蘭圓圓 楊苗 黃志強(qiáng) 朱開梅

【摘要】目的：研究梁王茶不同極性部位抗氧化和抑制酪氨酸酶活性的作用。方法：采用有機(jī)溶劑萃取法萃取得到梁王茶乙酸乙酯、正丁醇和水相部位，采用DPPH法、ABTS法、L-DOPA法評價各萃取部位對自由基的清除能力和酪氨酸酶抑制活性。結(jié)論：梁王茶提取物具有較好的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制作用，乙酸乙酯提取物為其主要活性部位，具有開發(fā)成護(hù)膚品的潛在應(yīng)用價值。

【關(guān)鍵詞】梁王茶;抗氧化;酪氨酸酶[1]

基金項目：廣西創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展專項項目（桂科AA18118015）;桂林市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目（2020011203-1，2020011203-2）

異葉梁王茶（Notho panax davidii）系五加科梁王茶屬植物，是喀斯特地區(qū)的特色藥材，在廣西桂西北、桂東北及貴州、云南等少數(shù)民族地區(qū)被廣泛飲用，具有抗風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨、治療胃病、咽喉熱痛等功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)梁王茶屬植物具有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病毒、抑菌、調(diào)節(jié)免疫、防治心腦血管疾病以及解酒保肝等作用。

近年來，人們越來越關(guān)注皮膚的健康與保養(yǎng)，如抗衰老、美白、色素沉著等。各種自由基所引發(fā)的氧化損傷是導(dǎo)致衰老的原因之一;酪氨酸酶過度激活導(dǎo)致的肌膚色素沉著，也是引起衰老的重要原因。由于化學(xué)合成的抗氧化、美白產(chǎn)品會對人體有一定副作用，因此尋找有效、安全、天然的抗氧化劑及酪氨酸酶活性抑制劑是國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。本文對梁王茶藥材各萃取部位的抗氧化和抑制酪氨酸酶活性活性進(jìn)行評價，為梁王茶的開發(fā)利用提供參考價值和科學(xué)依據(jù)。

1 實驗儀器與材料

N-1300D EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海巴玖實業(yè)有限公司）;ReadMax 1200型光吸收全波長酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）。無水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇等（天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品）;DPPH（梯希愛有限公司）;ABTS試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）;酪氨酸酶（九鼎化學(xué)有限公司）;抗壞血酸Vc、熊果酸（津一方科技有限公司）;除另有說明外，所有試劑均為分析級，實驗用水為超純水。

2 實驗方法

2.1 梁王茶乙醇提取物及不同溶劑提取物的制備

異葉梁王茶采自廣西植物研究所。參考文獻(xiàn)方法，稱取梁王茶干燥品500g，按料液比1：10加入95%乙醇，60℃回流提取，減壓濃縮得梁王茶乙醇提取物。采用有機(jī)溶劑萃取法，得到梁王茶乙酸乙酯、正丁醇以及剩下的水相部位，將各極性部位萃取物減壓濃縮，作為實驗樣品。

2.2 抗氧化活性研究

2.2.1 DPPH法

參考文獻(xiàn)方法，以VC為陽性對照，將不同濃度的樣品和DPPH工作液加入到96孔板的各孔中，同時以無水乙醇代替DPPH工作液作為對照空白，并以無水乙醇代替樣品作為樣品空白?；旌虾笫覝乇芄夥磻?yīng)30 min，在517 nm波長處測吸光度。

2.2.2 ABTS法

按試劑盒說明取相同體積的ABTS溶液以及氧化劑溶液。參考文獻(xiàn)方法，將96孔板內(nèi)加入200 μL ABTS工作液后，進(jìn)行分組實驗，一組加入不同濃度的Trolox溶液，用來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，另一組加入10 μL不同濃度提取液，作為樣品組。同時用PBS代替樣品溶液作為空白對照。室溫孵育5 min，在405 nm處測定吸光度。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品的總抗氧化能力。

2.3 酪氨酸酶抑制活性研究

參考文獻(xiàn)方法并稍作修改。吸取不同濃度梁王茶樣品和熊果酸于96孔板中，加入80 μL PBS緩沖液和40 μL底物溶液，于37 ℃的恒溫箱孵育10 min 后，迅速加入40 μL 酪氨酸酶啟動反應(yīng)，反應(yīng)30 min后，在475 nm 處測定吸光度A。

3 結(jié)果

3.1 DPPH自由基的清除能力

由圖1可知，在0.05～0.8 mg/mL濃度范圍內(nèi)，梁王茶各萃取物對DPPH自由基均具有一定程度的清除作用，呈正量效關(guān)系。樣品對DPPH自由基清除大小依次為VC>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>醇提部位>水相部位。梁王茶乙酸乙酯部位在其質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時清除率高達(dá)94.18 %。梁王茶乙酸乙酯部位其清除能力僅次于Vc，Vc對DPPH自由基的IC50= 0.02982 mg/mL，而乙酸乙酯部位的IC50= 0.04677 mg/mL。

3.2 ABTS自由基的清除能力

如圖2所示，梁王茶各極性萃取物均有不同程度的抗氧化能力，不同部位之間抗氧化活性相差較大。整體上看，當(dāng)提取物質(zhì)量濃度達(dá)0.4 mg/mL后，清除率曲線變化緩慢。各萃取部位中，乙酸乙酯部位清除ABTS自由基能力最強(qiáng)，在0.8 mg/mL時高達(dá)1.3667 mmol/L，與Vc的抗氧化能力相當(dāng)。樣品對ABTS自由基清除大小為：VC≥乙酸乙酯部位>正丁醇部位>醇提部位>水相部位。

3.4酪氨酸抑制活性評價

結(jié)果如表3所示。梁王茶各萃取部位均表現(xiàn)出不同的抗酪氨酸酶活性。其對酪氨酸酶抑制活性強(qiáng)弱依次為熊果酸>乙酸乙酯部位>正丁醇部位≥醇提部位>水相部位。乙酸乙酯部位對于酪氨酸酶的抑制作用最好，其IC50為0.2170 mg/mL。說明梁王茶中發(fā)揮抑制酪氨酸酶作用的活性成分主要溶解在乙酸乙酯部位。

4 討論

本研究表明，異葉梁王茶各萃取部位均有不同程度的抗氧化以及抑制酪氨酸酶活性的作用，且成濃度依賴性。在相同質(zhì)量濃度下，梁王茶乙酸乙酯部位對DPPH、ABTS的清除能力優(yōu)于其它部位P<0.05。梁王茶乙酸乙酯部位提取物抑制酪氨酸酶活性的能力也最強(qiáng)，其IC50為0.082 mg/mL，僅次于陽性對照熊果酸。以上實驗結(jié)果提示，梁王茶乙酸乙酯部位具有較強(qiáng)的清除自由基的能力，降低了自由基對黑色素細(xì)胞的損傷;可抑制酪氨酸酶的活性，從而抑制機(jī)體黑色素合成，因此推斷乙酸乙酯部位可能是梁王茶抗衰老、防止色素沉著的主要有效部位。本文首次報道了異葉梁王茶不同提取部位的抗氧化及抑制酪氨酸酶活性，證明其乙酸乙酯部位的藥效相對較強(qiáng)，因此可將其作為研究重點(diǎn)，其最優(yōu)的單一活性成分還需做進(jìn)一步研究。

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通信作者：朱開梅（1967-），女，漢，教授，主要從事糖尿病并發(fā)癥及藥物治療。

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