王小瑩，李秀梅，王秀敏，劉魏魏，楊 娟，田 薇，周煒煒，戴小楓

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術重點實驗室，北京 100081；2.天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

近年來隨著養(yǎng)雞業(yè)的快速發(fā)展，雞場逐漸規(guī)模化和標準化，但在飼養(yǎng)管理、消毒衛(wèi)生、傳染病防治等方面仍存在各種問題[1]，易造成雞腹瀉等疾病的發(fā)生與蔓延[2-3]。雞常見的腹瀉類型包括中毒性腹瀉、細菌性腹瀉、病毒性腹瀉、寄生蟲性腹瀉、代謝性腹瀉和營養(yǎng)性腹瀉等[4-5]。雖然抗生素可防治雞群腹瀉，改善飼料利用率，促進雞的生長[6-7]，但由于抗生素的過度使用和濫用，細菌極易產(chǎn)生耐藥性，從而導致“超級細菌”產(chǎn)生[8]，嚴重危害人類和動物的健康。為避免這些情況的發(fā)生，2020年7月，中國正式禁止飼料生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)含有促生長類藥物(除中藥外)添加劑的商品飼料。“禁抗令”的施行推動了綠色安全替代產(chǎn)品的開發(fā)[9]。此外，中藥具有毒副作用低、無耐藥性、功能多樣、抗腹瀉效果等優(yōu)點[10-12]。因此，從中藥復方中尋找一種可替代抗生素治療雞腹瀉的方法成為研究者關注的焦點[13]。

白龍散是由白頭翁(20 g)、龍膽(10 g)、黃連(10 g)3種中藥組合而成的復方[14]，據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》[15]記載，白頭翁為毛茛科植物白頭翁(PulsatillachinensisBge.)的干燥根，其味苦性寒[16]，歸胃、大腸經(jīng)，有清熱解毒、涼血止痢的功效，臨床上用于治療熱毒血痢、陰癢帶下；黃連為毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch.)、三角葉黃連(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)或云連(CoptisteetaWall.)的干燥根莖，其味苦性寒，歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)，功效為清熱燥濕、瀉火解毒；龍膽為龍膽科植物條葉龍膽(GentianamanshuricaKitag.)、龍膽(GentianascabraBge.)、三花龍膽(GentianatrifloraPall.)或堅龍膽(GentianarigescensFranch.)的干燥根和根莖，其味苦性寒，歸肝、膽經(jīng)，有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效。白龍散可通過抑制大腸桿菌、志賀氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌[17]等的生長達到治療雛雞白痢[18]、仔豬黃痢[19]、羔羊痢疾[20]的目的。但白龍散作為中藥復方，其藥物組成較多，有效成分復雜，作用靶點多，作用機制尚不明確。本研究擬通過網(wǎng)絡藥理學方法揭示中藥復方白龍散治療雞腹瀉的潛在分子機制，從而為白龍散的實際應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 白龍散活性成分-靶點網(wǎng)絡圖的構建

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(https:∥old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)篩選白龍散(白頭翁、龍膽、黃連)的所有化學成分，篩選閾值設定為口服生物利用度(OB,oral bioavailability)≥30%及類藥性(DL,drug-like index)≥0.18，利用所篩選的活性成分收集對應的潛在作用靶點，將所有潛在作用靶點導入Uniprot數(shù)據(jù)庫(https:∥www.uniprot.org/)中進行標準化處理并設置物種為“Gallusgallus”，查詢得到基因簡稱，利用Cytoscape_3.8.0軟件構建白龍散活性成分-潛在作用靶點網(wǎng)絡圖。

1.2 白龍散治療雞腹瀉的關鍵靶點蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡圖的構建

利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https:∥www.genecards.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(https:∥omim.org/)以“Gallusdiarrhea”為關鍵詞搜索疾病靶點數(shù)據(jù)集，獲取雞腹瀉相關的基因，將2個數(shù)據(jù)庫得到的基因合并去重后得到雞腹瀉的相關靶點。使用Venny 2.1軟件(https:∥bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲取白龍散藥物靶點和雞腹瀉疾病靶點的交集，運用Cytoscape_3.8.0軟件構建白龍散-活性成分-靶點和雞腹瀉疾病-靶點的可視化網(wǎng)絡圖。將交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫(https:∥www.string-db.org/)中，設置物種為“Gallus”，置信度≥0.04，獲取相應的蛋白相互作用信息，并對關鍵靶點蛋白進行分析。

1.3 GO功能注釋及KEGG通路富集分析

將白龍散作用于雞腹瀉的關鍵靶點蛋白上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫(https:∥david.ncifcrf.gov/tools.jsp)進行功能注釋和富集分析，以探討其治療雞腹瀉的作用靶點和信號通路。

2 結(jié) 果

2.1 白龍散活性成分-靶點網(wǎng)絡圖的構建

通過TCMSP共篩選得到168個活性成分，其中白頭翁57個，龍膽63個，黃連48個。根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18篩選標準后，共得到27個活性成分，其中白頭翁9個，龍膽8個，黃連10個，檢索27個活性成分篩選去重后共獲得57個潛在作用靶點。利用Cytoscape_3.8.0軟件構建并分析白龍散活性成分-靶點網(wǎng)絡圖(圖1)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)連接度較高的有黃連中的槲皮素(40)，龍膽中的山奈酚(15)、白頭翁中的異鼠李素(12)，還有Beta-谷固醇(10)、金魚草素(7)、豆固醇(7)、R型氫化小檗堿(7)等(表1)。

三角代表中藥，黃色、紅色、藍色的菱形代表白頭翁、黃連、龍膽的活性成分，橢圓形代表白龍散潛在作用靶點。圖3同Triangle represents the traditional Chinese medicine,the yellow,red and blue diamonds represent the active ingredients of Pulsatillae Radix,Coptidis Rhizoma and Gentianae Radix et Rhizoma,and the ellipse represents the potential target of Bailongsan.The same as fig.3圖1 白龍散活性成分-靶點網(wǎng)絡圖Fig.1 Active ingredients-target network of Bailongsan

表1 白龍散的主要活性成分

續(xù)表

2.2 白龍散治療雞腹瀉的關鍵靶點PPI網(wǎng)絡圖的構建

通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫分別檢索得到4 060和413個雞腹瀉的相關基因，去重后共得到4 207個疾病靶點。venn分析得到45個交集靶點(圖2)，利用Cytoscape_3.8.0軟件構建白龍散-活性成分-靶點和雞腹瀉疾病-靶點的可視化網(wǎng)絡圖(圖3)。將45個交集靶點導入STRING軟件平臺后得到PPI網(wǎng)絡圖后利用Cytoscape_3.8.0軟件進行可視化(圖4)。根據(jù)Degree值列舉白龍散治療雞腹瀉的靶點，結(jié)果見表2。由表2可知，白龍散藥物靶點與雞腹瀉靶點中轉(zhuǎn)錄因子AP-1(transcription factor AP-1,JUN)、原癌基因蛋白質(zhì)類C(Myc proto-oncogene protein，MYC)、雌激素受體1(estrogen receptor 1，ESR1)、B細胞淋巴瘤2家族蛋白1(Bcl-2-like protein 1，BCL2L1)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、G1/S-specific周期蛋白D1(G1/S-specific cyclin-D1，CCND1)等互作的頻率較大。

2.3 GO功能和KEGG通路富集分析

通過DAVID在線數(shù)據(jù)庫對關鍵靶點蛋白進行GO功能富集分析，確定了112條GO條目，其中生物過程主要涉及細胞增殖、正調(diào)控IL-12的產(chǎn)生、蛋白水解作用、對病毒的防御反應、消化道形態(tài)發(fā)生、炎癥反應等76個；細胞組分主要涉及到胞質(zhì)、細胞核、核染色質(zhì)等13個； 分子功能主要涉及類固醇綁定、甾類激素綁定、雌激素受體的活動、DNA結(jié)合、蛋白結(jié)合等23個(圖5)。KEGG通路分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，主要涉及細胞因子-細胞因子受體相互作用、腫瘤抑制蛋白(tumor suppressor gene，p53)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等22條信號通路(圖6)。綜合比較分析發(fā)現(xiàn)，白龍散中有效化學成分可作用于核染色質(zhì)和細胞質(zhì)中炎癥反應、類固醇綁定、甾類激素綁定等多個生物過程和細胞因子-細胞因子受體相互作用、p53信號通路、MAPK信號通路等多條信號通路，達到治療雞腹瀉的目的。

圖2 白龍散與雞腹瀉交集靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of intersection targets of Bailongsan and chicken diarrhea

圖3 白龍散活性成分-靶點和雞腹瀉疾病-靶點網(wǎng)絡圖Fig.3 Network diagram of Bailongsan active ingredients-targets and chichen diarrhea disease-targets

依據(jù)度值作圖，度值越大，靶點的面積越大According to the degree,the larger the degree value,the larger the target area圖4 白龍散治療雞腹瀉關鍵靶點的PPI網(wǎng)絡圖Fig.4 PPI network of key targets of Bailongsan in treatment of chicken diarrhea

表2 白龍散治療雞腹瀉STRING網(wǎng)絡關鍵靶點

3 討 論

雞腹瀉作為養(yǎng)雞場常見的群發(fā)性疾病在全國各地養(yǎng)雞場廣泛發(fā)生，已成為疾病防治中的重點研究對象之一，同時造成雞腹瀉的原因較多，為該病的防治帶來許多困難[21]。白龍散由白頭翁、黃連和龍膽3味中藥組成，其功效為清熱燥濕、涼血止痢，可用于治療濕熱瀉痢、熱毒血痢[22]，可見其在治療熱瀉、痢疾方面有良好的作用。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法，利用OB和DL值篩選得到白龍散中27個活性成分。金魚草素、異鼠李素、槲皮素、異牡荊素、日當藥黃素、山奈酚等黃酮類化合物能顯著提高動物生產(chǎn)性能和機體抗病力,并改善動物機體免疫機能[23]；其中，槲皮素具有抗炎活性，可通過改變腹腔毛細血管和腸黏膜的通透性，減少腸道水分和電解質(zhì)的分泌，以達到治療腹瀉的目的[24]。小檗堿、小檗紅堿、表小檗堿、R型氫化小檗堿、小檗浸堿、黃連堿、巴馬汀、甲基黃連堿等生物堿類化合物具有抗菌、抗病毒作用[25]；其中，小檗堿具有抗菌消炎、調(diào)節(jié)機體免疫、修復腸道屏障等作用[26]；巴馬汀能減少腸道炎癥[27]。導致雞腹瀉的部分原因是機體感染病毒或細菌，而具有抗菌、抗病毒等作用的活性成分能抑制微生物生長，從而有效治療腹瀉。β-谷甾醇、豆固醇、谷甾醇等甾體類化合物具有良好的抗炎活性[28]。龍膽中的芝麻素屬于脂素類化合物，具有抗氧化、抗炎、調(diào)脂、保護肝腎及心血管系統(tǒng)、抗腫瘤等作用[29]。雞腹瀉會引起炎癥反應，具有良好的抗炎活性能緩解機體炎癥，從而改善雞腹瀉?？梢?，白龍散有效成分主要是通過抗炎、抗菌等作用來達到改善雞腹瀉的目的。

PPI網(wǎng)絡結(jié)果表明JUN、MYC、ESR1、IL-6、前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2)等是治療雞腹瀉的關鍵靶點。JUN是哺乳動物二聚體轉(zhuǎn)錄因子AP-1亞基之一，AP-1是位于JNK下游的關鍵信號蛋白分子，與炎癥反應密切相關[30]。MYC是MYC原癌基因蛋白，與炎癥組織損傷和修復方面有關[31]。ESR1是雌激素受體，有研究報道ESR1可與NF-κB間以細胞類型特異性的方式發(fā)生相互抑制[32]，降低NF-κB的DNA結(jié)合活性，抑制NF-κB介導的IL-6啟動子的轉(zhuǎn)錄，并取代啟動子中的RELA/p65和相關的輔助調(diào)節(jié)因子[33]。IL-6在免疫、組織再生和代謝方面具有廣泛生物學功能[34]，其表達水平在感染、創(chuàng)傷或損傷后迅速上升，導致炎癥反應[35]。PTGS2是前列腺素生物合成途徑中的雙環(huán)氧合酶和過氧化物酶，在各種細胞中可被促炎細胞因子、腫瘤促進劑、有絲分裂原和生長因子等高度誘導，從而參與炎癥反應、細胞增殖和凋亡等多種病理過程[36]。綜上，JUN、MYC、ESR1、IL-6、PTGS2等靶點與炎癥反應有關，這表明白龍散可能會通過作用于炎癥相關的靶點來治療雞腹瀉。

圖5 白龍散治療雞腹瀉的關鍵靶點的GO功能富集分析Fig.5 GO functional enrichment analysis of key targets of Bailongsan in the treatment of chicken diarrhea

圖6 白龍散-雞腹瀉關鍵靶點基因KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of key targets of Bailongsan in treatment of chicken diarrhea

GO功能和KEGG通路富集分析結(jié)果表明，白龍散治療雞腹瀉涉及多條生物學過程和信號通路，根據(jù)P值得到細胞因子-細胞因子受體相互作用、p53信號通路、MAPK信號通路等主要信號通路。細胞因子是細胞間重要的調(diào)節(jié)因子和細胞動員因子，參與先天和適應性炎癥宿主防御、細胞生長、分化、死亡及恢復穩(wěn)態(tài)的發(fā)育和修復過程[37]。有研究報道,雞感染禽致病性大腸埃希菌后，IL-8、IL-1β、CCL19等基因表達量上升，參與細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路中的炎癥反應[38]。 p53作為腫瘤抑制基因與炎癥的主要調(diào)節(jié)因子NF-κB相互負調(diào)控，且p53信號通路可通過p53負調(diào)控NF-κB、TLR-4及TRAF6基因的表達，從而抑制NF-κB信號通路的活化[39-40]。MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑可以介導單核細胞、內(nèi)皮細胞和中性粒細胞等免疫細胞p38的激活，從而引起炎性反應[41]。上述信號通路與炎癥反應相關，進一步證明了白龍散可能是通過參與炎癥反應相關的信號通路來治療雞腹瀉。

4 結(jié) 論

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選得到白龍散中3味中藥活性成分的潛在作用靶點，利用STRING和Cytoscape軟件、在線維恩圖、DAVID數(shù)據(jù)庫構建白龍散與腹瀉的靶點的相互作用網(wǎng)絡圖，預測了關鍵靶點和通路，對中藥復方白龍散治療雞腹瀉進行了網(wǎng)絡分析。白龍散治療雞腹瀉的分子機制可能主要通過槲皮素、山奈酚、異鼠李素等調(diào)控JUN、MYC、ESR1、IL-6等靶點，經(jīng)由細胞因子-細胞因子受體相互作用、p53信號通路、MAPK信號通路等信號通路來實現(xiàn)。但由于中藥成分復雜，雞腹瀉病因尚未知，白龍散治療雞腹瀉的實際作用靶點和信號通路有待進一步試驗驗證。