何 健, 石建州, 劉陽(yáng)坤, 李 娜, 黃 克, 陳宇婧, 王國(guó)川, 姚倫廣

(南陽(yáng)師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473061)

非洲豬瘟是由家豬和野豬感染非洲豬瘟病毒引起的一種急性、廣泛出血性、高度接觸性、烈性傳染病，高發(fā)病率，最急性和急性型感染死亡率可高達(dá)100%.ASF是家豬的一種毀滅性傳染病，發(fā)病特征主要有高燒、皮膚發(fā)紺、淋巴嚴(yán)重出血.ASFV結(jié)構(gòu)和免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜，能夠逃避宿主免疫細(xì)胞的清除，但其與宿主細(xì)胞的互作機(jī)制尚不清晰.ASFV基因多樣性和抗原多樣性是制約ASF疫苗和藥物研發(fā)的關(guān)鍵所在，同時(shí)疫苗和藥物的穩(wěn)定性及有效性也是需要解決的難點(diǎn).1995年ASFV全基因組測(cè)序完成[1]，為研究ASF的發(fā)病機(jī)制提供了理論依據(jù).2019年10月18日，饒子和等成功分離出國(guó)內(nèi)ASFV流行株，并首次在原子水平上解析了該病毒顆粒的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)，揭示了ASFV多個(gè)潛在的保護(hù)性抗原和關(guān)鍵抗原表位信息，分析了ASFV可能的組裝機(jī)制，為研發(fā)安全有效的新型ASF疫苗奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[2].2021年2月我國(guó)出現(xiàn)了低致死率的ASF基因Ⅱ型自然變異流行株，與首例毒株P(guān)ig/HLJ/2018相比，其基因組序列發(fā)生了不同程度的改變(核苷酸缺失、突變、插入或短片段替換等)，推測(cè)與目前呈現(xiàn)的亞急性型流行的ASF有關(guān)[3].ASFV變異株毒力較溫和，但殘存毒力傳染性很強(qiáng)，臨床表現(xiàn)不明顯，隱蔽性超強(qiáng)，早期診斷難度加大，以致疫情變得更加復(fù)雜難控，給ASF防控帶來(lái)新的挑戰(zhàn).目前，由于缺乏ASFV疫苗和治療藥物，現(xiàn)行的防控手段主要是實(shí)施隔離封鎖、撲殺、消毒以及無(wú)害化處理等.因此，早期診斷和快速檢測(cè)，在ASF的防控體系構(gòu)建中是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)方法尤為重要.

1 非洲豬瘟病毒病原學(xué)特征

1.1 形態(tài)結(jié)構(gòu)

冷凍電鏡解析ASFV為直徑260～300 nm的球狀顆粒，ASFV編碼的68種蛋白[4]組裝成了五層結(jié)構(gòu)，內(nèi)核芯殼(Core shell)、內(nèi)膜(Inner envelope)、核衣殼(Capsid)、外囊膜(External envelope)從內(nèi)到外依次將病毒基因組(Nucleoid)層層包裹，呈復(fù)雜的二十面體對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)，這些蛋白參與ASFV基因組的復(fù)制、DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、組裝以及免疫逃逸等生物過(guò)程[5].

1.2 基因組

ASFV基因組是線性雙鏈DNA(Double-stranded DNA，dsDNA)，屬于核質(zhì)大DNA病毒(Nucleo-Cytoplasmic Large DNA Viruse，NCLDV)，大小為170 kbp～194 kbp，包含150～167個(gè)開(kāi)放閱讀框 (Open reading frames，ORFs)，編碼蛋白150～200種，包括結(jié)構(gòu)蛋白至少54種和非結(jié)構(gòu)蛋白100余種[6].ASFV隸屬于DNA病毒目、非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)、非洲豬瘟病毒屬(Asfivirus)唯一的成員，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制，靶細(xì)胞主要是宿主的單核-巨噬細(xì)胞[7].

ASFV基因組可以劃分為3個(gè)組成部分：位于中間位置的穩(wěn)定區(qū)(Stable region)，長(zhǎng)度125 kbp～130 kbp；可變區(qū)(Variable region)位于穩(wěn)定區(qū)的兩側(cè)，與末端相鄰，長(zhǎng)度20 kbp～40 kbp，包括串聯(lián)重復(fù)序列和多基因家族(Multigene families，MGF)，ASFV基因組大小差異主要在于可變區(qū)基因拷貝數(shù)的不同；位于基因組末端的堿基互補(bǔ)配對(duì)的發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu) (Hairpin loop) ，長(zhǎng)度37 nt[8].

目前，依據(jù)ASFV衣殼蛋白p72(B646L)基因可變區(qū)3′-末端的核苷酸序列(約500 bp)遺傳進(jìn)化分析的差異，全球范圍內(nèi)已鑒定出至少24種基因型[9].歐洲主要是基因Ⅰ和Ⅱ型，亞洲主要是基因Ⅱ型，東非和南非流行20余種基因型[6].

1.3 理化性質(zhì)

ASFV能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定存活于環(huán)境中，適應(yīng)寬范圍的酸堿度、溫度以及不同的介質(zhì).ASFV的毒力在pH=4～11下無(wú)顯著變化[10].耐受低溫，高溫失活，豬肉在冷凍條件下，ASFV可存活數(shù)年；4 ℃至少存活1年；25 ℃～37 ℃能夠存活數(shù)周；56 ℃持續(xù)加熱，存活70 min；60 ℃持續(xù)加熱，存活20 min.釋放到細(xì)胞外的ASFV顆粒以出芽的方式獲得的非必需脂質(zhì)囊膜[6].ASFV在血液、肉制品、鮮肉、排泄物等介質(zhì)中的存活時(shí)間不同，比如：在糞便和尸體中的ASFV分別能存活11 d和1年；血液中的ASFV，4 ℃能夠存活540 d；香腸、咸肉等制品中的ASFV，能夠存活數(shù)月[11].

1.4 非洲豬瘟病毒的臨床表現(xiàn)

基于感染不同毒力的ASFV毒株，臨床癥狀表現(xiàn)有最急性、急性、亞急性和慢性四種類(lèi)型.最急性和急性是由強(qiáng)毒株感染而引發(fā)，最急性無(wú)明顯臨床癥狀突然死亡，急性病程4～10 d，以高熱、出血癥、病死率高達(dá)100%為典型特征，體溫40.5 ℃～42 ℃，精神沉郁，呼吸困難，運(yùn)動(dòng)失調(diào)；腹部、四肢和耳呈現(xiàn)出血點(diǎn)；可視黏膜潮紅發(fā)紺；眼、鼻流分泌物；便秘或腹瀉，帶血.亞急性由中等毒力毒株感染引發(fā)，臨床表現(xiàn)與急性相似，但癥狀較輕，病程5～30 d.慢性由低毒力毒株感染而引發(fā)，病程2～15個(gè)月，波狀熱，呼吸困難，關(guān)節(jié)腫脹，皮膚潰瘍，生長(zhǎng)緩慢，死亡率較低[12].

近期，發(fā)現(xiàn)了ASF基因Ⅱ型自然變異流行株，包括基因缺失株、自然變異株、自然弱毒株等，與傳統(tǒng)的流行毒株相比，該類(lèi)毒株的基因組序列、致病力等變化明顯.生豬感染ASFV變異株的主要臨床癥狀表現(xiàn)為：大量慢性或隱性感染豬，潛伏期延長(zhǎng)，臨床表現(xiàn)輕微，死亡率下降，引發(fā)關(guān)節(jié)腫脹及壞死、皮膚腫塊或出血型壞死灶，發(fā)熱、嗜睡、癱瘓、咳喘、腹式呼吸，感染母豬產(chǎn)仔性能下降、育肥豬死率增高，流產(chǎn)死胎/木乃伊胎等亞臨床癥狀.與2018年傳入的ASF毒株相比，生豬感染該類(lèi)毒株后排毒滴度低、間隙性排毒，難以早期發(fā)現(xiàn)[13].

1.5 非洲豬瘟病毒的病理變化

典型的病理變化是感染豬各組織器官?gòu)V泛性出血.心內(nèi)膜、心外膜、腎臟、肺臟、膽囊、膀胱、胃腸道黏膜呈現(xiàn)出血點(diǎn)；漿膜、淋巴結(jié)出血；肺水腫，切面有泡沫樣流體；氣管里出現(xiàn)血性泡沫樣黏液；脾臟充血腫大，易碎，顏色加深[12].

1.6 非洲豬瘟病毒感染與免疫機(jī)制

ASFV復(fù)制周期包括病毒吸附、內(nèi)化、增殖、組裝和釋放.感染周期始于病毒附著與進(jìn)入宿主細(xì)胞，病毒感染的主要靶細(xì)胞是單核細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞，主要利用網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用或巨胞飲作用完成入侵巨噬細(xì)胞，ASFV包裹于內(nèi)吞體或巨胞飲泡中，將完成從早期到晚期內(nèi)體的成熟，并解離囊膜；內(nèi)層囊膜和次級(jí)內(nèi)體融合，核心經(jīng)脫衣殼[14]釋放到細(xì)胞質(zhì).病毒基因組的復(fù)制主要在胞漿內(nèi)[11]，但有一個(gè)短暫的入核過(guò)程，推測(cè)有助于復(fù)制的起始[6].一個(gè)缺口(Nick)在發(fā)夾環(huán)近端將閉合線性DNA雙鏈打開(kāi)成為單鏈，以此為模板，合成互補(bǔ)鏈，生成2個(gè)發(fā)夾環(huán)；再以新生成的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)為引物合成子代鏈[15].“病毒加工廠”裝配新合成的蛋白和基因組成為病毒粒子[16]；動(dòng)力蛋白將病毒粒子轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜，以出芽方式獲取囊膜，釋放至細(xì)胞外[6].ASFV表達(dá)的連接酶、DNA聚合酶、核酸內(nèi)切酶、核苷酸代謝酶以及RNA聚合酶等保證復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確性.

ASFV生物學(xué)特性復(fù)雜，對(duì)其感染機(jī)制與免疫機(jī)制認(rèn)知有限.深入了解和認(rèn)識(shí)ASFV與宿主的互作關(guān)系是理解感染和免疫機(jī)制的理論基礎(chǔ)和ASF預(yù)防控制的前提.髓樣的單核吞噬免疫細(xì)胞(單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞以及自然殺傷NK細(xì)胞等)是ASFV侵染的主要對(duì)象，嚴(yán)重影響了機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)[17].針對(duì)入侵機(jī)體的病毒，宿主通過(guò)先天性和獲得性免疫應(yīng)答機(jī)制發(fā)揮識(shí)別和消滅清除的功能.病毒也進(jìn)化出的多種策略以逃避宿主的免疫，ASFV的免疫逃逸策略包括兩個(gè)方面[5]：逃逸天然免疫應(yīng)答(細(xì)胞嗜性、干擾素、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、自噬、調(diào)控宿主蛋白合成)，逃逸適應(yīng)性免疫應(yīng)答(抗原遞呈、體液免疫、細(xì)胞免疫).ASFV編碼多種和宿主細(xì)胞互作的免疫逃逸相關(guān)的蛋白，主要包括：調(diào)控宿主蛋白表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)錄因子激活的A238L和DP71L等蛋白；抑制Ⅰ型干擾素IFN介導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)的信號(hào)通路的I329L、MGF360和MGF505/530等蛋白；干預(yù)細(xì)胞程序性死亡，調(diào)控細(xì)胞凋亡、自噬的p54、A224L、DP71L、EP153R和A179L等蛋白；其他免疫抑制蛋白，比如L83L蛋白抑制IL-1β的抗病毒效應(yīng)，與細(xì)胞AP-1相互作用并參與病毒細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的CD2v抑制淋巴細(xì)胞增殖等[18-19].這些蛋白通過(guò)抑制宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)、調(diào)控細(xì)胞生理活動(dòng)以及干擾免疫系統(tǒng)等途徑，以抑制與逃避免疫應(yīng)答反應(yīng)，為ASFV增殖、擴(kuò)散爭(zhēng)取有利條件[20].

ASFV同時(shí)感染巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞等重要的抗原遞呈細(xì)胞，傷害細(xì)胞的抗原遞呈功能，從而逃避后續(xù)的免疫應(yīng)答.巨噬細(xì)胞引發(fā)病毒DNA損傷與突變，具有抵御病毒感染功效.樹(shù)突細(xì)胞是最重要的抗原遞呈細(xì)胞，病毒感染使樹(shù)突細(xì)胞功能損傷與數(shù)量減少，因此影響免疫反應(yīng)[21].ASFV的保護(hù)性免疫復(fù)雜，體液免疫和細(xì)胞免疫在抗ASFV感染中均有參與[22].抗體是體液免疫的重要效應(yīng)分子，能夠延遲發(fā)病、減緩病毒血癥，提供部分保護(hù)，尤其是中和活性抗體在抗病毒過(guò)程中發(fā)揮了重要作用.ASFV激發(fā)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTLs)應(yīng)答，誘導(dǎo)細(xì)胞免疫抵御病毒攻擊.一方面，ASFV通過(guò)對(duì)干擾素產(chǎn)生、細(xì)胞凋亡和自噬、信號(hào)通路、靶細(xì)胞的正常生命活動(dòng)及生理功能等機(jī)制嚴(yán)格調(diào)控宿主的免疫應(yīng)答，從而逃逸天然免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和防御[20, 23];另一方面，ASFV對(duì)宿主免疫系統(tǒng)、宿主細(xì)胞的損傷也影響了宿主難以獲得有效的適應(yīng)性免疫應(yīng)答[5].

2 非洲豬瘟流行病學(xué)

ASFV是感染豬發(fā)生ASF的生物病原體，是目前已知的唯一一種由蟲(chóng)媒(鈍緣蜱、蠅等)傳播的DNA病毒[24]，易感動(dòng)物通過(guò)直接接觸和間接接觸到傳染源而被感染.豬科動(dòng)物是ASFV唯一易感的脊椎動(dòng)物.不同性別、所有品種和年齡段的豬科動(dòng)物均易感染ASFV.歐洲野豬和家豬高度易感，感染ASFV臨床癥狀明顯，臨床表現(xiàn)和死亡率相似；而感染ASFV的儲(chǔ)存宿主——非洲野豬(疣豬、叢林豬、巨林豬和紅河豬)無(wú)明顯臨床癥狀.野豬、家豬和鈍緣蜱屬軟蜱是ASFV的天然宿主[12].

ASF首次暴發(fā)是在1921年的非洲肯尼亞，隨即在非洲大部分地區(qū)傳播流行.逐步流行于歐洲、南美、俄羅斯高加索地區(qū)，快速在世界各地暴發(fā).1957年，ASF自葡萄牙開(kāi)始蔓延至歐洲其他區(qū)域.2007年，格魯尼亞發(fā)生ASF，馬上傳入俄羅斯.2018年8月3日，ASF疫情從俄羅斯、烏克蘭蔓延侵入我國(guó)，首例ASF暴發(fā)于遼寧省沈陽(yáng)市某豬場(chǎng)[25]，也是亞洲通報(bào)的首例ASF.ASFV在我國(guó)傳播流行迅速，相繼席卷了我國(guó)各地，截至2021年6月30日共報(bào)道了近200起疫情[26]，生豬養(yǎng)殖業(yè)損失巨大，流行態(tài)勢(shì)迅猛，防控形勢(shì)嚴(yán)峻.

目前已證實(shí)ASFV的傳播途徑主要有以下四種[27]，在各個(gè)循環(huán)內(nèi)能夠持續(xù)存在.①家豬—家豬傳播循環(huán)：感染豬的血液、分泌物、排泄物等體液以及各組織均含有ASFV，傳播途徑經(jīng)口鼻、傷口直接接觸ASFV，氣溶膠短距離傳播ASFV.ASFV在環(huán)境中具有一定的抵抗力，能夠穩(wěn)定存活，因此，感染豬接觸過(guò)的水、飼料、器具等以及叮咬感染豬的鈍緣蜱、蚊蠅等，在病毒傳播過(guò)程中的作用不可忽視.耐受豬通常會(huì)持續(xù)排毒一段時(shí)間，從而造成病毒的不斷擴(kuò)散.②野豬—鈍緣蜱—野豬傳播循環(huán)：即野生生物間的傳播.鈍緣蜱軟屬是ASFV重要的傳播媒介和自然宿主，鈍緣蜱在疣豬間傳播ASFV發(fā)揮了重要的作用.非洲野豬可以持續(xù)感染ASFV，無(wú)癥狀和無(wú)病毒血癥；而歐亞野豬被病毒感染后表現(xiàn)出和家豬相似的臨床癥狀，患病動(dòng)物就是傳播源.③野豬—鈍緣蜱—家豬：寄生于疣豬的軟蜱吸食血液為生，ASFV傳播能力有限，因此，軟蜱、疣豬和非洲野豬傳染病毒給家豬的機(jī)會(huì)不大，而歐亞大陸的家豬易被感染.放養(yǎng)的家豬容易被戶(hù)外的野生生物傳染到ASFV.④人類(lèi)活動(dòng)的傳播：便利的交通為ASFV快速遠(yuǎn)距離傳播提供了條件.肉及肉制品中的ASFV能夠存活數(shù)周；未滅活處理的尸體、尿、糞和唾液等排泄物及分泌物可以是傳染源；被污染的工具、服裝等均可能感染家豬.

我國(guó)近期ASF流行的新特點(diǎn)主要表現(xiàn)：ASFV已經(jīng)定殖且已形成較大污染面；變異毒株和經(jīng)典毒株共存共流行，防控形勢(shì)更加復(fù)雜；變異毒株帶來(lái)了新挑戰(zhàn)，家豬感染早期無(wú)明顯的臨床癥狀，非典型與亞急性的病例增多，傳播力強(qiáng)，潛伏期長(zhǎng)，更隱蔽，易與其他豬病混淆，診斷難度更大，精準(zhǔn)清除不易；qPCR檢測(cè)變異株漏檢率高，監(jiān)測(cè)和精準(zhǔn)清除更加困難，疫情不易及時(shí)被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致疫情延誤，錯(cuò)失最佳防治時(shí)機(jī)，易造成更大的損失.

3 蛋白與功能

ASFV基因組編碼蛋白數(shù)量眾多，54種結(jié)構(gòu)蛋白以及100多種非結(jié)構(gòu)蛋白，這些蛋白在ASFV基因組的復(fù)制、DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、病毒組裝和免疫逃逸及ASFV感染的吸附、入侵、復(fù)制、包裝和出芽等過(guò)程中發(fā)揮著重要的功能[5, 28].結(jié)構(gòu)蛋白主要有CD2v、p72、p54、p30、p49、p17、p10、p12、p14.5、p22、pE248R、pM1249L、pH250R、j5R、 pp220和pp62等，是組裝形成病毒顆粒的主要組分[29]，其中CD2v、p30、p54和p12編碼重要的毒力基因.非結(jié)構(gòu)蛋白主要有MGF360、MGF530/505、9GL、DP71L、A238L、pA104R、pE296R、Ep152R、pA224L、L38L、DP9GR、pNP419L、A179L、p1215L、pEP868R和pE165R等，是參與病毒感染與免疫的關(guān)鍵因素.ASFV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染周期的每個(gè)環(huán)節(jié)行使各自的功能，參與調(diào)控宿主細(xì)胞周期、蛋白表達(dá)、干擾宿主免疫系統(tǒng)以及病毒的免疫逃逸，有助于ASFV的擴(kuò)繁和持續(xù)性感染[18, 30].深入了解蛋白功能是探究ASFV致病機(jī)制的前提和基礎(chǔ)，有助于改善防控策略，然而，目前仍有眾多的蛋白功能及作用機(jī)制尚需解析.

3.1 結(jié)構(gòu)蛋白的功能

ASFV主要結(jié)構(gòu)蛋白從外至內(nèi)組成依次包括外囊膜蛋白、衣殼蛋白、內(nèi)囊膜蛋白和內(nèi)核芯殼蛋白.外囊膜蛋白由編碼蛋白CD2v(pEp402R)、p24(KP177R)和p12(O61R)等構(gòu)成.重要的抗原蛋白CD2v，類(lèi)CD2蛋白，介導(dǎo)吸附紅細(xì)胞、干擾宿主免疫防御[18]；黏附蛋白p12參與吸附、入侵.衣殼結(jié)構(gòu)由主要包括一個(gè)主蛋白p72(pB646L)，四個(gè)次衣殼蛋白M1249L(pM1249L)、p17(pD117L)、p49(pB438L)和pH240R(H240R)，其中關(guān)鍵衣殼蛋白p72[31]決定了可能的構(gòu)象表位.p72免疫原性較強(qiáng)，參與病毒侵入[32].p49是病毒顆粒感染必需的結(jié)構(gòu)蛋白；DNA結(jié)合蛋白p14.5(E120R)、pH240R參與病毒顆粒的組裝；M1249L作為骨架，連接核衣殼的多個(gè)蛋白[33].內(nèi)囊膜蛋白包括p30(CP204L)、p54(pE183L)、pE248R、p17及其他內(nèi)囊膜蛋白.內(nèi)膜主要蛋白p30作為重要的抗原蛋白，參與病毒復(fù)制，干擾宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯[34]；跨膜蛋白p54囊膜形成的關(guān)鍵蛋白，參與病毒入侵[35]，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡；與感染力相關(guān)的p17促進(jìn)囊膜前體物質(zhì)形成正二十面體.內(nèi)核芯殼蛋白不僅包括親核結(jié)構(gòu)蛋白p10(pK78R)，還主要有pp220(pCP2475L)和pp62(pCP530R)多聚蛋白前體，核衣殼包裹必需蛋白，在蛋白酶pS273R作用下，水解產(chǎn)物為p150、p37、p34、p14、p5、p35、p15和p8，影響蛋白核心包裝與成熟[28].ASFV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白p72、p54、p30和CD2v等的免疫原性良好.目前常用的血清學(xué)診斷靶點(diǎn)是基于p72、p54和p30部分氨基酸序列的保守性，用以檢測(cè)抗體水平[36].表達(dá)蛋白p72、p54免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體不能完全保護(hù)致死劑量的病毒感染.重組ASFV血凝素HA或CD2v蛋白誘導(dǎo)了部分保護(hù)作用；p54-p30融合到CD2v蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的DNA或通過(guò)表達(dá)文庫(kù)免疫，蛋白的DNA疫苗接種僅獲得30%～50%的免疫保護(hù)效果[28].

3.2 非結(jié)構(gòu)蛋白的功能

近年來(lái)，隨著人們對(duì)ASFV編碼的100多種非結(jié)構(gòu)蛋白研究的深入，對(duì)其在調(diào)控宿主細(xì)胞的正常生長(zhǎng)以及逃避宿主細(xì)胞免疫系統(tǒng)等方面的認(rèn)識(shí)更加清晰，但是仍有巨大的未知領(lǐng)域有待探究.ASFV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白主要包括完整的酶、病毒免疫逃逸、病毒轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞功能以及病毒毒力相關(guān)蛋白，如pA238L、pA528R等蛋白與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)以及修飾等過(guò)程，完成與宿主細(xì)胞的互作，非結(jié)構(gòu)蛋白是ASFV的重要組成部分[29-30]，是完成病毒感染的關(guān)鍵因素.

IFNs和NF-κB是抗病毒免疫應(yīng)答的重要組成部分，ASFV非結(jié)構(gòu)蛋白pA238L(A238L)阻斷促炎細(xì)胞因子NFAT和NF-κB的活化，pA528R(MGF505)抑制干擾素的產(chǎn)生和JAK-STAT信號(hào)通路的激活[30]，抑制宿主炎癥反應(yīng)和白細(xì)胞趨化，參與免疫逃避[33].MGF360和MGF505/530影響ASFV對(duì)Ⅰ型干擾素的敏感性[37].pA276R(MGF360)抑制IRF3磷酸化，抑制IFN-β的誘導(dǎo)[22].多基因家族基因MGF-110、MGF360/530、I177L、DP148R、UK、DP71L、B119L等是病毒毒力基因，作為構(gòu)建基因缺失疫苗的研究熱點(diǎn).敲除MGF-110-9L基因的ASFV對(duì)豬致病性降低[38]，ASFV蛋白MGF-505-7R負(fù)調(diào)控天然免疫cGAS-STING信號(hào)通路[39].核酸水解酶pE165R(E165R)dUTP焦磷酸酶(dUTPase)，催化水解細(xì)胞質(zhì)中的脫氧尿苷三磷酸(dUTP)[40].pE296R(E296R)修復(fù)核酸錯(cuò)配，幫助ASFV在巨噬細(xì)胞內(nèi)部的強(qiáng)氧化環(huán)境生存[41].

4 非洲豬瘟的防控

ASF對(duì)家豬構(gòu)成了特別嚴(yán)重的危害，已造成重大經(jīng)濟(jì)損失.目前，在缺乏有效疫苗和適當(dāng)治療的情況下，只能選擇撲殺、隔離等措施以及對(duì)豬肉產(chǎn)品的貿(mào)易禁令，以此來(lái)遏制疾病暴發(fā).ASF引起了重大生物安全問(wèn)題，在出現(xiàn)可以推向商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的“非瘟疫苗”前，ASFV的準(zhǔn)確檢測(cè)與早期診斷是監(jiān)測(cè)和控制疫情的關(guān)鍵所在，完善防疫技術(shù)體系、快速準(zhǔn)確的診斷和高效的消毒對(duì)于ASF的防控至關(guān)重要.

ASF防控策略主要包括：消滅傳染源；構(gòu)建全行業(yè)、多維度的綜合技術(shù)體系；堅(jiān)持不懈構(gòu)建與完善豬場(chǎng)生物安全體系；創(chuàng)造條件，穩(wěn)步復(fù)產(chǎn)和擴(kuò)大規(guī)模；嚴(yán)格處置ASF疫情；新建豬場(chǎng)遵循ASF防控的生物安全要求；推動(dòng)ASF生物安全防控小區(qū)建設(shè)；認(rèn)真落實(shí)ASF的防控各項(xiàng)措施，全力防控ASF[42].生物安全體系的建立不僅是養(yǎng)殖場(chǎng)疾病防控的前提，也是最經(jīng)濟(jì)有效的疫病防治措施[43].

4.1 檢測(cè)技術(shù)

根除ASF的黃金期在疫情傳入的早期，而感染ASFV的豬，潛伏期傳染性最強(qiáng)，發(fā)病前48 h開(kāi)始排毒[6]，因而當(dāng)確定疫情時(shí)，疫區(qū)可能已大面污染，應(yīng)嚴(yán)格監(jiān)控受威脅區(qū)域和管制交通，以防疫情蔓延.為了有效防止病毒擴(kuò)散，及時(shí)準(zhǔn)確地檢測(cè)ASFV尤為重要.

目前，有多種檢測(cè)ASFV的方法，依據(jù)檢測(cè)技術(shù)的原理可分為三類(lèi)：病毒分離法、免疫學(xué)方法與分子學(xué)方法.免疫學(xué)方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫印跡試驗(yàn)、免疫熒光試驗(yàn)、免疫層析試紙等.分子學(xué)方法包括PCR、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、CRISPR/Cas系統(tǒng)等.

目前免疫學(xué)方法不僅要開(kāi)展抗原檢測(cè)，還需要抗體檢測(cè).在經(jīng)典毒株與變異株共同流行的背景下，開(kāi)展抗原抗體雙檢測(cè)是必要的，因?yàn)楫?dāng)前變異株潛伏期長(zhǎng)，臨床癥狀不典型，抗原檢測(cè)是陰性，并不能確定是否感染，需要再進(jìn)行抗體檢測(cè)，確保“抗原”“抗體”雙陰性，其準(zhǔn)確性和安全性才有保證.在ASFV污染面廣的情況下，臨床需要ASFV抗體檢測(cè)是必要的，也是凈化ASFV的必由之路.目前血清學(xué)診斷靶點(diǎn)通常選擇蛋白免疫原性較高、部分序列相對(duì)保守的基因，如p72(B646L)、 p54(E183L)和p30(CP204L)等[44].

4.2 疫苗研究進(jìn)展

ASFV基因組龐大、免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜以及毒株的多樣性，使疫苗的研發(fā)遇到了巨大的挑戰(zhàn).近年來(lái)雖然減毒活疫苗的研制取得了顯著進(jìn)展[45]，但目前仍無(wú)商業(yè)化疫苗可用，面對(duì)日趨嚴(yán)峻的ASF疫情，安全有效的疫苗是防控ASF的亟須工具.楊漢春指出：目前還沒(méi)有一種可以推向商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的“非瘟疫苗”，所面臨的困難和難題主要包括4個(gè)方面：①ASFV復(fù)雜性：病毒蛋白眾多，免疫原性成分與致病/毒力基因不清楚；②安全性：減毒活疫苗的不安全性；③效力：滅活疫苗無(wú)效、蛋白疫苗無(wú)效或部分有效；④產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)：無(wú)合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，即使疫苗安全有效，也難于控制產(chǎn)品的產(chǎn)量與質(zhì)量[46].

疫苗的成功取決于其有效性和安全性，而安全有效的疫苗能否商品化取決于能否規(guī)?；a(chǎn)，即量產(chǎn).合適的量產(chǎn)細(xì)胞系選擇尤為重要，通常原代豬巨噬細(xì)胞被用于實(shí)驗(yàn)室研發(fā)ASF疫苗，但難以實(shí)現(xiàn)量產(chǎn).近期報(bào)道HLJ/18-7GD株候選疫苗在豬骨髓細(xì)胞(porcine bone marrow cells，PBMS)中生長(zhǎng)很好，保持良好的免疫原性；而ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR是一種針對(duì)當(dāng)前大流行的ASF病毒株的適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的疫苗病毒，是第一個(gè)經(jīng)過(guò)合理設(shè)計(jì)的候選疫苗，以解決量產(chǎn)問(wèn)題，可用于大規(guī)模商業(yè)疫苗生產(chǎn)[47].

早期研制的人工傳代致弱、自然致弱毒株疫苗，以及減毒活疫苗，在臨床使用上存在有毒力殘留或毒力返祖的安全隱患，雖然對(duì)同源毒株有保護(hù)作用，但是對(duì)異源毒株無(wú)交叉保護(hù)，目前ASFV疫苗創(chuàng)制解決的主要問(wèn)題和主要研究?jī)?nèi)容：開(kāi)展ASFV基因缺失疫苗、亞單位疫苗、多表位疫苗、活載體疫苗等新型候選疫苗研究，評(píng)價(jià)候選疫苗的安全性和有效性，創(chuàng)制安全、有效的ASFV疫苗，研發(fā)疫苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)[48].

4.3 抗病毒藥物研究進(jìn)展

目前，抗病毒藥物和疫苗是對(duì)抗病毒感染最有力的工具，研制抗ASFV的藥物是防控ASF的另一種思路，安全有效的抗ASFV藥物可在疫情暴發(fā)時(shí)立即為疫區(qū)提供保護(hù)，并能夠爭(zhēng)取充足的時(shí)間制定防治對(duì)策.基于抗ASFV藥物作用對(duì)象的不同，潛在的ASFV抗病毒藥物主要有三類(lèi)：①直接作用于ASFV，破壞病毒的正常功能，阻礙生長(zhǎng)增殖；②宿主細(xì)胞的靶向藥物，抑制宿主細(xì)胞的正常生長(zhǎng)；③通過(guò)未知通路發(fā)揮抗病毒作用的藥物[49].基于抗ASFV藥物的抑制機(jī)制的不同，將其分為兩類(lèi)：①通過(guò)ASFV復(fù)制周期中某環(huán)節(jié)直接作用于病毒的藥物；②針對(duì)參與病毒復(fù)制的宿主細(xì)胞因子的藥物.理論上，病毒復(fù)制所需的特異性酶，是研發(fā)抗ASFV藥物的良好特異性靶標(biāo)，任何影響ASFV復(fù)制過(guò)程的物質(zhì)都有可能成為抗病毒藥物[50].設(shè)計(jì)ASFV的抗原蛋白、毒力蛋白等結(jié)構(gòu)蛋白，以及酶、參與ASFV復(fù)制的細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子等非結(jié)構(gòu)蛋白的小分子化學(xué)藥物，比如，根據(jù)pS273R蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)抑制劑，小分子抑制劑胞外影響pS273R酶活性[51].能夠直接或間接作用于病毒的感染宿主細(xì)胞的吸附、入侵、復(fù)制、包裝和出芽過(guò)程中某環(huán)節(jié)，可不同程度地實(shí)現(xiàn)抑制或減弱病毒毒力的感染.已研究的抗ASFV藥物，均未進(jìn)行豬體內(nèi)療效評(píng)價(jià)[52].

4.4 消毒劑研究進(jìn)展

ASF是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的烈性傳染病，對(duì)經(jīng)濟(jì)有著重大影響，至今尚無(wú)有效的疫苗和抗病毒藥物，因而消滅傳播源，切斷傳播途徑在控制疾病傳播中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，目前，防治ASF疫情主要依靠檢測(cè)和撲殺.衛(wèi)生消毒通過(guò)滅活環(huán)境中的ASFV，切斷流行途徑，能夠有效控制病毒的傳播，是生物安全防控ASF的必要環(huán)節(jié).深入研究消毒劑的制備使用方法和作用機(jī)理，掌握合理高效的消毒方法，是建立生物安全體系的重中之重.快速有效的病毒滅活是進(jìn)行ASFV安全診斷檢測(cè)研究和疫苗開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵步驟.

目前，ASFV消毒的技術(shù)主要有化學(xué)試劑消毒法(酚、醛、乙醚、鹵素、醇、氧化物及過(guò)氧化物、氯仿、堿、酸、季銨鹽、碘類(lèi)、苯酚)、物理消毒法(紫外線、高溫、高壓、γ射線)、生物消毒法、環(huán)境生態(tài)修復(fù)法以及其他的消毒技術(shù)(濾膜過(guò)濾、離子交換層析等)[53].由于ASFV的感染性不易確定，消毒的機(jī)理不同(病毒囊膜、蛋白質(zhì)、核酸)、使用方法不同(噴霧、浸泡、擦拭、熏蒸)、適用場(chǎng)合不同(環(huán)境、用具、體表、飲水)、濃度配比、作用時(shí)間、副作用或污染強(qiáng)弱、評(píng)價(jià)滅活A(yù)SFV效果的方法(分子生物技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)法)不同[54]，所以各種消毒技術(shù)的消殺能力無(wú)法準(zhǔn)確比較，各種消毒技術(shù)方法在其實(shí)用性和應(yīng)用效果上各有優(yōu)劣，在ASFV的防控方面亟須研制出較為理想的消毒劑.

5 展望

ASF是一種古老的、高度傳染性的、對(duì)家豬和野豬致命的疾病，雖然流行了百年，但對(duì)ASFV的病原學(xué)與流行病學(xué)、蛋白結(jié)構(gòu)與功能、病毒與宿主互作關(guān)系、病原致病與機(jī)體免疫機(jī)制等關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題了解有限.從現(xiàn)狀需求來(lái)看，優(yōu)化嚴(yán)格的防控措施和加快疫苗研發(fā)是當(dāng)務(wù)之急；從長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展考慮，深入研究病毒感染與免疫機(jī)制，為檢測(cè)技術(shù)、疫苗創(chuàng)制、藥物研發(fā)等提供科學(xué)理論依據(jù).在病原學(xué)和致病機(jī)制方面，開(kāi)展ASFV分離鑒定，遺傳演化、分子流行病學(xué)的研究，揭示遺傳特征，研究排毒與抗體產(chǎn)生規(guī)律，解析關(guān)鍵蛋白結(jié)構(gòu)與功能，繪制ASFV與宿主互作網(wǎng)絡(luò)，揭示免疫逃逸和感染的分子機(jī)制.在疫苗創(chuàng)制方面，重點(diǎn)開(kāi)展新型疫苗的創(chuàng)制以及突破產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸[48].同時(shí)以ASFV復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等相關(guān)的酶或因子為靶點(diǎn)開(kāi)發(fā)抗病毒藥物，也是防控疫情的一個(gè)重要策略.早期診斷和撲殺是防控主要策略，有效的生物安全措施能夠減少ASFV傳播，能夠阻止其在豬場(chǎng)間的蔓延.目前ASF防治不僅需要遵守生物安全的要求，強(qiáng)化生物安全防御，嚴(yán)格執(zhí)行防控措施，以防治為內(nèi)核，同時(shí)重點(diǎn)開(kāi)展臨床應(yīng)用的疫苗和治療藥物的研發(fā)也迫在眉睫.