衛(wèi) 凱，朱慧森，岑慧芳，程映杰

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院，山西 太谷 030801）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是黃土高原地區(qū)的當(dāng)家牧草，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，粗蛋白、維生素和礦物質(zhì)含量豐富，氨基酸的組成比較齊全，適口性好[1]。其中，偏關(guān)苜蓿是山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所和偏關(guān)縣畜牧局選育登記的地方品種，具有抗寒、抗旱性強(qiáng)以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)[2]。山西處于山丘地帶，屬中緯度東亞季風(fēng)氣候，離海洋相對(duì)較遠(yuǎn)，旱災(zāi)時(shí)有發(fā)生[3]。這使得苜蓿產(chǎn)量通常很低，因而，了解紫花苜蓿抗旱的生理和分子遺傳機(jī)制對(duì)于紫花苜蓿的可持續(xù)生產(chǎn)至關(guān)重要。

干旱脅迫下，植物細(xì)胞中的酶促防御系統(tǒng)可以通過(guò)維持活性氧等物質(zhì)的產(chǎn)生和清除的平衡來(lái)緩解細(xì)胞受到的損傷[4]，植物保護(hù)酶系統(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）等[5]。保護(hù)酶活性的主要研究方法在20世紀(jì)70年代得到發(fā)明和建立[6]。張新蘭[7]測(cè)定了不同品種苜蓿葉片在干旱脅迫下抗氧化酶活性的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明，抗旱性強(qiáng)的品種在干旱脅迫下草產(chǎn)量更高，葉片CAT、POD和SOD活性較高。張翠梅等[8]研究了PEG模擬干旱脅迫下紫花苜蓿葉片的膜脂過(guò)氧化程度，結(jié)果表明，抗旱性強(qiáng)的苜蓿品種葉片的膜脂過(guò)氧化程度更低。李紅等[9]采用PEG對(duì)12種不同抗旱性的紫花苜蓿進(jìn)行干旱脅迫，結(jié)果顯示，不同抗旱性品種的葉片保護(hù)酶活性不同。因此，SOD、POD和CAT等保護(hù)酶的活性大小可以作為苜?？购敌栽u(píng)價(jià)的指標(biāo)。

植物在干旱條件下，能夠誘發(fā)全部組織水平的應(yīng)答，不僅涉及形態(tài)學(xué)水平的變化調(diào)整，還包括細(xì)胞水平的應(yīng)答[10]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Transcriptome）研究可以反映在特定時(shí)間和特定環(huán)境下植物與正常條件下的差異基因表達(dá)情況以及所在通路，有助于了解植物適應(yīng)逆境脅迫的機(jī)制，從而有助于發(fā)現(xiàn)抵抗和緩解逆境脅迫的相關(guān)基因[11]。植物感受干旱信號(hào)后，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激發(fā)一系列生理生化變化，在分子水平調(diào)控特定基因表達(dá)的過(guò)程尤為關(guān)鍵[12]，最早是1997年VELCULESCU等[13]提出在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的基因表達(dá)差異分析實(shí)際上就是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究。MA等[14]對(duì)紫花苜蓿Dryland品種在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，篩選出1 690個(gè)上調(diào)基因和3 827個(gè)下調(diào)基因，富集分析發(fā)現(xiàn)，蔗糖合酶、胺氧化酶和脂酰輔酶A還原酶相關(guān)基因在紫花苜蓿響應(yīng)干旱脅迫的過(guò)程中具有重要研究?jī)r(jià)值。劉佳月[15]在干旱脅迫下紫花苜蓿中草5號(hào)的研究發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因在苯丙烷生物合成和谷胱甘肽代謝通路顯著富集，其數(shù)量在與代謝途徑相關(guān)的方面注釋最多，在次生代謝物的生物合成上也有相對(duì)較多的注釋數(shù)量。對(duì)甘農(nóng)三號(hào)品種抗旱性的分析發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿可以通過(guò)調(diào)控與脂質(zhì)代謝、氨基酸代謝、碳水化合物代謝和次級(jí)代謝等通路相關(guān)的基因表達(dá)來(lái)響應(yīng)干旱脅迫，增強(qiáng)抗旱能力[16]。

基于前期開(kāi)展的偏關(guān)苜蓿種子萌發(fā)期的耐受性、顯微結(jié)構(gòu)的響應(yīng)特征以及關(guān)鍵酶的活性等研究工作[17-20]，發(fā)現(xiàn)偏關(guān)苜蓿表現(xiàn)出的抗旱潛力還有待挖掘，尤其在分子水平調(diào)控特定基因表達(dá)的過(guò)程[4]。本試驗(yàn)以偏關(guān)苜蓿為研究材料，分析其在干旱脅迫和正常條件下保護(hù)酶及轉(zhuǎn)錄組的差異性，挖掘與抗旱相關(guān)的基因，為培育抗旱性強(qiáng)、性狀優(yōu)良的苜蓿新種質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為籽粒飽滿、外形完整、大小均勻的偏關(guān)苜蓿種子，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院牧草種質(zhì)資源庫(kù)提供。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。將偏關(guān)苜蓿種子播種于營(yíng)養(yǎng)缽，置于14 h光照、10 h黑暗的培養(yǎng)箱中，晝夜溫度分別為25、20?C，用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液每日定時(shí)澆灌。30 d后挑選生長(zhǎng)情況一致的偏關(guān)苜蓿，在20%PEG溶液（用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液配制）中進(jìn)行72 h的脅迫處理。未進(jìn)行干旱處理的材料為對(duì)照組，脅迫72 h的為干旱組，采集偏關(guān)苜蓿葉片，用于SOD、POD、CAT、APX活性的測(cè)定及RNA提取。

1.3 保護(hù)酶活性的測(cè)定

SOD活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[21]進(jìn)行，采用NBT光還原法測(cè)定其在560 nm波長(zhǎng)處的吸光值，酶活性以抑制3 mL NBT反應(yīng)液光化學(xué)反應(yīng)的50%所需酶量為1個(gè)活性單位；POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚顯色法[21]，在分光光度計(jì)上測(cè)量470 nm下5 min時(shí)的吸光值，以每分鐘每克樣品鮮質(zhì)量吸光值的變化為1.0表示1個(gè)活性單位；CAT活性測(cè)定參照高俊鳳[22]中的H2O2分解法，以1 min內(nèi)A240減少0.1的酶量記為1個(gè)酶活性單位，共計(jì)時(shí)4 min；APX活性采用高俊鳳[22]的方法測(cè)定，在20℃下測(cè)定10～30 s內(nèi)A290的變化，計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)抗壞血酸減少量及酶活性。

1.4 RNA提取及高通量測(cè)序

試驗(yàn)采用TRIzol法提取RNA。檢測(cè)合格的樣品采用Illumina Hiseq TM 2500進(jìn)行高通量測(cè)序，將得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，再利用TRINITY[23]軟件進(jìn)行組裝，采用CD-HIT[24]方法選擇相似類中最長(zhǎng)的作為唯一基因，得到基因的序列集合（Unigene）。

1.5 基因功能注釋

將Unigene序列與NR（NCBI non-redundant protein sequences）、NT（NCBInucleotidesequences）、COG（Clusters of Orthologous Groups of proteins）、Swiss-Prot、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）、GO（Gene Ontology）六大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因功能注釋[25]。

1.6 差異表達(dá)基因分析

基因表達(dá)量的計(jì)算使用RPKM法[26]（Reads per kilobase million）。差異基因的篩選條件為：FDR＜0.05和|log2FC≥1|。GO分 析 的 方 法 是GOseq[27]。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路（Pathway）分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和SAS 9.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下偏關(guān)苜蓿SOD、POD、CAT和APX活性變化

從表1可以看出，偏關(guān)苜蓿葉片的干旱組SOD、POD、CAT和APX活性相對(duì)于對(duì)照組均顯著上升（P＜0.05），其中，干旱組的POD活性是對(duì)照組的4.87倍。

表1 對(duì)照組與干旱組葉片中保護(hù)酶活性比較Tab.1 Comparison of protective enzyme activities in leaves of the control and drought groups

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

測(cè)序結(jié)果如表2所示，對(duì)照組和干旱組的Q20百分率分別達(dá)到98.09%和98.05%，GC百分率平均值分別為51.56%和51.08%，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量偏好。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)輸出質(zhì)量情況Tab.2 The output quality of sequencing data

2.3 轉(zhuǎn)錄組的拼裝

過(guò)濾后的測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)拼裝后最終得到79 794條Unigene，總長(zhǎng)度為81201 250 bp，平均長(zhǎng)度為1 018bp，N50為1 599 bp（表3）。采用組裝序列的長(zhǎng)度分布來(lái)衡量轉(zhuǎn)錄組組裝質(zhì)量，可知序列滿足分析的要求。

表3 Unigene的長(zhǎng)度及數(shù)量統(tǒng)計(jì)Tab.3 Unigene length and quantity statistics

2.4 基因功能注釋

由表4可知，成功注釋到56 911條Unigenes，注釋到6個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)量分別是53 963（94.82%）、50 745（89.17%）、36 588（64.29%）、35 212（61.87%）、23 866（41.94%）、40 252個(gè)（70.73%），NR數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋百分比最高。

表4 Unigene在各大數(shù)據(jù)庫(kù)中的功能注釋情況Tab.4 Statistics of Unigene functional annotation accor ding to the major databases

利用NR數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源物種比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖1），與偏關(guān)苜蓿同源基因相似度最高的是高粱，相似率達(dá)38.60%；其次為玉米（Zea mays），相似率為26.10%；日本水稻（Oryza sativa）的相似率為14.30%；二穗短柄草（Brachypodium distachyon）的相似率為6.90%。

對(duì)所有的Unigenes進(jìn)行SSR分析，共識(shí)別出7 868個(gè)SSR。其中，二堿基重復(fù)2 570個(gè)，三堿基重復(fù)4 931個(gè)，四堿基重復(fù)85個(gè)，五堿基重復(fù)169個(gè)，六堿基重復(fù)113個(gè)，各堿基的分布頻率如表5所示。

表5 SSR分布頻率Tab.5 SSR distr ibution fr equency

2.5 基因差異性表達(dá)分析

進(jìn)行差異基因篩選，獲得5 867個(gè)差異表達(dá)基因，上調(diào)基因占總數(shù)的46.28%，下調(diào)基因占總數(shù)的53.72%。對(duì)基因的表達(dá)量制作火山圖進(jìn)行分析，如圖2所示。

2.6 差異表達(dá)基因的GO分析

對(duì)處理組和干旱組之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析,結(jié)果如圖3所示，圖中從左往右依次為生物附著、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞組分組織或生物合成、細(xì)胞過(guò)程、發(fā)育過(guò)程、定位系統(tǒng)的建立、生長(zhǎng)、免疫系統(tǒng)過(guò)程、定位、代謝過(guò)程、多元有機(jī)體過(guò)程、多細(xì)胞生物過(guò)程、生物過(guò)程負(fù)調(diào)控、生物過(guò)程正調(diào)控、生物過(guò)程的調(diào)節(jié)、繁殖、繁殖過(guò)程、應(yīng)急響應(yīng)、節(jié)律過(guò)程、信號(hào)傳導(dǎo)、單生物過(guò)程、細(xì)胞、細(xì)胞連接、細(xì)胞部分、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)部分、胞外器、胞外區(qū)部分、高分子復(fù)合物、膜、膜部分、膜包圍腔、擬核、細(xì)胞器、細(xì)胞器部分、共質(zhì)體、病毒體、病毒體部分、抗氧化活性、結(jié)合、催化活性、電子載體活性、酶調(diào)節(jié)活性、金屬伴侶活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、營(yíng)養(yǎng)貯藏、蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、受體活性、結(jié)構(gòu)分子、轉(zhuǎn)運(yùn)活性，注釋到51個(gè)類別，3個(gè)部分中數(shù)目最多的類別分別是代謝過(guò)程（2 145個(gè)）、細(xì)胞（2 785個(gè)）、催化活性（2 035個(gè)）；進(jìn)行GO富集分析，選擇富集度高的前30個(gè)如圖4所示，3個(gè)部分中富集最多的類別分別是作用于糖基鍵水解酶活性、染色體和DNA包裝。

對(duì)照組與干旱組蛋白激酶、O-糖基化合物水解酶、過(guò)氧化物酶、作用于糖基鍵的水解酶、木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶、抗氧化酶和蛋白磷酸酶活性等相關(guān)基因功能有明顯差異。基因功能注釋表明，代謝過(guò)程、催化活性、金屬伴侶活性、抗氧化活性和酶調(diào)節(jié)活性等與干旱脅迫聯(lián)系緊密的生物學(xué)過(guò)程和分子功能具有明顯的響應(yīng)變化。

2.7 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

偏關(guān)苜蓿共有35 215條Unigenes可在KEGG中得到注釋，占Unigene總數(shù)的61.88%，注釋到代謝途徑的數(shù)目最多，為9 106個(gè)。KEGG富集分析表明，有3 471個(gè)差異表達(dá)基因可注釋到122條代謝途徑。

統(tǒng)計(jì)分析可知，122條代謝途徑中最顯著的4個(gè)是次生代謝產(chǎn)物的生物合成、植物病原體相互作用、苯丙烷的生物合成和其他聚糖降解，最顯著的前20個(gè)通路相關(guān)的差異表達(dá)基因占總量的59.69%。由表6和圖5可知，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)合成與降解、代謝途徑和次生代謝等通路相關(guān)基因的數(shù)量最多。差異表達(dá)基因在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和次生代謝物的生物合成富集程度相對(duì)較高。

表6 差異表達(dá)基因富集程度排名前20的Pathway條目Tab.6 Top 20 enrichment pathway in differentially expressed genes

從次生代謝物的生物合成、苯丙烷生物合成和植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等代謝通路中挑選出部分與MYC2轉(zhuǎn)錄因子、苯丙氨酸酶、類胡蘿卜素結(jié)合蛋白、光合作用蛋白、淀粉酶、蔗糖合酶有關(guān)的基因作為偏關(guān)苜蓿響應(yīng)干旱脅迫的候選基因，主要有Unigene12274_All、Unigene10105_All、Unigene35365_All、CL7158.Contig1_All、CL 11234.Contig1_All、CL 12445.Conti g1_All、Unigene12274_All、CL4041.Contig1_All。

2.8 抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測(cè)

對(duì)材料中與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的差異基因進(jìn)行了功能注釋，共得到136個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors，TFs）基因，被分為18個(gè)基因家族，其中，數(shù)目較多的是bHLH（29個(gè)）、WRKY（22個(gè)）、ERFs（18個(gè)）和MYB（11個(gè)）。篩選出表達(dá)差異倍數(shù)2以上的轉(zhuǎn)錄因子基因（表7），這些轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)干旱脅迫中可能發(fā)揮重要的作用。

表7 可能與抗旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Tab.7 Possibly dr ought-r esistance-related transcr iption factors

3 討論

3.1 干旱脅迫對(duì)偏關(guān)苜蓿保護(hù)酶的影響

干旱脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧，活性氧的氧化作用會(huì)對(duì)植物造成損傷，植物清除活性氧的能力強(qiáng)弱是抗旱性評(píng)價(jià)的重要生理指標(biāo)[28]。SOD是一種廣泛存在于植物內(nèi)的酶，可以清除活性氧自由基從而使植物免受傷害。OLGA等[29]在干旱脅迫下研究不同抗旱性玉米品種的SOD活性差異，結(jié)果表明，正常條件下不同抗性品種的SOD活性無(wú)明顯差異，但在干旱脅迫下抗旱性強(qiáng)的品種SOD活性顯著高于抗旱性差的品種，可能的原因是抗旱性強(qiáng)的品種保護(hù)酶活性強(qiáng)，SOD相關(guān)基因表達(dá)量更高。本研究結(jié)果表明，偏關(guān)苜蓿葉片SOD活性顯著高于未脅迫時(shí)，與韓剛等[30]研究結(jié)果一致，說(shuō)明干旱脅迫下SOD活性提高有利于偏關(guān)苜蓿清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的過(guò)量活性氧，增強(qiáng)偏關(guān)苜蓿的干旱脅迫耐受性。

POD是酶促反應(yīng)系統(tǒng)的保護(hù)酶，通過(guò)防御活性氧來(lái)緩解干旱脅迫對(duì)植物的傷害。植物感受干旱信號(hào)后會(huì)調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，多數(shù)POD的合成屬于誘導(dǎo)表達(dá)型，與植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)[31]。干旱處理后小麥幼苗根和葉中的POD活性顯著增強(qiáng)[32]，與本研究一致，偏關(guān)苜蓿在干旱脅迫下POD活性顯著升高，發(fā)揮其清除活性氧的生理功能。

CAT對(duì)H2O2具有較高的親和力，可以清除植物體內(nèi)過(guò)多的H2O2，將H2O2分解為對(duì)細(xì)胞無(wú)害的水和分子氧。研究表明，干旱脅迫下植物體內(nèi)CAT活性會(huì)發(fā)生改變，高粱CAT活性在干旱脅迫下顯著增加，證明CAT是高粱重要的保護(hù)性酶[33]。也有研究發(fā)現(xiàn)，小麥抗旱性與干旱脅迫下CAT基因表達(dá)量密切相關(guān)，CAT等保護(hù)酶活性較高的品種抗旱性更強(qiáng)[34]，與本試驗(yàn)結(jié)果相一致，干旱脅迫下偏關(guān)苜蓿葉片CAT活性顯著高于未脅迫時(shí)，說(shuō)明偏關(guān)苜?？梢栽鰪?qiáng)CAT活性來(lái)響應(yīng)干旱脅迫。

APX是植物體內(nèi)清除H2O2的關(guān)鍵酶。研究表明，甘薯在干旱脅迫下APX活性增強(qiáng)，H2O2含量減少，從而削弱其對(duì)光合的抑制，保護(hù)葉綠體[35]。轉(zhuǎn)APX棗樹(shù)在干旱條件下，APX活性高于非轉(zhuǎn)基因植株，表明轉(zhuǎn)基因棗樹(shù)耐旱能力強(qiáng)于非轉(zhuǎn)基因植物[36]。本研究結(jié)果表明，偏關(guān)苜蓿葉片APX活性顯著高于未脅迫時(shí)，APX通過(guò)有效清除活性氧在增強(qiáng)偏關(guān)苜蓿的耐旱能力中起一定作用。

3.2 干旱脅迫下偏關(guān)苜蓿轉(zhuǎn)錄組的差異性

干旱脅迫下，植物細(xì)胞通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)調(diào)控抗旱相關(guān)基因表達(dá)，使自身結(jié)構(gòu)、生理生化以及物質(zhì)代謝發(fā)生一系列變化。利用高通量測(cè)序技術(shù)可以研究偏關(guān)苜蓿干旱響應(yīng)基因，對(duì)測(cè)序結(jié)果的統(tǒng)計(jì)和評(píng)估可知本次數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，本研究共得到79 794條Unigenes，平均長(zhǎng)度1 018 bp，所得到的Unigenes數(shù)量低于黃花苜蓿的114 347條[37]，而高于中苜一號(hào)紫花苜蓿的41 734條[15]，造成這種差異的原因可能是品種和試驗(yàn)環(huán)境不同。本研究所有的Unigenes在六大功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了注釋，其中在NR數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋率最高，與劉佳月[15]對(duì)紫花苜蓿的研究結(jié)果相同。Unigenes在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋率高達(dá)99.1%，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與偏關(guān)苜蓿同源率最高的是高粱，其次是玉米和日本水稻。SSR標(biāo)記有多態(tài)性高、穩(wěn)定性好和不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，是遺傳變異研究最好的標(biāo)記之一，目前已在苜蓿種質(zhì)鑒定、親緣關(guān)系、DNA遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記育種和遺傳多樣性等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[38]。本研究識(shí)別的7 868個(gè)SSR標(biāo)記可為偏關(guān)苜蓿遺傳圖譜構(gòu)建和分子育種提供依據(jù)。

本研究中GO功能分析結(jié)果可知，分子功能顯著差異在作用于糖基鍵的水解酶活性、蛋白質(zhì)異二聚化活性、O-糖基化合物水解酶活性等；細(xì)胞組分顯著差異在細(xì)胞質(zhì)囊、微管、DNA蛋白復(fù)合物等；生物學(xué)過(guò)程顯著差異在DNA包裝、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體亞基結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象變化等。說(shuō)明偏關(guān)苜蓿通過(guò)復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)響應(yīng)干旱脅迫。白雪梅[39]對(duì)紫花苜蓿的研究結(jié)果表明，蛋白激酶基因是紫花苜蓿在響應(yīng)干旱脅迫中的關(guān)鍵信號(hào)傳遞體，參與磷酸化和去磷酸化，在抗旱中起關(guān)鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與干旱組在過(guò)氧化物酶活性、抗氧化酶活性和蛋白磷酸酶活性相關(guān)基因功能有顯著差異。其中，抗氧化酶和過(guò)氧化物酶的基因差異性表達(dá)可以反映偏關(guān)苜蓿對(duì)干旱的分子響應(yīng)，抵抗活性氧誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。另外，有研究表明，蛋白磷酸酶活性相關(guān)基因參與了草地早熟禾對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)[40]。

KEGG分析發(fā)現(xiàn)，本研究中偏關(guān)苜蓿差異表達(dá)基因顯著富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與淀粉和蔗糖代謝通路，這表明植物感受干旱信號(hào)后會(huì)將信號(hào)傳遞給相關(guān)細(xì)胞器來(lái)引起抗旱基因表達(dá)，使淀粉和蔗糖代謝相關(guān)途徑向有利于滲透調(diào)節(jié)的方向激活或抑制。一般而言,Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)、植物激素信號(hào)、蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)重要的信號(hào)傳遞體[41]，在本研究得到的差異表達(dá)基因中均有注釋。淀粉和蔗糖代謝能夠影響植物的生長(zhǎng)及其脅迫響應(yīng)，這表明偏關(guān)苜蓿受到干旱脅迫后通過(guò)形成一些糖類小分子化合物來(lái)進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)[42]，其原理是干旱脅迫下淀粉和蔗糖可以降解為易溶于水的葡萄糖，同等條件下單糖溶液滲透壓大于雙糖和多糖溶液，從而避免植物細(xì)胞損失更多的水分[43]。

能夠顯著響應(yīng)干旱脅迫的基因可以作為苜蓿處在逆境時(shí)分子水平的應(yīng)答特征，同時(shí)具有提高苜蓿耐旱和抗旱的潛質(zhì)。本研究中干旱脅迫下偏關(guān)苜蓿蔗糖合成酶基因的下調(diào)以及淀粉水解酶基因的上調(diào)表達(dá)，一方面可以為植物響應(yīng)干旱脅迫提供更直接的能量，另一方面可以防止細(xì)胞內(nèi)滲透壓下降造成的失水。JACOBSEN等[44]研究也發(fā)現(xiàn)，隨著葉片水勢(shì)下降，大麥幼苗葉片淀粉酶活性增加。WANG等[45]對(duì)茶樹(shù)在干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因在黃酮類生物合成和苯丙烷類生物合成途徑大量富集。本研究中差異表達(dá)基因在苯丙烷生物合成中顯著富集，其中苯丙氨酸酶基因上調(diào)表達(dá)，表明了與苯丙烷生物合成途徑相關(guān)的關(guān)鍵基因在偏關(guān)苜蓿響應(yīng)干旱脅迫中起重要作用。類胡蘿卜素相關(guān)基因表達(dá)的差異也是苜蓿品種抗旱差異的重要原因之一[16]。相關(guān)上述研究的差異表達(dá)基因有助于提高耐旱性，可作為與偏關(guān)苜蓿干旱脅迫相關(guān)的潛在抗旱基因。

植物處于干旱脅迫時(shí)轉(zhuǎn)錄因子起不可或缺的作用，本研究中bHLH、WRKY、ERFs和MYB家族基因在偏關(guān)苜蓿響應(yīng)干旱脅迫過(guò)程意義重大。通常認(rèn)為，WRKY、bHLH、NAC等轉(zhuǎn)錄因子家族與干旱脅迫有關(guān)[15]。MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)干旱脅迫有負(fù)調(diào)控作用[46]，干旱脅迫誘導(dǎo)NAC轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)[47]。LIU等[48]采用PEG脅迫小麥1、6 h后取葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，差異基因主要富集到FAR1、NAC、bZIP、bHLH、AP2/ERF、WRKY、Myb-related和Myb轉(zhuǎn)錄因子家族。對(duì)杜梨干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，數(shù)目最大的轉(zhuǎn)錄因子家族是MYB，有72個(gè)MYB基因差異表達(dá)，其次是bHLH，有57個(gè)bHLH基因響應(yīng)干旱脅迫，45個(gè)WRKY基因在干旱的誘導(dǎo)下差異表達(dá)，39個(gè)NAC基因、15個(gè)HSF基因在干旱條件下差異表達(dá)[49]。對(duì)不抗旱香蕉品種和抗旱香蕉品種進(jìn)行干旱脅迫后取樣測(cè)序，結(jié)果表明，與香蕉干旱脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子大多是MYB、NAC、WRKY、bHLH、bZIP、ERF和HSFs轉(zhuǎn)錄因子家族的成員[50]。

植物復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)可以使其迅速地感知外界環(huán)境變化，調(diào)控基因的表達(dá)，從而形成應(yīng)對(duì)干旱脅迫的多種機(jī)制。WANG等[51]研究了過(guò)表達(dá)葡萄V vbHLH 1擬南芥與非轉(zhuǎn)基因擬南芥在干旱脅迫下的差異性，結(jié)果表明，VvbHLH 1的過(guò)表達(dá)增加了植株中SOD和POD的活性，H2O2和丙二醛含量顯著下降；與脯氨酸生物合成、黃酮生物合成和抗氧化酶相關(guān)的基因上調(diào)。這說(shuō)明VvbHLH 1通過(guò)提高抗氧化酶活性和增加黃酮類化合物的積累增強(qiáng)了擬南芥對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)能力。在本研究中也發(fā)現(xiàn)，黃酮和黃酮醇的生物合成相關(guān)基因和抗氧化相關(guān)基因顯著表達(dá)，并且挖掘出bHLH轉(zhuǎn)錄因子，這表明在偏關(guān)苜蓿中可能也存在類似的抗旱過(guò)程。有研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下過(guò)表達(dá)甘薯IbWRKY 2的擬南芥中SOD活性較高，并且MDA和H2O2的含量較低，與脫落酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、抗氧化酶和脯氨酸生物合成有關(guān)的基因差異顯著[52]。這表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有提高轉(zhuǎn)基因擬南芥耐旱性的作用，本研究中偏關(guān)苜蓿的WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有提高苜?？购敌缘臐摿?。有研究表明，苯丙烷類代謝主要受MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的調(diào)控[53]；在本研究中也發(fā)現(xiàn)，苯丙烷生物合成以及黃酮和黃酮醇的生物合成途徑相關(guān)基因顯著表達(dá)，所挖掘的偏關(guān)苜蓿bHLH及MYB轉(zhuǎn)錄因子可能通過(guò)調(diào)控保護(hù)酶活性相關(guān)基因和注釋到上述代謝通路的基因來(lái)提高抗旱性?；谄P(guān)苜蓿響應(yīng)干旱脅迫的差異表達(dá)基因，根據(jù)功能注釋結(jié)果可知，偏關(guān)苜蓿可能通過(guò)調(diào)控抗氧化活性和酶調(diào)節(jié)活性相關(guān)的基因以及bHLH等轉(zhuǎn)錄因子，使SOD、POD、CAT及APX酶活性上升，減少干旱脅迫造成的損傷。本研究中受干旱脅迫誘導(dǎo)而表達(dá)的基因，可在今后苜蓿耐旱育種中作進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究以偏關(guān)苜蓿為材料，以正常條件和干旱脅迫下的偏關(guān)苜蓿葉片進(jìn)行保護(hù)酶活性測(cè)定和轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明，偏關(guān)苜?？梢酝ㄟ^(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶活性來(lái)響應(yīng)干旱脅迫，轉(zhuǎn)錄水平上總共獲得56 911條基因序列，識(shí)別出7 868個(gè)SSR位點(diǎn)。通過(guò)差異表達(dá)基因的分析得出，Unigene12274_All、Unigene10105_All、Unigene35365_All、CL7158.Contig1_All、CL 11234.Contig1_All、CL 12445.Con tig1_All、Unigene12274_All、CL 4041.Contig1_All以及bHLH 35、ERF25、PCF7和RF2b可作為偏關(guān)苜蓿潛在抗旱基因，為后續(xù)苜?？购捣肿訖C(jī)制研究提供理論依據(jù)。