劉嘉霖，謝慧敏，張崢，楊柏云，羅火林，龔貴如，熊冬金

（南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西 南昌，330031）

大豆（Glycine max(L.) Merr.）含有約40%的蛋白質(zhì)和20%的脂肪，是重要的糧食作物。我國(guó)是大豆的原產(chǎn)地，擁有十分豐富的大豆種質(zhì)資源[1～3]。黃淮海和南方是我國(guó)重要的大豆產(chǎn)區(qū)，與國(guó)內(nèi)其他的大豆生態(tài)區(qū)域種質(zhì)交流頻繁，選育出了大量?jī)?yōu)異的大豆品種[4]。這些育成品種是大豆選育的重要資源，對(duì)大豆遺傳研究具有十分重要的意義。Zhou等[5]和Guo 等[6]利用SSR 標(biāo)記分析大豆種質(zhì)資源，認(rèn)為黃淮海夏大豆的遺傳多樣性最高。蓋鈞鎰等分三個(gè)育種時(shí)期（1923-1995、1995-2005、2005-現(xiàn)在）對(duì)我國(guó)大豆育成品種進(jìn)行了品種收集及系譜分析等工作[7～9]，其中2005 年之前的1200 多個(gè)優(yōu)良品種被廣泛應(yīng)用于我國(guó)大豆生產(chǎn)[10]。研究大豆遺傳多樣性和遺傳基礎(chǔ)，對(duì)大豆育種的親本選配和遺傳改良具有重要指導(dǎo)意義。近年來，分子標(biāo)記和數(shù)量性狀（QTL）定位發(fā)展迅速，在大豆方面，QTL 定位了大豆耐鹽、大豆葉綠素、大豆籽粒大小、脂肪含量[11]、蛋白質(zhì)[12]、產(chǎn)量[13]等性狀。Karikari 等[14]報(bào)道了亞非歐三個(gè)區(qū)域大豆資源的遺傳多樣性，共有21 個(gè)SSR 標(biāo)記與開花天數(shù)和百粒重相關(guān)。Patil 等[15]對(duì)野生、栽培大豆利用連鎖定位技術(shù)鑒定出18個(gè)與蛋白質(zhì)、油脂和蔗糖含量相關(guān)QTL，部分QTL 與大豆馴化相關(guān)基因組位點(diǎn)重合。隨著基因組重測(cè)序和全基因組關(guān)聯(lián)分析的發(fā)展[16,17]，QTL定位數(shù)量激增。利用功能分子標(biāo)記及與產(chǎn)量性狀相關(guān)的功能分子標(biāo)記來研究大豆主要家族的育成品種遺傳基礎(chǔ)報(bào)道較少。本試驗(yàn)選用與QTL相關(guān)SSR標(biāo)記對(duì)來源于中國(guó)黃淮海江蘇的濱海大白花（A034）和銅山天鵝蛋（A231），山東的即墨油豆（A133）三個(gè)祖先親本家族共105份大豆育成品種進(jìn)行遺傳多樣性與群體遺傳結(jié)構(gòu)研究，研究不同時(shí)期群體的遺傳多樣性水平。探索優(yōu)異等位變異在大豆品種選育中的利用途徑及功能基因相關(guān)位點(diǎn)標(biāo)記的遺傳結(jié)構(gòu)，充分了解現(xiàn)有重要祖先親本家族育成品種的遺傳基礎(chǔ)，挖掘利用大豆遺傳多樣性信息，指導(dǎo)育種親本創(chuàng)制和選擇，及品種間的合理布局，提高育種的可預(yù)見性，豐富種質(zhì)遺傳多樣性。

1 材料與方法

1.1 材料

根據(jù)熊冬金等[18]對(duì)我國(guó)1923-2005 年育成的1300 個(gè)大豆的研究信息，選擇12 個(gè)省份105 份中國(guó)黃淮海產(chǎn)區(qū)的大豆育成品種作為試驗(yàn)材料（表1）。其中濱海大白花（A034）和銅山天鵝蛋（A231）是江蘇的祖先親本，即墨油豆（A133）山東祖先親本，105份大豆育成品種名稱及相關(guān)信息詳見首頁(yè)OSID附表。

表1 105份大豆實(shí)驗(yàn)材料Table 1 105 cultivars used in this study

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 選取4～5葉期的大豆葉片，采用改良的CTAB 法[19]提取DNA。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，使用核酸定量?jī)xQubit 2.0測(cè)定濃度與純度，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將DNA 稀釋至20 ng·μL-1，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 QTL 相關(guān)SSR 標(biāo)記引物篩選 根據(jù)http://soybase. org[20]資料查閱已經(jīng)被定位的與產(chǎn)量性狀QTL 緊密連鎖的SSR 標(biāo)記作為功能基因標(biāo)記位點(diǎn)。選擇分布于20 條染色體的99 個(gè)多態(tài)性高、帶型清晰、重復(fù)性好的SSR 標(biāo)記。以上引物序列在http://soybase.org查詢并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)總體系15 μL，含DNA 60 ng，上下游引物0.1 μmol·L-1，Taq 酶1.5 U，dNTPs 0.2 μmol·L-1，MgCl20.12 μmol·L-1，ddH20 補(bǔ)齊反應(yīng)體系。PCR 程序?yàn)椋?4℃3 min；94℃30 s，50～59℃1 min，72℃1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72℃10 min。擴(kuò)增后的PCR 產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，再用銀染顯影后觀察結(jié)果并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 群體遺傳多樣性分析 通過SSR 標(biāo)記的主帶分子量大小，對(duì)105 份供試材料進(jìn)行基因分型并輸入Excel。利用Powermarker V3.25[21]軟件計(jì)算多態(tài)性信息含量（PIC）和基因多樣性（gene diversity）系數(shù)。用Gen Al Ex6.5[22]軟件進(jìn)行標(biāo)記位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性分析，計(jì)算等位變異位點(diǎn)數(shù)（Na）、有效等位變異位點(diǎn)數(shù)（Ne）、Shannon’s 信息指數(shù)（I），并計(jì)算群體的分子方差（AMOVA）估測(cè)遺傳變異在亞群間和亞群內(nèi)的分布。

1.3.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 進(jìn)一步通過Power-Marker 軟件分析各品種之間的遺傳相似性，用非加權(quán)配對(duì)法（UPGMA）進(jìn)行聚類分型，經(jīng)i-TOL[23]軟件轉(zhuǎn)化為聚類無根樹狀圖；用Gen Al Ex6.5 進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PCoA）。利用Structure 2.3.4[24]軟件估算群體的遺傳結(jié)構(gòu)，并計(jì)算材料相應(yīng)Q 值（第I 材料屬于第k 亞群的概率）。根據(jù)structure Harvester（http://taylor0. biology. ucla. edu/structure Harvester/#）確定合適的K值。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物擴(kuò)增多態(tài)性結(jié)果分析

從20 條染色體上選取了99 對(duì)擴(kuò)增效果較好，數(shù)據(jù)缺失少的SSR 引物進(jìn)行分析（圖1），最少的11號(hào)染色體上僅含1個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，最多的4號(hào)、6號(hào)和7號(hào)染色體上含有8 個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，平均每個(gè)染色體上含有4.95 個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)。所有位點(diǎn)都檢測(cè)到等位變異數(shù)，每個(gè)位點(diǎn)的等位變異數(shù)5～24 個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)11.54個(gè)等位變異。每條染色體的等位變異數(shù)9～94個(gè)，平均每條染色體上57.10個(gè)等位變異（表2）。

表2 引物擴(kuò)增多態(tài)性結(jié)果Table 2 Polymorphism result of primers

圖1 QTL相關(guān)的SSR標(biāo)記位點(diǎn)在染色體上的分布Fig.1 Distribution of SSR marker sites on chromosomes

計(jì)算分析每個(gè)位點(diǎn)等位基因頻率，9 號(hào)染色體上Satt326 等位基因頻率最高為0.486，3 號(hào)染色體上Satt009 最低為0.095，平均等位基因頻率0.238。所有的105 個(gè)材料上所有等位位點(diǎn)都是純合基因型，沒有雜合基因型，說明所選大豆材料都是高度純合的育成品種。

2.2 時(shí)期亞群間遺傳多樣性分析

將105 份大豆材料按育成時(shí)期劃分為4 個(gè)亞群，以下簡(jiǎn)稱時(shí)期亞群。由表3 可以看出4 個(gè)時(shí)期亞群和整個(gè)群體的遺傳多樣性，1991-2000 亞群的觀測(cè)等位基因數(shù)（9.121）、Nei's基因多樣性（0.839）、多態(tài)性信息含量（0.820）最高，而2001-2004 亞群的有效等位基因數(shù)（0.6088）最高。1963-1980 亞群的觀測(cè)等位基因數(shù)（6.152）、有效等位基因數(shù)（4.668）、Nei's基因多樣性（0.628）、多態(tài)性信息含量（0.562）都最低。以上結(jié)果說明1991-2000亞群的遺傳多樣性最高，而2001-2004 亞群的材料分布更均勻。1963-1980 亞群的遺傳多樣性最低可能是由樣本數(shù)偏少造成的。

表3 時(shí)期亞群間遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of period populations

2.3 時(shí)期亞群相似性系數(shù)聚類分析與分子方差分析

表4 相似性系數(shù)結(jié)果表明亞群間相似性系數(shù)（GI）≥0.679，亞群間遺傳距離（GD）≤0.387。說明分時(shí)期亞群間的遺傳差異較大。表5 和圖2 可以看出1991-2000 和2001-2004 兩個(gè)亞群的相似性系數(shù)高（GI=0.821），分化小，親緣關(guān)系相近。而1963-1980和1991-2000 兩亞群的遺傳距離較大，親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)（GD=0.387）。分時(shí)期亞群的相似性系數(shù)聚類分析和遺傳多樣性分析結(jié)果相似。但綜合考慮亞群內(nèi)樣本數(shù)目和材料分布等因素的影響，尚不能說明大豆育成品種的基因遺傳多樣性和育種時(shí)間的關(guān)系。

表4 時(shí)期亞群間Nei's遺傳距離與相似性系數(shù)Table 4 Nei's genetic distance and genetic identity between period populations

表5 大豆材料在3個(gè)類群中的分布Table 5 Distribution of populations in 3 groups

圖2 基于Nei's遺傳距離大豆時(shí)期亞群聚類圖Fig.2 Period populations dendrogram of soybeans based on Nei's genetic distance

分子方差分析（AMOVA）分析結(jié)果表明，大豆時(shí)期亞群內(nèi)分子變異占99%，群體間變異占1%，而群體分化系數(shù)Fst=0.013，P=0.010，組間差異顯著。說明亞群間的遺傳差異主要是由于亞群內(nèi)的大豆材料遺傳差異較大造成的。分析大豆材料遺傳差異較大可能與大豆育成品種主要來自3個(gè)不同主要家族，且每個(gè)祖先親本對(duì)該品種的遺傳貢獻(xiàn)值差異造成的。

2.4 大豆材料聚類分析

UPGMA 聚類分析顯示（圖3），在相似系數(shù)D1=0.42 處將105 份大豆材料分為3 個(gè)類群，第Ⅰ類群包含49 份材料，主要來自1991-2000 和2001-2004兩時(shí)期。第Ⅱ類群含有25 份材料，其中17 份大豆材料來自1963-1980、1981-1991 這2 個(gè)相對(duì)較早的時(shí)期。第Ⅲ類群共31份材料，大豆各時(shí)期材料分布相對(duì)均勻。

圖3 105份大豆材料的UPGMA聚類圖Fig.3 UPGMA dendrogram of 105 accessions

從各時(shí)期亞群分布來看，4 個(gè)時(shí)期亞群分散聚集到3 個(gè)類群中，且各亞群有其聚類的偏好性。1991-2000、2001-2004 這兩個(gè)相對(duì)較晚的時(shí)期主要分布于第Ⅰ類群，這兩個(gè)時(shí)期的大豆資源具有一定的遺傳相似性。1963-1980 時(shí)期的大豆材料有50%聚集在第Ⅱ類群，且第Ⅱ類群68%的大豆材料來自1963-1980、1981-1990 這2 個(gè)時(shí)期，說明相對(duì)較早時(shí)期的大豆材料偏向聚集在第Ⅱ類群。1981-1990時(shí)期的大豆均勻分布于第Ⅱ、Ⅲ類群，說明1981-1990時(shí)期的大豆材料遺傳資源集中度相對(duì)較低。

2.5 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

大豆材料的遺傳結(jié)構(gòu)分析表明K 取值范圍為2～9，當(dāng)K=3 時(shí)，△K 最大且較穩(wěn)定（圖4），大豆群體分為3 個(gè)類群（圖5）。分別對(duì)3 個(gè)類群內(nèi)大豆材料統(tǒng)計(jì)（表6），第Ⅰ類群包含44份材料，第Ⅱ類群含有25份材料，第Ⅲ類群共36份材料。群體遺傳結(jié)構(gòu)分布表明，遺傳結(jié)構(gòu)分布與UPGMA 聚類結(jié)果具有高度一致性。有100份大豆材料的結(jié)構(gòu)分布與聚類結(jié)果一致。UPGMA 聚類第Ⅰ類群中4 份四川省大豆材料（貢豆5 號(hào)、貢豆8 號(hào)、貢豆10、貢豆11）和江西省大豆材料贛豆4號(hào)在群體遺傳結(jié)構(gòu)分析中分布在第Ⅲ類群。

圖4 似然對(duì)數(shù)的變化折線圖(ΔK)Fig.4 Line chart of ΔK with change of K value

圖5 105份大豆材料群體遺傳結(jié)構(gòu)Fig.5 Population structure of 105 accessions

表6 大豆材料遺傳結(jié)構(gòu)分布Table 6 Distribution of population structure

2.6 群體主坐標(biāo)分析

分時(shí)期亞群的主坐標(biāo)分析（圖6）表明，第一、二、三主成分分別解釋了4.12%、3.61%和2.90%的總變異。相對(duì)較后時(shí)期（1991-2000 和2001-2004）的材料基本聚集在同一區(qū)域，只有少數(shù)品種在其他區(qū)域，而1963-1980 分布于不同區(qū)域。說明大豆材料具有一定的時(shí)期特征，早期的大豆材料與相對(duì)較后兩時(shí)期的大豆材料有一定的遺傳差異，而這兩時(shí)期的遺傳差異小，親緣關(guān)系較近。

圖6 主坐標(biāo)分析Fig.6 Principal coordinates analysis of subgroups

3 討論

3.1 QTL相關(guān)的SSR位點(diǎn)多態(tài)性分析

大豆種質(zhì)資源研究中不少功能分子標(biāo)記在遺傳變異或多樣性分析中都有廣泛應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)室早期選擇ScoT[25]、EST-SSR[26]等標(biāo)記研究黃淮海和南方地區(qū)大豆的遺傳多樣性，平均位點(diǎn)的等位變異數(shù)為8.81 和4.81。SSR 標(biāo)記與這些功能分子標(biāo)記相比，等位變異數(shù)為11.54，多態(tài)性更高，檢測(cè)更靈敏。此外，熊冬金等[18]也曾用161 個(gè)SSR 分子標(biāo)記對(duì)209份大豆育成品種遺傳多樣性分析，多態(tài)性信息含量平均0.819，低于本研究中的0.836。這一結(jié)果與通常認(rèn)為的樣本越大、標(biāo)記數(shù)量越多則遺傳多樣性越高這一結(jié)論不符。通過比較發(fā)現(xiàn)，本研究中SSR 位點(diǎn)均是與QTL 相關(guān)且基因型豐富的位點(diǎn)，平均等位變異數(shù)11.54。而熊冬金等研究中SSR 位點(diǎn)數(shù)目多，包含與QTL 相關(guān)的SSR 位點(diǎn)141 個(gè)和QTL 無關(guān)的SSR 位點(diǎn)20 個(gè)。QTL 無關(guān)的SSR 位點(diǎn)大多基因型多態(tài)性簡(jiǎn)單，與QTL 相關(guān)位點(diǎn)放一起，平均的等位變異數(shù)11.07，影響整體的遺傳多樣性水平，因此低于本實(shí)驗(yàn)的群體遺傳多樣性。

通過Soybase網(wǎng)站查詢各位點(diǎn)信息，每個(gè)位點(diǎn)皆與幾個(gè)不同QTL 相關(guān)聯(lián)。例如基因型豐富的satt009 位點(diǎn)與大豆產(chǎn)量、開花數(shù)、種子異黃酮、種子硬度等10余個(gè)QTL性狀相關(guān)。在后期馴化培育中，QTL 連鎖區(qū)位點(diǎn)的基因型有自身局限性和連鎖阻力，理應(yīng)遺傳多樣性小。但在育種過程中，育種者極大地保存了位點(diǎn)自身的遺傳多樣性，在探索基因型時(shí)引入新的多樣性，增加品種的低頻多樣性也是長(zhǎng)期受馴化和近交的結(jié)果[27]。

3.2 育成品種大豆資源的遺傳多樣性分析

本研究選擇99 個(gè)QTL 相關(guān)的SSR 標(biāo)記位點(diǎn)，對(duì)105 份大豆育成品種進(jìn)行分時(shí)期亞群的遺傳多樣性分析，Nei's基因多樣性范圍為0.628～0.839，平均0.774。多態(tài)性信息含量0.562～0.820，平均0.742。時(shí)期亞群大豆育成品種遺傳多樣性高低順序?yàn)?991-2000＞2001-2004＞1981-1990＞1963-1980。時(shí)期亞群相似性系數(shù)聚類分析表示，與遺傳多樣性最高的1991-2000時(shí)期的亞群間遺傳距離大小順序?yàn)?963-1980（0.387）＞1981-1990（0.236）＞2001-2004（0.197）。說明1963-1980 與1991-2000 兩時(shí)期的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，而2001-2004 與1991-2000 兩時(shí)期的親緣關(guān)系最近。大豆分時(shí)期亞群的遺傳多樣性呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)與改革開放后我國(guó)從國(guó)外引入大量的大豆材料有關(guān)，我國(guó)大豆育成品種遺傳基礎(chǔ)有所拓寬。而在現(xiàn)有的遺傳基礎(chǔ)上再增加大豆遺傳多樣性，需在今后的育種工作中進(jìn)一步拓寬親本來源。

分子方差分析表明大豆材料99%為亞群內(nèi)變異，僅1%為亞群間變異。亞種群內(nèi)的高變異象征著對(duì)經(jīng)濟(jì)上重要的性狀更頻繁地被選擇，以致各主要家族的祖先親本對(duì)該品種的遺傳貢獻(xiàn)值有所差異。育種親本越復(fù)雜的品種，有多個(gè)主要家族的遺傳貢獻(xiàn)，多態(tài)性位點(diǎn)的等位變異數(shù)增加的幾率越大，品種的遺傳多樣性越高。然而，育成品種所利用的種質(zhì)資源還是相對(duì)較狹窄，一方面種質(zhì)育種不能囊括優(yōu)質(zhì)親本所有的優(yōu)勢(shì)表型，另一方面這與我國(guó)引進(jìn)外來種質(zhì)資源無法滿足育種需求不無關(guān)系。其次大豆材料為高度純合的育成品種也部分影響著遺傳變異結(jié)果。

3.3 育成品種大豆的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

本研究對(duì)3 個(gè)主要家族的105 份大豆材料的聚類分析和遺傳結(jié)構(gòu)分析都認(rèn)為它們明顯分為3 類群，且兩方面的分析結(jié)果高度一致，也與Dong 等[28]利用53 對(duì)SSR 標(biāo)記對(duì)100 份菜豆品種的UPGMA 亞群與結(jié)構(gòu)亞群分析結(jié)果具有高度一致性。這些群體的聚類表現(xiàn)出極大的一致性，與大豆育成品種在主要家族系譜中代數(shù)及各時(shí)期亞群的遺傳基礎(chǔ)粗略相關(guān)。例如類群2 中大豆育成品種在A034、A133和A231 家族系譜中代數(shù)在3 代以前，類群1 中大豆品種則在3 個(gè)主要家族中代數(shù)靠后，主要為4 代以后品種。類群2 在親緣關(guān)系上更貼近3 個(gè)主要家族，而類群1 與3 個(gè)主要家族親緣關(guān)系不如類群2，其他的遺傳背景影響更大。

從各時(shí)期亞群的遺傳基礎(chǔ)來看，且各亞群有其聚類的偏好性，遺傳基礎(chǔ)相似的亞群有聚在同一類群中的趨勢(shì)，例如1991-2000 和2001-2004 兩個(gè)時(shí)期內(nèi)的大豆材料遺傳相似性高，所以主要集中在類群1中，1963-1980和上述兩時(shí)期大豆材料的遺傳相似性低，則偏向于集中在類群2 中。關(guān)于大豆育成品種遺傳組分受到分時(shí)期遺傳基礎(chǔ)影響這一結(jié)論有待明確，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道，但普遍認(rèn)為有生態(tài)區(qū)劃分遺傳基礎(chǔ)[29,30]。

聚類后出現(xiàn)的相同來源的種質(zhì)分別聚類在不同類群中或不同來源的種質(zhì)相聚在同一類群的現(xiàn)象，常見于群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究中[31,32]。這與種質(zhì)的遺傳背景和種質(zhì)間遺傳差異相關(guān)。不同來源的種質(zhì)可能遺傳背景相似，相同來源的種質(zhì)也可能遺傳差異較大。說明大豆育種不能簡(jiǎn)單的異地雜交育種，考慮種質(zhì)間的遺傳相似性才能有效利用大豆種質(zhì)資源。

4 結(jié)論

利用99 個(gè)與大豆QTL 性狀相關(guān)的SSR 位點(diǎn)，對(duì)黃淮海和南方產(chǎn)區(qū)的105份大豆育成品種進(jìn)行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析。按品種育成時(shí)期將群體劃分為4 個(gè)亞群，研究表明不同時(shí)期內(nèi)大豆品種基因交流頻繁，UPGMA 聚類和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析均將105 份材料分為3 個(gè)類群，且結(jié)果高度一致，大豆育成品種遺傳多樣性水平具有一定的時(shí)期特征，總體呈遞增趨勢(shì)。