo)準(zhǔn)差圖4 Ⅴ～Ⅷ周期各反應(yīng)體系OD600和OD490平均值柱狀圖Fig.4 Histograms of Average Values of OD600 and OD490 for Each Reaction System in Ⅴ-Ⅷ Cycles

投加抗生素后微生物數(shù)量和活性的變化可以反映抗生素對(duì)反硝化過程的影響。細(xì)菌數(shù)量用菌懸液在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定的吸光度表征，吸光度越大，細(xì)菌數(shù)量越多；細(xì)菌活性用LDH釋放試劑和LDH檢測(cè)工作液孵育后的菌懸液在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度表征，LDH釋放也被看做細(xì)胞膜完整性的重要指標(biāo)，吸光度越大，具有活性的細(xì)胞數(shù)量越多。Ⅴ～Ⅷ周期各體系OD和OD平均值如圖4所示。各反應(yīng)體系實(shí)驗(yàn)周期的細(xì)菌數(shù)量和活性均小于空白周期，且隨周期的進(jìn)行逐漸減小。分析其原因?yàn)長(zhǎng)OM導(dǎo)致了DNA斷裂、細(xì)胞死亡和細(xì)胞膜破裂，使細(xì)菌數(shù)量和活性均減小，進(jìn)而抑制了反硝化過程。

圖5 各反應(yīng)體系的OD600和OD490抑制率及其相關(guān)性Fig.5 Inhibition Rates of OD600 and OD490 for Each Reaction System and Their Correlation

2.4 微生物的豐富度、多樣性和群落結(jié)構(gòu)

表7 微生物群落Alpha多樣性指數(shù)Table 7 Alpha Diversity Indexes of Microbial Community

為進(jìn)一步說明微生物受LOM不同輸入方式的影響，對(duì)各樣本物種豐度進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖6所示。圖6右側(cè)揭示了屬層面相對(duì)豐度較大的20種菌屬，左側(cè)是對(duì)各樣本進(jìn)行聚類而建立的聚類樹。各反應(yīng)體系的6種主導(dǎo)菌屬中，、(蒼白桿菌屬)、(無色桿菌屬)、(固氮螺菌屬)、(鞘氨醇桿菌屬)和(腸桿菌屬)均為水環(huán)境中典型的反硝化菌屬，具有較強(qiáng)的反硝化作用。投加抗生素后的Ⅷ周期，各反應(yīng)體系主導(dǎo)菌屬的豐度發(fā)生變化。其中，#1體系Ⅷ周期末的主導(dǎo)菌屬豐度減小，豐度增大；#2和#5體系在Ⅷ周期末分別增加了11.1%和9.57%，這兩組體系抗性基因豐度大，微生物對(duì)抗生素有一定抵抗力，高濃度體系中部分微生物大量死亡使豐度增加；#3體系的主導(dǎo)菌屬和變化較??；#4體系的逐漸被取代。由聚類結(jié)果可以看出，含LOM體系與不含LOM體系的物種豐度有一定差異，而同一體系的物種豐度在Ⅶ周期和Ⅷ周期趨于聚類，相似度較高，沒有顯著性差異(>0.05)，表明Ⅷ周期末不能體現(xiàn)微生物群落結(jié)構(gòu)變化受輸入方式的影響，這可能與群落結(jié)構(gòu)的響應(yīng)滯后于細(xì)菌數(shù)量和活性有關(guān)。

圖6 各樣本物種相對(duì)豐度聚類圖Fig.6 Cluster Diagram of Species Relative Abundance of Each Sample

2.5 抗性基因及其潛在宿主

抗性基因與內(nèi)參基因比值單位為copies/16SrRNA;圖(b)中,**表示p<0.01，*表示p<0.05圖7 抗性基因聚類熱圖及其與細(xì)菌菌屬的Person相關(guān)性聚類熱圖Fig.7 Cluster Heatmaps of ARGs and Person Correlation Between ARGs and Bacterial Genera

細(xì)菌耐藥性是對(duì)試圖阻止其生長(zhǎng)的外界條件的自然適應(yīng)。微生物處理含抗生素污水往往會(huì)產(chǎn)生抗性基因(ARGs)，并通過外排抗生素、修飾抗生素作用靶點(diǎn)、保護(hù)細(xì)胞核糖體和使抗生素失活等方式來減少抗生素對(duì)微生物的毒害作用，并使微生物保持正常的脫氮能力。本研究檢測(cè)了反硝化菌的6種氟喹諾酮類抗性基因(、、、、和)，抗性基因聚類熱圖以及抗性基因與細(xì)菌菌屬Person相關(guān)性聚類熱圖如圖7所示。在6種抗性基因中，豐度最高，在#2體系內(nèi)有較高豐度，其他抗性基因豐度均小于0.01 copies/16SrRNA，可忽略不計(jì)。由各樣本抗性基因聚類樹可知，不同反應(yīng)體系抗性基因豐度變化不同，進(jìn)一步進(jìn)行顯著性差異分析表明：各反應(yīng)體系在Ⅶ周期末到Ⅷ周期末的抗性基因豐度變化不受抗生素輸入方式影響(>0.05)，這可能與抗性基因的響應(yīng)具有滯后性有關(guān)。此外，抗性基因與細(xì)菌菌屬的Person相關(guān)性顯示，、和菌屬分別為抗性基因、和的潛在宿主，在#2和#5體系中豐度較大。分析其原因?yàn)橥都覮OM后，的潛在宿主豐度增加并形成優(yōu)勢(shì)種群，使微生物攜帶的抗性基因增多，但可能是由于具有低抗性或微生物大量死亡，反硝化過程仍受到了不同程度的抑制作用。

本文研究結(jié)果表明高濃度抗生素一次性輸入在短期內(nèi)對(duì)反硝化過程的影響不容忽視，這為水土環(huán)境中抗生素不同污染模式下對(duì)反硝化過程產(chǎn)生的影響提供參考，但由于實(shí)驗(yàn)周期較短，長(zhǎng)期以不同輸入方式輸入抗生素對(duì)反硝化過程以及群落結(jié)構(gòu)與抗性基因的影響尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 語