皮 凱，黃 鶯，段麗麗，莫澤君，羅 雯，柯漁洲，王平松，曾帥波，劉仁祥

（貴州大學煙草學院/貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

0 引言

【研究意義】煙草（Nicotiana tabacumL.）是我國重要的經(jīng)濟作物，大田生育期120～130 d左右，植株高大，需要大量的水分和營養(yǎng)元素供生長發(fā)育，而這些物質(zhì)均通過根系向地上部運輸（劉國順，2012）。根系是植物植物生長必不可少的源器官，具有吸收并運輸土壤水分和無機鹽、固定及支撐植株、合成氨基酸及蛋白質(zhì)等功能（郭毓勉，2020），對煙株的生長發(fā)育和煙葉產(chǎn)量、品質(zhì)有很大的影響（晁逢春等，2003）。此外，煙葉中的煙堿是通過根系合成后運輸至葉片中，對煙草的吸食品質(zhì)極其重要（莫澤君，2020）。利用雜種優(yōu)勢可獲得煙堿含量和鉀含量優(yōu)于親本的煙草雜交種（王國琴，2015；羅雯等，2022），而煙堿雜種優(yōu)勢的形成是因為雜交種具有更高的煙堿合成效率（Tian et al.，2018；莫澤君，2020），表明煙草根系可能是煙堿含量和鉀含量雜種優(yōu)勢形成的基礎，直接影響煙草植株發(fā)育及煙葉品質(zhì)。因此，研究煙草根系雜種優(yōu)勢表現(xiàn)及相關基因的差異表達有利于解析煙草地上部分雜種優(yōu)勢的形成機制，對選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雜交種具有重要的指導意義?！厩叭搜芯窟M展】煙草根系由主根、側根和不定根組成，其中側根和不定根最發(fā)達，不定根約占煙草總根重的1/3，成為根系的主要部分（黃澤春等，2008）。晁逢春等（2003）研究表明煙草不定根中的煙堿含量顯著高于主根和側根中的煙堿含量，調(diào)控不定根的發(fā)育將對葉片煙堿含量發(fā)揮積極作用。目前對煙草根系發(fā)育的研究主要集中在營養(yǎng)物質(zhì)（蔡賽男，2015；李玥等，2015）、遺傳因素（許杰等，2017a；鐘思榮，2018；Singh et al.，2018）、生長調(diào)節(jié)劑（王守剛等，2015；張兆揚等，2017；Song et al.，2019；張琳等，2019；馮長春等，2020）、栽培方式（王德俊等，2019）等方面。蔡賽男（2015）研究發(fā)現(xiàn)根系構型參數(shù)最大的烤煙品種K326煙葉中的氮含量、鉀含量及干物質(zhì)量的積累均達國際標準，煙葉品質(zhì)較好，而根系構型參數(shù)最小的烤煙品種G80煙葉氮含量和鉀含量相對較低，同時其煙葉干物質(zhì)量的積累相對較少。李玥等（2015）研究表明缺氮處理促進K326和湘煙四號烤煙根系生長，然而地上部生物量明顯下降。許杰等（2017b）研究表明烤煙F1代的根系具有較強的雜種優(yōu)勢，其中根體積和根系陽離子交換量（CEC）的遺傳以基因的加性效應為主，烤煙根系活力和腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）酶活性的遺傳以基因的顯性效應為主。王宇辰等（2018）研究表明低濃度La3+能促進煙草根系發(fā)育，顯著提高了根系生物量和根活力，高濃度La3+則表現(xiàn)出一定抑制作用。王德俊等（2019）研究表明不同覆蓋模式對烤煙根系活力具有顯著影響，其中“旺長期揭膜+培土+覆蓋稻草”覆蓋模式的根系活力最高。馮長春等（2020）研究表明外源吲哚乙酸（IAA）處理顯著提高了烤煙幼苗根系生物量，10 nmol/L處理較對照增幅分別為89.43%，不同濃度IAA處理的烤煙幼苗根系總長度、總表面積和體積均不同程度的增加。李秀春等（2020）對煙草施用火土灰處理能顯著增加植株根系總根長、根系表面積、根系體積和煙株苗期生物量。近年來，在其他作物中與根系發(fā)育相關的基因已有大量研究，擬南芥AtFLA18、At-PIN3、AtYUC6和AtNAC2基因通過調(diào)控根系的發(fā)育和形成來改變根系結構（He et al.，2005；Omelyanchuk et al.，2016；Allelign et al.，2021）；AtAUX1具有調(diào)節(jié)根的向地性和根毛發(fā)育的功能（Villaecija-Aguilar et al.，2022）。水稻OsCRL1和OsDGL1基因及生長素信號響應因子基因OsARF16在水稻側根的發(fā)育形成和冠根起始中發(fā)揮關鍵作用（Liu et al.，2005；Qin et al.，2013；Lavarenne et al.，2019）。尚未見煙草根系發(fā)育相關基因的研究報道?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組前期研究表明，雜交種中更強的煙堿合成效率和鉀離子吸收能力是地上部分煙葉煙堿含量和鉀含量表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢的重要原因（Tian et al.，2018；羅雯等，2022）。因此，推測雜交種煙葉中煙堿含量和鉀含量雜種優(yōu)勢的形成可能與雜交種的根系發(fā)育有關，但關于煙草根系的雜種優(yōu)勢表現(xiàn)及相關基因差異表達分析尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究基于課題組前期研究基礎（莫澤君，2020；羅雯等，2022），選用煙堿和鉀含量性狀具有雜交優(yōu)勢的雜交組合及其親本為材料，通過測定根系長度、數(shù)量和體積，分析了雜交種根系優(yōu)勢的表現(xiàn)，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測煙草雜交種根系優(yōu)勢相關基因的差異表達，為深入解析煙葉煙堿含量和鉀含量雜種優(yōu)勢的形成機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的3個母本品種（系）為K326、Va116和G70，4個父本品種（系）為南江三號、GDH88、畢納一號和韭菜坪2號，按照NCⅡ設計將其配制成12個雜交組合，所有材料均由貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室制種和保存。RNAprep Pure Plant Kit試劑盒、Fast-King gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒和Talent qPCR PreMix（SYBR Green）試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。主要儀器設備：WinRHIZO根系掃描儀LA2400（Regent，加拿大）、CFX96 Real-Time System（Bio-Rad，美國）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）、冷凍離心機（Thermo，美國）和PowerPac電泳儀（Bio-Rad，美國）。

1.2 試驗設計

試驗于2021年在貴州省安順市楊武鄉(xiāng)貴州大學煙草科研基地進行，采用漂浮育苗，待煙株長至6片真葉時，每個材料選取3株大小一致、生長良好的煙草幼苗。將根系洗凈后測定根系表型，從每株中選取根系鮮活末端，立即用液氮處理后存入-80 ℃冰箱，供后續(xù)RNA的提取和基因表達量的測定。

1.3 根系性狀測定方法

對洗凈的完整根系使用WinRHIZO根系掃描儀LA2400進行掃描，獲得清晰的根系結構圖像。使用WinRhizo Pro 2013a對煙草根系圖像進行分析，得到根長、根體積和根數(shù)量等特征參數(shù)。

1.4 基因表達量檢測

1.4.1 總RNA提取及cDNA合成 采用RNAprep Pure Plant Kit試劑盒提取總RNA，按FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒說明反轉錄合成cDNA第一鏈。

1.4.2 實時熒光定量PCR檢測 在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索8個在擬南芥和水稻中與根系發(fā)育相關的基因（表1），獲得其cDNA全長序列，通過煙草K326基因組（https：//solgenomics.net/organism/Nicotiana_tabacum/genome）比對到高度同源的序列后，根據(jù)此序列利用Primer 5.0設計引物，并委托北京擎科生物科技有限公司合成。按照Talent qPCR PreMix（SYBR Green）試劑盒說明對這些基因進行實時熒光定量PCR檢測。反應體系20.0 μL：2×Talent qPCR Pre-Mix 10.0 μL，上、下引物（10 μmol/L）各0.6 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 補足至20.0 μL。擴增程序：95 ℃3 min；95 ℃5 s；退火溫度（表1）10 s，75 ℃15 s，進行40個循環(huán)。每個樣品設3次技術重復，以K326為對照，采用比較閾值法（2-ΔΔCt）法計算各基因相對表達量（Livak and Schmitten，2001）。

表1 根系發(fā)育相關基因及其引物信息Table 1 Root development related genes and their primers

1.5 雜種優(yōu)勢計算方法

以中親優(yōu)勢進行根系性狀的雜種優(yōu)勢分析。中親優(yōu)勢是指雜種F1代某一數(shù)量平均值與雙親同一性狀平均值的差值占雙親均值的百分比。參照陳澤輝（2009）方法計算根系長度、數(shù)量和體積的雜種優(yōu)勢，計算公式如下：

式中，F(xiàn)1表示雜交種。

1.6 統(tǒng)計分析

采用Excel 2013和DPS 7.05對相關數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 親本及雜交組合間根系的差異分析

由表2可知，7個親本材料的根系長度為94.80～476.77 cm，根系數(shù)量為343～820條，根系體積為0.18～0.61 cm3，其中，Va116的根系數(shù)量和長度顯著高于其余6個親本（P＜0.05，下同），根系體積（除顯著小于南江三號外）均顯著高于其他5個親本材料。此外，韭菜坪2號和畢納1號的根系長度、數(shù)量和體積均顯著低于其他5個親本，結果表明親本間根系的各性狀存在遺傳差異，適于用來開展煙草根系的遺傳利用研究。

表2 親本間根系性狀差異分析Table 2 Analysis of differences in root traits among parents

由表3可知，12個雜交組合的根系長度為285.56～734.75 cm，根系數(shù)量為576～1184條，根系體積為0.41～1.01 cm3；K326×GDH88的根系長度和根系數(shù)量顯著高于其他雜交組合，G70×南江三號的根系體積顯著高于其他雜交組合；各性狀的變異系數(shù)為19.97%～29.68%。由此可知，12個雜交組合的根系性狀存在明顯差異和遺傳變異，表明利用雜種優(yōu)勢可選育出不同根系長度、數(shù)量和體積的雜交種。

表3 12個雜交組合間根系性狀差異分析Table 3 Analysis of differences in root traits among hybrid combinations

2.2 煙草根系的遺傳特點分析結果

2.2.1 遺傳力及配合力方差 由煙草根系各性狀的遺傳力及配合力方差結果（表4）可知，煙草根系長度、數(shù)量和體積的廣義遺傳力分別為95.49%、92.12%和85.76%，表明根系長度、數(shù)量和體積的遺傳力高，受環(huán)境影響較小。根系長度的一般配合力大于特殊配合力，表明根系長度主要受到基因加性效應的影響；根系數(shù)量和體積的特殊配合力方差高于一般配合力方差，表明這兩個性狀主要受到基因非加性效應的作用，適于采用雜種育種方法進行遺傳改良。

表4 煙草根系各性狀的遺傳力和配合力方差Table 4 Variance of heritability and combining ability of tobacco root traits

2.2.2 一般配合力和特殊配合力分析 一般配合力是指一個自交系與其他多個自交系雜交后遺傳給F1代性狀的平均表現(xiàn)，由基因的加性效應決定，可穩(wěn)定遺傳。選擇一般配合力高的材料作親本，更易獲得優(yōu)良的雜交組合。由7個親本根系性狀的一般配合力（表5）可知，在根系長度和體積2個性狀上，分別有3個親本的一般配合力表現(xiàn)為正向效應，4個親本的一般配合力表現(xiàn)為負向效應；在根系數(shù)量上，有2個親本的一般配合力表現(xiàn)為正向效應，5個親本的一般配合力表現(xiàn)為負向效應。通過進一步分析發(fā)現(xiàn)，GDH88和Va116可作為改良根系長度和數(shù)量的優(yōu)良親本，南江三號、Va116和G70可作為改良根系體積的優(yōu)良親本。

表5 7個親本根系各性狀的一般配合力相對效應值Table 5 Relative effect values of GCA of root traits of 7 parents

特殊配合力是指兩個特定自交系所組配性狀的表現(xiàn)水平，由非加性效應基因決定，即受基因的顯性和上位性互作效應影響，只能在特定的組合中由雙親基因互作反映出來，不可遺傳。特殊配合力的高低可為優(yōu)良雜交組合的選育提供依據(jù)。由12個雜交組合根系性狀的一般配合力（表6）可知，5個雜交組合根系長度的特殊配合力表現(xiàn)為正向效應，6個雜交組合的根系數(shù)量特殊配合力表現(xiàn)為正向效應，4個雜交組合的根系體積特殊配合力表現(xiàn)為正向效應。通過進一步分析發(fā)現(xiàn)，K326×GDH88、Va116×畢納1號和G70×韭菜坪2號是根系長度較為理想的烤煙雜交組合；G70×南江三號、K326×韭菜坪2號和K326×GDH88是根系數(shù)量較為理想的烤煙雜交組合；K326×GDH88、G70×南江三號和Va116×畢納1號是根系體積較理想的烤煙雜交組合?？梢姡捎秒s種優(yōu)勢改良煙草根系性狀是行之有效的。

表6 12個雜交組合根系各性狀的特殊配合力相對效應值Table 6 Relative effect values of SCA of root traits of 12 hybrid combinations

2.3 煙草根系的雜種優(yōu)勢表現(xiàn)

通過對不同雜交組合煙草根系3個性狀的中親優(yōu)勢進行差異性分析，結果如表7所示。12個雜交組合的3個性狀均表現(xiàn)為強優(yōu)勢，正向中親優(yōu)勢組合率分別為91.67%、91.67和100.00%，結果表明煙草根系具有普遍的雜種優(yōu)勢。后續(xù)從12個雜交組合中隨機選擇一個雜交組合（K326×韭菜坪2號），通過分析不同基因在該雜交組合及其親本中的表達情況，進一步探討煙草根系雜種優(yōu)勢的形成原因。

表7 不同雜交組合根系各性狀的雜種優(yōu)勢差異分析（%）Table 7 Heterosis difference analysis of root traits of different hybrid combinations（%）

2.4 煙草根系及其雜種優(yōu)勢相關基因的篩選

2.4.1 煙草根系雜種優(yōu)勢及相關基因的中親表達優(yōu)勢 利用實時熒光定量PCR檢測8個根系發(fā)育相關基因在K326×韭菜坪2號及其親本中的相對表達量（圖1），并計算各基因的中親表達優(yōu)勢（表8），結果顯示NtFLA18、NtAUX1和NtDGL1基因表現(xiàn)為負向優(yōu)勢；NtCRL1、NtPIN3、NtARF16、NtYUC6和NtNAC2基因表現(xiàn)為正向優(yōu)勢。通過分析根系發(fā)育相關基因的中親表達優(yōu)勢與根系各性狀雜種優(yōu)勢的關系，結果（表9）表明不同根系發(fā)育相關基因的中親表達優(yōu)勢與根系性狀雜種優(yōu)勢之間存在一定的相關性，其中，NtAUX1和NtARF16基因的中親表達優(yōu)勢與根系長度雜種優(yōu)勢呈顯著（P＜0.05，下同）或極顯著（P＜0.01，下同）相關，相關系數(shù)為-0.98和1.00，說明NtAUX1和NtARF16基因對根長度雜種優(yōu)勢的形成起關鍵調(diào)控作用；NtFLA18基因的中親表達優(yōu)勢與根系數(shù)量和體積的雜種優(yōu)勢呈顯著或極顯著負相關，相關系數(shù)為-0.98和-1.00，說明NtFLA18基因對根系數(shù)量和體積雜種優(yōu)勢的形成起關鍵調(diào)控作用。

表8 強優(yōu)勢雜交組合的基因中親相對表達量（%）Table 8 Relative expression of genes in strong heterosis hybrid combination（%）

表9 根系發(fā)育相關基因中親表達優(yōu)勢與根系性狀雜種優(yōu)勢的相關系數(shù)Table 9 Correlation coefficient between parental expression heterosis in genes related to root development and heterosis of root traits

圖1 根系發(fā)育相關基因在親本及雜交種中的相對表達量Fig.1 Relative expression of genes related to root development in parents and hybrids

2.4.2 根系雜種優(yōu)勢相關基因在雜交組合中的差異

表達分析 由煙草根系雜種優(yōu)勢形成的關鍵基因在K326×韭菜坪2號及其親本中的表達情況（圖2）可知，NtFLA18基因在K326×韭菜坪2號中的相對表達量較雙親下調(diào)表達，NtAUX1基因表現(xiàn)為顯性表達模式，NtARF16基因的相對表達量較雙親上調(diào)表達，推測NtFLA18基因的下調(diào)表達、NtFLA18基因的顯性表達及NtARF16基因的上調(diào)表達均與煙草根系雜種優(yōu)勢的形成有關。

圖2 根系雜種優(yōu)勢相關基因在雜交組合及其親本中的相對表達量Fig.2 Relative expression of root heterosis related genes in hybrid combinations and their parents

3 討論

根系是植物吸收水分和礦物質(zhì)的重要器官，對植物地上部的發(fā)育有重要影響，根系的生物量（干重、數(shù)量或根長）與株高、最大葉長寬呈正相關，并且與煙葉中的煙堿和鉀含量呈顯著正相關（何禮軍，2006）。目前，對于煙草根系的研究主要集中在連作障礙（于會泳等，2014）、營養(yǎng)調(diào)控（羅勇等，2019；張玉寧，2020）、土傳病害（婁曉平等，2019；張成省，2020）、逆境脅迫（梁棟，2021）及作為砧木提高煙葉鉀含量（Hu et al.，2021）等方面，而有關煙草根系植物學性狀及其遺傳的研究鮮見報道。許杰等（2017b）對烤煙主要根系生理特性的遺傳效應進行分析，結果發(fā)現(xiàn)F1根系陽離子交換量、根系活力和ATP酶活性的雜種優(yōu)勢較強。本研究對煙草根系的植物學性狀進行遺傳分析，結果表明煙草根系長度、數(shù)量和體積均具有普遍的雜種優(yōu)勢，與許杰等（2017b）對根系體積的研究結果一致。

王秀全等（2002）研究表明玉米根體積、鮮干重、數(shù)量和總長的遺傳均以加性效應為主。本研究發(fā)現(xiàn)根系長度主要受基因的加性效應控制，根系數(shù)量和根系體積主要受基因的非加性效應控制?？梢姡甸L度的研究結果與王秀全等（2002）的研究結果一致，但根系數(shù)量和體積的研究結果與該文獻不一致，可能是由于試驗材料的不同而導致。南文華等（2011）研究表明，根長、根鮮質(zhì)量、根體積、活根數(shù)和根干質(zhì)量的變異系數(shù)分別為14.43%～36.00%。本研究發(fā)現(xiàn)煙草根系長度、數(shù)量和體積的變異系數(shù)為19.97～29.68%，與南文華等（2011）的研究結果相近。趙麗萍等（2014）對甘蔗根系性狀的遺傳效應進行研究，結果發(fā)現(xiàn)根長、根表面積、根尖數(shù)、根干重和根體積的遺傳力均大于60%，并指出根長、根表面積和根直徑可作為甘蔗根系育種的選擇指標。本研究結果表明根系長度、數(shù)量和體積的廣義遺傳率為85.76～95.49%，基因效應在遺傳中起重要作用，與趙麗萍等（2014）的研究結果基本一致，在今后的育種工作中可利用雜種優(yōu)勢選育出根系發(fā)達的雜交種。

雜種優(yōu)勢的應用促進了煙草育種的發(fā)展，但其機理尚不清楚。繼基因組組成差異及基因效應研究之后，基因表達差異成為探尋雜種優(yōu)勢分子機理新的切入點（許晨璐等，2013；滕建輝等，2021）。滕建輝等（2021）研究表明FPF1和PHYC基因的下調(diào)表達有利于調(diào)控煙草葉片數(shù)雜種優(yōu)勢的形成。羅雯等（2022）研究表明AKT1、NtKC1、KAT1、NKT1和NtHAK基因的上調(diào)表達與雜交組合煙葉鉀含量優(yōu)勢有關。本研究發(fā)現(xiàn)，基因差異表達與根系雜種優(yōu)勢表現(xiàn)呈顯著相關性，其中，NtAUX1和NtARF16基因表達與根系長度雜種優(yōu)勢呈顯著或極顯著相關性，NtAUX1基因在K326×韭菜坪2 號中呈顯性表達模式，NtARF16基因呈上調(diào)表達模式。NtFLA18基因表達量與根系數(shù)量和體積雜種優(yōu)勢呈顯著或極顯著相關，在K326×韭菜坪2號中呈下調(diào)表達模式，但NtFLA18、NtARF16和NtAUX1基因如何調(diào)控根系雜種優(yōu)勢還需進一步探討。隨著高通量生物學技術的不斷發(fā)展，今后可采用轉錄組、蛋白質(zhì)組等技術挖掘與煙草根系雜種優(yōu)勢形成的相關基因，分析其表達模式，進一步探討根系雜種優(yōu)勢形成的分子機理。

4 結論

煙草根系長度、數(shù)量和體積均具有較強的遺傳率和普遍的雜種優(yōu)勢，可利用雜種優(yōu)勢選育出根系發(fā)達的煙草新種質(zhì)。GDH88、Va116、南江三號和G70可作為改良根系的優(yōu)良親本；K326×GDH88、Va116×畢納1號、G70×韭菜坪2號、G70×南江三號和K326×韭菜坪2號可作為培育優(yōu)良根系構型的重要儲備材料。