張云波，顧申紅，陳菊明，吳華珺

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570102)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是目前全球發(fā)病率較高的心血管疾病之一。隨著血管再通技術(shù)的不斷發(fā)展和普及，AMI整體預(yù)后情況較以往得到明顯改善，但心肌再灌注損傷(Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)加重了心肌組織損傷，是AMI死亡的重要原因[1-3]。減輕MIRI、有效保護(hù)心肌細(xì)胞是目前AMI治療的重點(diǎn)。四逆湯是我國經(jīng)典中藥方，具有溫中祛寒、回陽救逆的功效。劉耀武[4]研究發(fā)現(xiàn)，四逆湯聯(lián)合尿激酶溶栓能有效減輕AMI患者心肌缺血再灌注損傷，且安全性較好。尹翠翠等[5]通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，四逆湯能有效清除自由基，減輕缺血對心肌組織造成的損傷。以上研究均證實(shí)，四逆湯能減輕缺血以及MIRI對心肌細(xì)胞造成的損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。本研究意在驗(yàn)證四逆湯是否通過抑制人RAS同源基因家族成員A(Ras homolog gene family member，ARhoA)/Rho激酶(Rho-associated protein kinase,ROCK)信號通路，調(diào)控細(xì)胞凋亡，減輕心肌組織損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：60只SPF級健康雄性清潔級大鼠購自江蘇艾菱菲生物科技有限公司，平均體重(250±10)g，飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)內(nèi)，平均溫度(22±2)℃，濕度40%～70%，光照節(jié)律12L/12D。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：RhoA一抗、ROCK1一抗、ROCK2一抗均購自英國Abcam公司(批號bs-1180R、SC-5560、BA0610)，髓過氧化物酶(Myelopexoxidase,MPO)、超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所(批號20161224、20161217、20160607)，臺盼藍(lán)劑購自長沙裕豐化玻器械公司(批號20190715)，BCA蛋白濃度檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒均購自碧云天生物試劑公司(批號20180607、20180524)，Tris購自北京Topbio公司(批號20170513)，鼠單克隆抗體β-Actin、兔抗鼠Bcl-2、兔抗鼠Bax均購自Santa Cruz公司(批號20180709、20181213、20191116)，氟伐他汀膠囊購自瀚暉制藥公司(國藥準(zhǔn)字H20070167)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：小動物呼吸機(jī)(型號HX-100E，成都泰盟科技公司)，自動石蠟切片機(jī)(型號2050，德國Leica公司)，切片烘干機(jī)(型號HI1220，德國Leica公司)，高速冷凍離心機(jī)(型號3-18K，德國Sigma公司)，電泳儀(型號PowerPac Basic，美國Bio RAD公司)，凝膠成像分析儀(型號JS-860B，美國GRANT公司)，酶標(biāo)儀(型號Mutiskan Go，美國Thermo Fisher公司)，紫外線可見光分光光度計(型號WFZ UZ-2000，上海尤尼柯儀器公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 四逆湯：附子10 g，干姜、甘草各6 g，將以上中藥加水煎煮并濃縮湯藥至濃度4.3 g/ml，4 ℃低溫保存。

1.2.2 建模、分組與給藥：將60只大鼠隨機(jī)分為空白對照組、再灌注損傷組、陽性對照組、四逆湯組，每組10只。再灌注損傷組、陽性對照組、四逆湯組采用LAD法建模，空白對照組大鼠只做穿線處理。模型建立成功標(biāo)志：結(jié)扎前，大鼠心電圖平穩(wěn)，結(jié)扎缺血30 min與再灌注120 min時，心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段有明顯抬高，肉眼可見心肌缺血癥狀，與缺血時段比較，大鼠心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段下降>50%。采用LAD結(jié)扎法建立MIRI大鼠模型，空白對照組大鼠僅穿線，不結(jié)扎冠狀動脈，術(shù)后0.9%氯化鈉溶液10 ml/(kg·d)灌腸2周。再灌注損傷組建模后予0.9%氯化鈉溶液10 ml/(kg·d)灌腸2周。四逆湯劑量參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》人鼠等劑量換算，按照人體體表面積的0.018倍計算得出藥物最佳使用劑量為13 g/(kg·d)，四逆湯組大鼠建模后予四逆湯13 g/(kg·d)灌腸2周。陽性對照組大鼠建模后氟伐他汀用量按照70 kg成人劑量換算，大鼠氟伐他汀1 d用量為4 mg/kg，灌腸2周。

1.2.3 血液酶學(xué)指標(biāo)檢測：干預(yù)2周后，采集各組大鼠全血3 ml，低溫高速離心機(jī)1200 r/min，離心10 min，留取血漿，-70 ℃冰箱保存待用。分別檢測血漿髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)以及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平，按照試劑盒相關(guān)步驟進(jìn)行操作。

1.2.4 TTC染色觀察心肌梗死面積：經(jīng)股靜脈注入2 ml的0.6%臺盼蘭，處死大鼠，取出心臟，去除心臟黏膜與附屬結(jié)構(gòu)，去除心耳與右心室，置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存30 min后取出，將心臟制作為1 mm切片，灌注區(qū)著藍(lán)色，非灌流區(qū)不著色，即缺血危險區(qū)(Area at risk,AAR)。分離AAR并將其置于1%的TTC溶液，4%多聚甲醛固定，顯微鏡下分離AAR中的梗死區(qū)(Infarction area,IS)，計算IS與AAR比值(IS/AAR)。

1.2.5 HE染色法觀察大鼠心肌組織：4%多聚甲醛固定心尖組織、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟與復(fù)水、HE蘇木素染色、切片。光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織形態(tài)。

1.2.6 免疫印跡法檢測RohA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)水平：研磨大鼠心肌組織，加入Lysis buffer溶液，裂解心肌組織，6953×g將組織勻漿離心10 min，BCA法檢測RohA、ROCK1、ROCK2蛋白濃度。SDS-PAGE蛋白電泳，硝酸纖維素膜在轉(zhuǎn)移緩沖液內(nèi)處理25 min，拆除凝膠夾層，棄濃縮膠，將分離膠浸至轉(zhuǎn)移緩沖液，制作轉(zhuǎn)印夾層并將其放置于電轉(zhuǎn)膜槽內(nèi)，200 mA恒流電轉(zhuǎn)90～120 min，1×麗春紅染色，PBST沖洗，按蛋白分子量大小剪下相應(yīng)目的條帶并將其放入5%脫脂奶粉，搖床室溫振蕩封閉1 h。硝酸纖維素膜5%封閉液稀釋的特異性一抗(RhoA 1∶2000，ROCK1 1∶500，ROCK2 1∶1000，Bcl-2 1∶1000，Bax 1∶500，β-actin 1∶1000，GAPHD 1∶4000)孵育，4 ℃過夜，硝酸纖維素膜用5%封閉液稀釋的山羊抗兔(1∶3000)、山羊抗小鼠(1∶5000)二抗室溫孵育2 h，棄二抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)液與膜孵育3 min，放入X-光片夾內(nèi)，暗室內(nèi)壓曝光。Quantity One軟件掃描，以β-actin為內(nèi)參，計算RohA、ROCK1、ROCK2蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血液酶學(xué)指標(biāo)比較 見表1。與空白對照組比較，再灌注損傷組大鼠血漿MPO、MDA水平均升高，血漿SOD水平下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與再灌注損傷組比較，陽性對照組以及四逆湯組大鼠血漿MPO、MDA水平降低，SOD水平上升，且四逆湯組血漿MPO、MDA水平低于陽性對照組，SOD水平高于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 各組大鼠血液酶學(xué)指標(biāo)比較

2.2 各組大鼠心肌梗死范圍比較 見表2。陽性對照組、四逆湯組大鼠IS、IS/AAR均低于再灌注損傷組，四逆湯組大鼠IS、IS/AAR水平低于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。三組AAR比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠心肌梗死范圍比較

2.3 各組大鼠心肌病理學(xué)改變 見圖1?？瞻讓φ战M大鼠心肌纖維排列整齊，未見間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤、出血、水腫及纖維組織增生改變；再灌注損傷組可見大鼠心肌纖維斷裂，灶狀壞死，間質(zhì)有炎癥細(xì)胞浸潤及出血灶；陽性對照組心肌病變較再灌注損傷組略有減輕，心肌纖維呈波浪狀改變及空泡變性，間質(zhì)少量炎癥細(xì)胞浸潤；四逆湯組大鼠部分心肌呈波浪狀，間質(zhì)見少量炎癥細(xì)胞浸潤，輕度水腫。

A：空白對照組；B：再灌注損傷組；C：陽性對照組；D：四逆湯組

2.4 各組大鼠心肌組織RohA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)比較 見表3(圖2)。與空白對照組比較，再灌注損傷組RohA、ROCK1、ROCK2蛋白相對表達(dá)量均升高；與再灌注損傷組比較，陽性對照組和四逆湯組RohA、ROCK1、ROCK2蛋白相對表達(dá)量均下降，且四逆湯組以上蛋白相對表達(dá)量均低于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠心肌組織RohA、ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)比較

圖2 各組大鼠心肌組織ROCK2、ROCK1、RohA蛋白電泳圖

2.5 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較 見表4(圖3)。與空白對照組比較，再灌注損傷組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量降低，Bax蛋白相對表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與再灌注損傷組比較，陽性對照組和四逆湯組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量升高，Bax蛋白相對表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。四逆湯組Bcl-2蛋白表達(dá)量高于陽性對照組，Bax蛋白相對表達(dá)量低于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表4 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較

圖3 各組大鼠心肌組織Bcl-2、Bax蛋白電泳圖

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，再灌注損傷可通過增強(qiáng)細(xì)胞通透性導(dǎo)致心功能損傷[6-7]。目前，心肌缺血再灌注損傷已成為AMI患者死亡的主要原因，積極尋找缺血再灌注損傷的治療方法是AMI治療的重點(diǎn)[8-9]。中醫(yī)將MIRI歸屬于“胸痹”范疇，中醫(yī)認(rèn)為MIRI患者心肌缺血時屬于陽虛陰盛，再灌注時陽虛陰盛驟然逆轉(zhuǎn)，形成陰陽格局、陰盛格陽的病機(jī)，MIRI后病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)[10]。四逆湯由附子、干姜、甘草三味中藥組成，其中附子大辛大熱，能破寒祛陰、溫陽壯氣，為方中君藥；干姜可助陽散寒、通脈回陽，為方中臣藥；甘草可補(bǔ)中益氣，緩和干姜與附子的峻烈之氣，調(diào)和藥性，為方中使藥。此方配伍精當(dāng)，能回陽救逆，治療陰虛陽衰證、心腎陽衰寒厥證等具有較好的療效。

本研究結(jié)果說明四逆湯可減輕心肌缺血再灌注損傷，保護(hù)心肌細(xì)胞。既往研究表明，四逆湯可通過多條信號通路參與心肌梗死，保護(hù)心肌組織[11-12]。

MIRI發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多個信號通路及途徑，其中RohA/ROCK是心血管疾病發(fā)病的重要信號通路，心肌缺血時產(chǎn)生的多種細(xì)胞因子可激活RohA/ROCK信號通路，促使肌漿網(wǎng)釋放Ca2+，Ca2+內(nèi)流加劇鈣超載，進(jìn)而損傷心肌細(xì)胞[13]。本研究提示再灌注損傷可激活RohA/ROCK信號通路；與再灌注損傷組比較，陽性對照組及四逆湯組RohA、ROCK1、ROCK2蛋白相對表達(dá)量均降低，且四逆湯組各蛋白相對表達(dá)量均低于陽性對照組，提示四逆湯可能通過抑制RohA/ROCK信號通路發(fā)揮心肌保護(hù)功能。

此外，心肌細(xì)胞凋亡也是MIRI導(dǎo)致心肌損傷的重要因素[14]。Bcl-2具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，Bax基因?qū)儆贐cl-2家族，但其功能與Bcl-2相反，為促凋亡基因[15-17]。本研究檢測大鼠心肌組織Bcl-2、Bax蛋白水平以評價大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，再灌注損傷組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量降低，Bax蛋白相對表達(dá)量升高，提示MIRI可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡；與再灌注損傷組比較，陽性對照組以四逆湯組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量升高，Bax蛋白相對表達(dá)量降低；四逆湯Bcl-2蛋白表達(dá)量高于陽性對照組，Bax蛋白相對表達(dá)量低于陽性對照組，說明四逆湯有抑制心肌細(xì)胞凋亡的功效。

MIRI與氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，MPO是白細(xì)胞酶，可反映中性粒細(xì)胞激活程度，同時反映血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度[18-19]。SOD、MDA活性分別表示氧化與抗氧化能力，SOD活性直接反映機(jī)體自由基消除能力，MDA反映氧自由基的產(chǎn)生與過氧化反應(yīng)程度[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，再灌注損傷組大鼠血漿MPO、MDA水平均升高，血漿SOD水平下降，而陽性對照組以及四逆湯組大鼠血漿MPO、MDA水平均降低，SOD水平上升，且四逆湯組血漿MPO、MDA水平均低于陽性對照組，SOD水平高于陽性對照組，提示四逆湯可減輕抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上，四逆湯通過抑制RhoA/ROCK信號通路活性、抑制細(xì)胞凋亡、減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，有效減輕IR大鼠心肌損傷程度，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。