晏曲穎，黃衛(wèi)平，范東婷，黃 林，金素鈺，鄭玉才*

（1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省涼山州畜牧科學(xué)研究所，四川 西昌 615042）

黑綿羊是四川省涼山彝族自治州的主要畜種之一，肉用性能好，在涼山州各縣均有分布，以昭覺、鹽源、普格、布拖、美姑等縣的飼養(yǎng)量較多［1］。目前黑綿羊主要采用家庭飼養(yǎng)繁殖方式，缺乏系統(tǒng)選育，因此存在形態(tài)外貌和生產(chǎn)性能差異大等問題［2］。Y染色體作為雄性動(dòng)物特有的染色體，遵循嚴(yán)格的父系遺傳，是研究父系遺傳多樣性的重要遺傳標(biāo)記位點(diǎn)。單核苷酸多態(tài)性（SNP）廣泛存在于基因組中，研究Y 染色體單核苷酸多態(tài)性（Y-SNP）有助于從分子水平上闡明畜禽遺傳多樣性和父系起源。研究發(fā)現(xiàn)，位于Y染色體上的性別決定區(qū)（SRY基因）存在多個(gè)SNP位點(diǎn)，具有豐富的多態(tài)性。綿羊的雄性決定區(qū)（MSY）中僅SRY基因具有多態(tài)性［3］。

本研究選用四川省涼山州3個(gè)縣的黑綿羊公羊，測(cè)定Y 染色體部分已知單核苷酸多態(tài)性，以分析該地區(qū)黑綿羊父系遺傳多樣性，為地方黑綿羊的起源、進(jìn)化及科學(xué)育種等工作提供更全面的資料和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)綿羊及樣品采集 在四川省涼山州的鹽源縣、普格縣、布拖縣三個(gè)縣分別選擇健康成年公黑綿羊21 只、12 只和10 只（共43 只），采集血樣約10 mL。置于含有乙二胺四乙酸（EDTA）的一次性抗凝管中，裝入冰瓶低溫帶回實(shí)驗(yàn)室，保存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2 主要儀器和試劑 主要儀器：核酸蛋白檢測(cè)儀（WPA Biowave），購自英國(guó)Biochrom 公司；凝膠成像系統(tǒng)（VersaDoc1000）、電泳儀（POWER/PAC3000）、梯度PCR 儀（C1000），均購自美國(guó)Bio-Rad公司。

主要試劑：Golden Star T6 Super PCR Mix，購自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司；DNeasy Blood ＆ Tissue Kit，購自德國(guó)Qiagen 公司；DL-2000 Marker 和TIANamp Genomic DNA Kit（DP304）試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 基因組DNA 的提取 按照TIANamp Genomic DNA Kit（DP304）試劑盒說明書，從全血中提取黑綿羊基因組DNA，在血液離心出的白細(xì)胞沉淀中先后加入緩沖液GA和緩沖液GB，振蕩混勻靜置10 min，再加入無水乙醇充分振蕩混勻，將混合物在收集管的吸附柱中離心棄去廢液，加入緩沖液GD 后離心棄廢液，使用漂洗液PW 離心漂洗兩次，室溫放置徹底晾干，用30 μL無菌水洗脫，置于-20 ℃凍存。

1.4 黑綿羊Y 染色體SRY 基因片段的PCR 擴(kuò)增及測(cè)序 用PCR 方法擴(kuò)增黑綿羊Y 染色體SRY 基因8 個(gè)位點(diǎn)（oY1～oY8）所在的基因片段，根據(jù)其在參考序列AY604734［4］中的位置，分別位于序列的88 bp、99 bp、103 bp、122 bp、157 bp、393 bp、397 bp、399 bp。PCR 擴(kuò)增使用文獻(xiàn)中的引物［5］，上游引物：5′-TCAGTAGCTTAGGTACATTCA-3′，下游引物：5′-GTGCTACATAAATATGATCTGC-3′。擴(kuò)增區(qū)域?yàn)镾RY 基因啟動(dòng)子區(qū)域［6］，預(yù)期長(zhǎng)度為549 bp。

PCR 擴(kuò)增體系和條件：黑綿羊基因組DNA（50～120 ng/μL）模板3 μL，上下游引物各1 μL，Golden mix 20 μL。95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min后于12 ℃保存。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將與目的條帶大小近似的特異PCR 產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行正向測(cè)序。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 將獲得的序列用DNAman 5.2.2.0軟件與GenBank中SRY基因序列（AY604734）進(jìn)行比對(duì)，確定SNP 位點(diǎn)；使用DNA SP 5.10.01軟件分析單倍型、單倍型多樣性及核苷酸多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑綿羊Y染色體上8個(gè)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增 黑綿羊Y染色體SRY基因8個(gè)位點(diǎn)所在的基因片段經(jīng)PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上條帶清晰。PCR 引物在退火溫度為50～58.3 ℃范圍內(nèi)，擴(kuò)增特異性均較強(qiáng)，PCR 產(chǎn)物條帶大小符合549 bp 預(yù)期，可用于后續(xù)直接測(cè)序（圖1）。

圖1 黑綿羊Y染色體基因片段PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 黑綿羊Y 染色體上8 個(gè)SNP 位點(diǎn)的基因分型 對(duì)試驗(yàn)樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，顯示測(cè)序圖的波峰與波谷清晰，波峰之間的距離均勻，無雜峰干擾。在試驗(yàn)樣品中檢測(cè)到一個(gè)突變位點(diǎn)oY1（88 A/G）（圖2）。

圖2 黑綿羊oY1位點(diǎn)測(cè)序部分峰圖

PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，試驗(yàn)樣品（n＝43）中oY2～oY8 位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)SNP，有4 個(gè)樣品在oY1位點(diǎn)存在A/G轉(zhuǎn)換，其中3個(gè)樣品為普格縣黑綿羊。根據(jù)oY1 位點(diǎn)的差異，將43 只試驗(yàn)黑綿羊分為OAR1 和OAR2 兩種單倍型，各地區(qū)單倍型分布見表1。全部黑綿羊中OAR1 基因型占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（占90%），3 個(gè)縣存在差異，其中普格縣黑綿羊的OAR1 基因型比例最低（占75%）。使用DnaSPv 5.10.01 軟件計(jì)算得到?jīng)錾降貐^(qū)黑綿羊單倍型多樣性為0.173±0.072，核苷酸多樣性為0.000 38±0.000 13。

表1 各地區(qū)黑綿羊單倍型分布

從表2 可知，試驗(yàn)黑綿羊oY2～oY8 共7 個(gè)位點(diǎn)的堿基與報(bào)道的O.aries-1 相同，未檢測(cè)到SNP，而oY1 位點(diǎn)的堿基與O.aries-1 或O.aries-2相同，絕大部分個(gè)體堿基為A。

表2 綿羊Y染色體SNP位點(diǎn)堿基情況

3 討論

3.1 哺乳動(dòng)物Y 染色體遺傳多樣性 哺乳動(dòng)物Y染色體中有95%的區(qū)域不與X染色體發(fā)生配對(duì)重組，被稱為雄性特異區(qū)域（MSY），僅有位于兩末端的擬染色體區(qū)域可與X 染色體交換遺傳物質(zhì)。MSY遵循嚴(yán)格的父系遺傳，是研究現(xiàn)代家養(yǎng)動(dòng)物父系起源進(jìn)化的理想遺傳標(biāo)記［8］。在家養(yǎng)動(dòng)物研究中，MSY 序列分析可揭示其形成、馴化等進(jìn)化事件。目前在牛、豬等家養(yǎng)動(dòng)物起源與進(jìn)化方面已有大量研究成果。Kikkawa 等［9］通過黃牛SRY 基因上的Y-SNPs 分析，推測(cè)亞洲各地的家牛為多父系起源。

3.2 綿羊Y 染色體父系遺傳 有關(guān)世界各地家養(yǎng)綿羊和野生綿羊在起源進(jìn)化、遷徙路徑、遺傳變異、父系多樣性及父系遺傳等方面已有一些研究報(bào)道［10-11］。Meadows 等［12］通過SNP 和微衛(wèi)星方法確定綿羊會(huì)有11個(gè)Y染色體單倍型。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)Y 染色體的SNP 和插入缺失變異［13］。然而，綿羊的Y染色體變異比較有限，包含大量重復(fù)序列，遺傳多樣性較低且組裝測(cè)序極其困難，目前尚沒有完整的綿羊Y染色體序列［14］。

與Y染色體相比，線粒體DNA（mtDNA）突變速率快且無重組，遺傳多樣性相對(duì)豐富［15］，因此被廣泛用于探索物種起源和進(jìn)化變遷［16］。

3.3 涼山州黑綿羊Y 染色體單倍型 本研究在黑綿羊的oY1位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)一個(gè)SNP（A/G），根據(jù)此結(jié)果將黑綿羊分為兩個(gè)單倍型，分別為OAR1、OAR2，且OAR1 基因型占明顯優(yōu)勢(shì)。oY1 為種內(nèi)突變位點(diǎn)，是黑綿羊樣本中該基因唯一表現(xiàn)出變異的SNP，提示3 個(gè)黑綿羊群體為同一類群。其他7 個(gè)位點(diǎn)為種間突變位點(diǎn)，均未發(fā)現(xiàn)突變。在黑綿羊群體中，這7 個(gè)SNP 位點(diǎn)（oY2～oY8）的堿基似乎是固定的，需要擴(kuò)大樣品量確定。本次試驗(yàn)僅在普格縣群體與布拖縣群體中發(fā)現(xiàn)SNP，在樣本數(shù)量較多的鹽源縣黑綿羊中未檢測(cè)到SNP。

通過對(duì)全球214 個(gè)群體共3 056 只家養(yǎng)綿羊的Y 染色體標(biāo)記位點(diǎn)oY1 進(jìn)行基因分型，認(rèn)為亞洲摩弗倫羊可能與東方盤羊之間存在基因交流［13］。在北歐綿羊群體中發(fā)現(xiàn)高比例的G單倍型，這與芬蘭和愛沙尼亞綿羊古DNA相應(yīng)的單倍型一致，表明北歐綿羊群體保存著早期綿羊遷徙的遺傳物質(zhì)［17］。在前人的調(diào)查中，oY1 中的A 堿基在所有歐洲羊種中普遍存在，因此推測(cè)本研究中攜帶OAR2單倍型的黑綿羊父系起源于歐洲地區(qū)的可能性較大，這為地方黑綿羊類群的進(jìn)化研究提供了新的證據(jù)。董澤生等［18］研究表明，藏系綿羊SRY 基因的核苷酸多樣性為0.046±0.005，單倍型多樣性為0.861±0.044，其遺傳多樣性明顯高于四川涼山地區(qū)黑綿羊?；赮-SNP分析，涼山黑綿羊的核苷酸多樣性和單倍型多樣性比巴里坤馬（核苷酸多樣性為0.000 56，單倍型多樣性為0.527）低。

通過常染色體微衛(wèi)星和mtDNA序列變異來研究綿羊的起源，無法確定父本基因的影響［19-20］。本研究對(duì)地方黑綿羊Y 染色體上的SNP 進(jìn)行分析，其結(jié)果有助于更全面地認(rèn)識(shí)涼山地區(qū)黑綿羊的起源和進(jìn)化，但本研究?jī)H分析了黑綿羊SRY基因的部分區(qū)域，不足以涵蓋Y 染色體所有信息，需要增加研究的位點(diǎn)數(shù)，以便全面了解其父系遺傳特點(diǎn)。

4 結(jié)論

四川省涼山地區(qū)黑綿羊Y 染色體SRY 基因的遺傳多樣性較低，在3個(gè)群體中僅檢測(cè)到一個(gè)YSNP（oY1，G/A），據(jù)此將其分為OAR1 和OAR2 兩種單倍型，其中OAR1 占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)（90%），初步推測(cè)該地區(qū)的黑綿羊可能存在兩個(gè)父系起源?！?/p>