李玉龍，宗 偉，常素娥，陳思攀

(1.陜西省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 西安 710068；2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，陜西 西安 710004；3.陜西省人民醫(yī)院介入放射科，陜西 西安 710068)

肝細(xì)胞癌是嚴(yán)重威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一，其發(fā)病呈增長趨勢[1-2]。肝癌的發(fā)生是一個復(fù)雜、多階段、涉及多因素的過程，包含原癌基因激活、抑癌基因失活、信號通路異常、腫瘤微環(huán)境改變、腫瘤細(xì)胞發(fā)生代謝重編程、表觀遺傳異常、免疫系統(tǒng)失調(diào)等。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)作為表觀遺傳學(xué)中的重要分子，引起了人們的廣泛關(guān)注。miRNA是一類內(nèi)源性長度約22 nt的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼RNA。肝癌中存在多種miRNA的異常表達(dá)，通過調(diào)控不同靶基因參與腫瘤增殖、遷移、侵襲、凋亡等過程[3]。miRNA可以作為預(yù)測肝癌的生物標(biāo)志物，如miR-221[4]、miR-182[5]、 miR-375和miR-199a-3p[6]等。

miR-195位于17號染色體，在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用，在肝癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)水平低于正常對照[7]。miR-195能夠靶向調(diào)控多種靶基因，如YAP[8]、AEG-1[9]、LATS2[10]等，發(fā)揮抑癌基因作用。在本研究中，我們將探討miR-195對人肝癌Hep3B細(xì)胞增殖及凋亡的影響及其可能涉及的分子機(jī)制，以期為肝癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人肝癌Hep3B細(xì)胞、HEK293細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。Lipofectamine 2000 購自 Invitrogen公司，凋亡試劑盒購自上海七海復(fù)泰生物科技有限公司。小干擾RNA(siRNA)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，其中si-ctrl-S序列為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；si-ctrl-A序列為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’；si-BIRC5-S序列為5’-GAAGAAAGAAUUUGAGGAATT-3’；si-BIRC5-A序列為5’-UUCCUCAAAUUCUUUCUUCTT-3’。報告基因由北京擎科生物科技有限公司合成，其中BIRC5 WT-S序列為5’-CTGCCTGTGCAGCGGGTGCTGCTGC-3’；BIRC5 WT-A序列為5’-TCGAGCAGCAGCACCCGCTGCACAGGCAGAGCT-3’；BIRC5 MT-S序列為5’-CTGCCTGTGCAGCGGGTGCACGAGC-3’；BIRC5 MT-A序列為5’-TCGAGCTCGTGCACCCGCTGCACAGGCAGAGCT-3’。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌Hep3B細(xì)胞及人胚胎腎細(xì)胞HEK293用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將Hep3B細(xì)胞鋪入培養(yǎng)板，24 h后應(yīng)用Lipofectamine 2000 分別轉(zhuǎn)染 miR-195、miR-ctrl、si-BIRC5及si-ctrl至Hep3B細(xì)胞，依次標(biāo)記為miR-195組、miR-ctrl組、si-BIRC5組和si-ctrl組。

1.4 MTT實驗 將Hep3B細(xì)胞鋪入 96 孔培養(yǎng)板，按上述分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后 24、48、72 h分別加入MTT，于37 ℃培養(yǎng)箱放置 4 h，取出后棄去液體加入150 ml DMSO溶解，用酶標(biāo)儀測定 吸光度(OD)值。

1.5 細(xì)胞凋亡實驗 將Hep3B細(xì)胞計數(shù)鋪板，24 h后按照分組處理細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化細(xì)胞，收集于15 ml離心管中，離心后棄上清，PBS沖洗細(xì)胞2～3次。棄去PBS，重新加入Binding Buffer重懸細(xì)胞，用FITC/PI雙染細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.6 雙熒光報告基因?qū)嶒?生物信息軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-195與BIRC5 3’-UTR區(qū)存在可能的結(jié)合位點，根據(jù)結(jié)合位點設(shè)計并合成BIRC5 3’-UTR(正常與突變)序列，構(gòu)建pmirGLO-BIRC5(WT/MT)載體。實驗分為四組：無處理細(xì)胞組(對照組)，miR-195與pmirGLO空載體共轉(zhuǎn)染組，miR-195與pmirGLO-BIRC5-WT共轉(zhuǎn)染組(BIRC5-WT組)，以及miR-195與pmirGLO-BIRC5-MT共轉(zhuǎn)染組(BIRC5-MT組)。將HEK 293細(xì)胞接種于96孔板中，按上述分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后進(jìn)行熒光素報告實驗，檢測各處理組熒光素酶表達(dá)情況。

1.7 生物信息學(xué)分析 應(yīng)用SangerBox數(shù)據(jù)分析平臺(http://sangerbox.com/)分析BIRC5在多種腫瘤中的表達(dá)，應(yīng)用LinkedOmics[11]分析miR-195與BIRC5在肝細(xì)胞癌中的相關(guān)性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-195對肝癌Hep3B細(xì)胞增殖及凋亡的影響 見圖1。MTT實驗發(fā)現(xiàn)，與miR-ctrl組相比，miR-195組Hep3B細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05)。細(xì)胞凋亡實驗發(fā)現(xiàn)，Hep3B細(xì)胞過表達(dá)miR-195后細(xì)胞凋亡比例顯著高于對照組(P<0.05)，表明miR-195可促進(jìn)Hep3B細(xì)胞凋亡。

注：與miR-ctrl組比較，*P<0.05，#P<0.01，△P<0.001

2.2 miR-195靶基因分析 見圖2。應(yīng)用Linked Omics網(wǎng)站分析發(fā)現(xiàn)，miR-195與BIRC5在肝細(xì)胞癌中呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。進(jìn)一步通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測二者靶向關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-195和pmirGLO-BIRC5-WT共轉(zhuǎn)染后與對照組相比熒光活性顯著降低，而miR-195與pmirGLO-BIRC5-MT共轉(zhuǎn)染組與對照組熒光活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明miR-195可靶向作用BIRC5。

左圖為miR-195與BIRC5相關(guān)性分析；右圖為雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果，與對照組比較，#P<0.05

2.3 生物信息分析BIRC5在多種腫瘤中的表達(dá)情況 見圖3。生物信息學(xué)網(wǎng)站SangerBox分析基于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中BIRC5在包含LIHC在內(nèi)的多種腫瘤的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BIRC5在包括肝細(xì)胞癌在內(nèi)的多種腫瘤中顯著高表達(dá)(均P<0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01，△P<0.001

2.4 沉默BIRC5對Hep3B細(xì)胞增殖及凋亡的影響 見圖4。MTT實驗發(fā)現(xiàn)，與si-ctrl組相比，si-BIRC5組細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05)。細(xì)胞凋亡實驗發(fā)現(xiàn)，si-BIRC5組細(xì)胞凋亡比例顯著高于si-ctrl組(P<0.05)，表明沉默BIRC5可促進(jìn)Hep3B細(xì)胞凋亡。

注：與si-ctrl組比較，*P<0.05，#P<0.01，△P<0.001

3 討 論

目前手術(shù)是肝癌根治性治療的主要手段。肝癌早期癥狀不明顯，晚期肝癌患者伴有明顯疼痛感，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[12]，故多數(shù)患者確診時已處于中晚期，基本喪失手術(shù)治療的機(jī)會。盡管仍有多種治療方式如放療、化療、局部消融治療等可供選擇，但現(xiàn)有治療方法療效有限，復(fù)發(fā)率高，易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。近年來，分子靶向治療已成為研究的熱點，引起人們的廣泛關(guān)注，靶向藥物索拉卡菲尼、瑞格非尼、侖伐替尼等已進(jìn)入臨床應(yīng)用。靶向藥物與化療藥物聯(lián)合使用可能會改善患者預(yù)后。有研究[13]發(fā)現(xiàn)索拉非尼聯(lián)合聯(lián)合卡培他濱與單獨使用索拉菲尼相比可改善肝細(xì)胞癌患者預(yù)后。尋找合適的分子靶標(biāo)對肝癌靶向治療有重要意義。

我們通過應(yīng)用LinkedOmics網(wǎng)站分析miR-195與BIRC5在肝細(xì)胞癌中表達(dá)的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者呈顯著負(fù)相關(guān)，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測二者靶向關(guān)系，結(jié)果表明miR-195可靶向作用BIRC5。BIRC5(Survivin)是一種控制細(xì)胞分裂、抑制細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)[14]。它是凋亡抑制蛋白(IAP)家族成員之一，該家族成員結(jié)構(gòu)較相似，都具有桿狀病毒凋亡抑制蛋白重復(fù)序列(BIR)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)可能是半胱天冬酶(Caspase)的結(jié)合區(qū)域，為IAP 發(fā)揮抑制凋亡作用所必需[15]。BIRC5(Survivin)位于17號染色體長臂上，存在一個不含TATA盒的啟動子，啟動子含有3個細(xì)胞周期依賴性元件(CDE)和1個細(xì)胞周期同源結(jié)構(gòu)域(CHR)[16]。BIRC5在成人終末分化組織中一般不表達(dá)或呈低表達(dá)，但在包括乳腺癌、肺癌、宮頸癌等多種腫瘤中廣泛表達(dá)[17-19]。BIRC5能夠抑制Caspase-3活性，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡[20]。BIRC5在腫瘤中高度表達(dá)，在細(xì)胞分裂和細(xì)胞凋亡抑制過程中同時發(fā)揮作用，與腫瘤分級、預(yù)后不良等相關(guān)[21]。已有研究[22]表明BIRC5高表達(dá)與肝癌預(yù)后不良相關(guān)。腫瘤是一類異質(zhì)性疾病，與細(xì)胞異常增殖及細(xì)胞死亡調(diào)控異常密切相關(guān)。參與細(xì)胞凋亡調(diào)控的分子被認(rèn)為是腫瘤治療的潛在靶標(biāo)，而BIRC5作為IAP家族成員，在細(xì)胞周期進(jìn)程和凋亡抑制中發(fā)揮重要作用，其作為腫瘤治療的靶標(biāo)引起人們的廣泛關(guān)注。

基于TCGA及GTEx數(shù)據(jù)庫，我們通過SangerBox數(shù)據(jù)分析平臺分析BIRC5在包括肝癌在內(nèi)的27種腫瘤的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)BIRC5在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤中呈高表達(dá)，提示BIRC5可能在腫瘤中發(fā)揮重要的癌基因作用。我們應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默BIRC5的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，沉默其表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，提示BIRC5在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮癌基因的作用。

綜上所述，miR-195可通過靶向調(diào)控BIRC5抑制肝癌Hep3B細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。BIRC5可作為肝細(xì)胞癌靶向治療的新靶標(biāo)。在后續(xù)研究中，我們將通過挽救實驗、Western blot實驗、體內(nèi)實驗等進(jìn)一步探索miR-195/BIRC5軸在肝癌進(jìn)展中的作用。